植物2,3-氧化鯊烯環化酶的研究進展＊

張 斌，梁苗苗，譚政委，孫俊聰，郭妍宏，薛哲勇＊＊

（1. 東北林業大學生命科學學院/植物天然活性物質的生物合成與利用重點實驗室 哈爾濱 150040；2. 河南省農業科學院芝麻研究中心 鄭州 450002；3. 中國科學院植物研究所 北京 100093）

三萜是一類結構多樣的天然產物，具有抗腫瘤、抗炎、調節免疫等生理活性，也是許多植物中藥的活性成分[1-8]。三萜類化合物都先經歷2,3-氧化鯊烯（2,3-oxidosqualene）環化反應生成三萜骨架，催化這一關鍵步驟-環化反應的酶被稱為2,3-氧化鯊烯環化酶（OSC）。目前從植物中通過分離提取已鑒定到超過120 種三萜骨架，通過酵母、煙草異源表達體系鑒定超過150 種OSCs，但只覆蓋了其中51 種三萜骨架，仍有大量植物三萜類成分的OSCs尚未鑒定[7]。

目前,模式植物擬南芥和水稻中的OSC 已有較全面的研究，已有研究報道了擬南芥基因組中挖掘到13個OSC 基因[9]，異源表達鑒定了多個三萜產物，包括環阿屯醇（cycloartenol），羊毛甾醇（lanosterol），β-香樹素（β-amyrin），marneral，thalianol 以及arabidiol 等[9]。水稻中有12個OSC基因[10]，異源表達分析其產物包括β-香樹素（β-amyrin），帕克醇（parkeol），異喬木萜醇（isoarborinol）等[9]。OSC 酶的功能鑒定主要以釀酒酵母和本氏煙草為異源表達體系，結合GC-MS 或LCMS以及NMR 對代謝產物進行檢測和鑒定?；诰w結構解析、同源建模、定點突變對OSC 的催化機制和活性改造有了深入的研究[11]。隨著測序技術發展，越來越多植物OSCs 將被發掘，以AlphaFold 為代表的AI技術對OSCs 結構進行更精準的預測[12-13]，對催化機制解析和新功能突變體酶的發現有指導意義。

1 植物OSC異源表達體系

1.1 酵母體系異源表達植物OSC

利用酵母體系異源表達植物OSC 具有多種優勢，比如酵母作為生物學研究的模式生物，轉基因操作相對容易，且酵母生長迅速，實驗周期較短，此外，酵母本身能夠產生OSC 的底物—2,3-氧化鯊烯[11]。用羊毛甾醇缺陷型的酵母（Gil77）進行蛋白表達，該酶利用酵母內源的2,3-氧化鯊烯可以合成目的產物，并用薄層層析（TLC）方法分析環化產物。這其中的典型例子是模式植物擬南芥，通過全基因組的分析，擬南芥中共有13個OSCs基因，其中大多數為多功能酶，比較典型的是At4g15370/BARS1/PEN2基因，它編碼baruol 合酶，在酵母異源表達體系中催化產生90%的baruol 及22 種含量極低的副產物[22]。畢赤酵母（Pichia pastoris）在完全培養基YPD 生長，該體系已經被用來成功地分析來自Euphorbia tirucallia的β-香樹素合酶的功能[23]。同樣的酵母體系成功地分析了水稻OsPS和OsISO的功能，并顯示出它們分別能產生的帕克醇和異喬木萜醇三萜化合物[24]。

但酵母作為異源表達植物OSC 體系亦存在不足，密碼子偏好性問題便是其一。Sun 等[14]在研究水稻OsOSC6時發現該基因在水稻多組織表達，但直接克隆轉化到酵母后，并沒有檢測到轉化酵母的產物有改變，之后Sun 等利用基因全合成的方法合成了蛋白序列與OsOSC6一致，而密碼子偏好酵母的SnOsOSC6，克隆轉化酵母后，證實其有能夠合成β-香樹素和α-香樹素。

1.2 煙草體系異源表達植物OSC

近年來利用本氏煙草體系研究OSC 催化功能得到了迅速地發展，煙草體系對于多數植物源OSC 都可以驗證功能，無需密碼子優化，且煙草可內源合成OSC底物——2,3-氧化鯊烯，無需外源添加。

利用該異源表達體系成功鑒定了蘋果（Malus domestica）中一個編碼α-amyrin 為主要產物的不尋常的三萜合酶[16]。隨后，來自蘋果MdOSC4和MdOSC5用本氏煙草瞬時表達表明均是多功能的OSC 酶，MdOSC4合成germanicol，β-香樹素和羽扇豆醇，MdOSC5合成羽扇豆醇和β-香樹素[17]。歐洲山芥（Barbarea Vulgaris）兩個OSC 酶BvLUP2和BvLUP5分別合成羽扇豆醇、α-香樹素和β-香樹素的混合物[18]。本氏煙草體系在研究新的OSC 酶功能方面也得到了驗證，OsONS1催化2,3;22,23-二氧化鯊烯產生αonocerin[19]，與在Gil77 酵母中產物一致。以上研究表明，本氏煙草的瞬時體系在OSC 酶功能鑒定方面和傳統的酵母體系一樣有效，并且更加便捷[9]。

對三萜下游代謝途徑進行解析需組合不同的候選OSC、細胞色素P450酶、糖基轉移酶等，將多個候選基因組合整合到一個載體上費時費力，而煙草體系可以混合不同的農桿菌同時侵染煙草葉片，無需構建多元載體，極大簡化了實驗操作[15]。

2 OSC序列克隆和功能鑒定

最先是從豌豆（Pisum sativum）中純化得到的β-香樹素合酶和環阿屯醇合酶，他們的分子量大小分別是35KD 和55KD[20]，但所獲得的酶量不足以用于氨基酸序列的分析，人們只能測定其首尾序列。用反向遺傳學的方法，可從真菌和動物中獲得羊毛甾醇合酶的cDNA，例如用這種方法已獲得鼠的羊毛甾醇合酶cDNA[21]。將擬南芥的cDNA 轉化到酵母細胞中，經過產物的分析，鑒定了植物中的第一個環阿屯醇合成酶基因[22]。隨后的研究者根據其保守序列，利用PCR 的方法克隆了大量的植物OSC基因。

Kushiro 等利用同源克隆的方法從人參根中克隆出來β-香樹素合酶編碼基因，β-香樹素是重要的中藥活性物質齊墩果烷型人參皂苷的合成前體[23]，隨后在其他雙子葉植物中β-香樹素合酶基因也相繼被克隆出來[24-33]，這是迄今為止發現植物中最大的一類三萜合酶基因（圖1）；在單子葉植物中燕麥和水稻中也克隆到了β-香樹素合酶基因[14,34]，但進化樹分析表明，單子葉和雙子葉植物中的β-香樹素合酶基因進化起源不同。在燕麥中，β-香樹素合酶是燕麥根中積累的抑菌類物質燕麥苷合成途徑中的關鍵酶，它與燕麥苷合成途徑中至少有三個不同功能的基因形成一個基因簇，這種不具有序列同源性、對最終產物有不同作用的基因形成基因簇在植物次生代謝特別是三萜類化合物的形成途徑中的報道越來越多，關于基因簇的形成和調控機制近幾年來也成了研究的熱點[33,37-42]。

植物中另一類重要的OSCs 是羽扇豆醇合酶（lupeol synthases）（圖1）催化2,3-氧化鯊烯環化生成五環三萜羽扇豆醇，最早從橄欖（Olea europaea）和（Taraxacum officinale）中克隆得到[43]；在其他植物白樺樹（Betula platyphylla）、甘草（Glycyrrhiza glabra）、百脈根 （Lotusjaponicus）和木欖（Bruguiera gymnorrhiza）[30,44-45]也相繼克隆到了羽扇豆醇合酶基因，在這些植物中克隆到的羽扇豆醇合酶都是單功能酶，只生成單一的產物羽扇豆醇；同源性在74-81%之間[46]；而在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和蓖麻（Ricinus communis）中克隆到了產物以羽扇豆醇為主并有其他含量較少的副產物的多功能羽扇豆醇合酶[47-51]。迄今為止，大多數植物中的的OSCs 基因是通過同源克隆得到的，總數超過150 個[9]，主要是β-香樹素合酶和羽扇豆醇合酶基因。

圖1 2,3-氧化鯊烯環化酶（OSC）進化分析

3 植物OSC基因的進化

在真核生物中，甾醇（Steriods）如膽固醇作為細胞膜的組成成分，在穩定細胞膜的結構及調節細胞膜的通透性等方面起著重要作用；而在原核生物中，藿烷類（hopanoid）三萜作為細胞膜的組成成分在改善細胞膜的強度和剛度上起著重要作用[52-53]。藿烷類三萜和甾醇的合成都起始于前體鯊烯（Squlene），鯊烯何伯烯環化酶（SHC）能夠將鯊烯環化成何帕烯（hopene）進而經過反應生成hopanoid，而在動植物和真菌中不同的OSCs 催化生成各種甾醇前體。Bode 等從可以產生甾醇的粘細菌Stigmatella aurantiaca克隆到第一個細菌環阿屯醇合酶基因，同時他們對Nannocystis excedens的化合物分析中也檢測到了羊毛甾醇的存在，序列分析結構顯示細菌中環阿屯醇合酶（CAS）的氨基酸序列與植物中的CAS 有37%-44%的相似性，與細菌SHC有26%的相似性，據此推測該細菌中CAS 可能由SHC進化而來，繼而進化成高等植物中的CAS[54]。Lamb 等人從甲烷利用菌Methylococcus capsulatus中同時克隆了鯊烯單加氧酶（squalene monooxygenase）基因和羊毛甾醇合成酶基因（LSS），并利用大腸桿菌異源表達體系對這兩個酶的功能進行了體外驗證[55]。但已有的研究表明，在少數高等植物和一部分蕨類植物、少數苔蘚類和真菌中有也hopanoid類三萜的存在[53,56]，這表明某些植物基因組中中也許同時有羊毛甾醇和藿烷類三萜合成酶基因的的存在，Shinozaki 等[57]首次從蕨類植物Adiantum capillus-veneris中克隆了鯊烯合酶同源基因ACH（22-hydroxyhopane synthase）和氧化鯊烯合酶同源基因ACX（cycloartenol synthase），氨基酸序列進化樹分析也表明ACH 與細菌的SHC 聚為一類，而ACX 與高等植物的CAS 聚為一類[57]，該研究進一步表明植物中的OSC有可能由細菌中的SHC進化而來。

對植物基因組分析發現，低等植物如萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、小立碗蘚（Physcomitrella patens）及 蕨 類 植 物 如Adiantum capillus-veneris和Polypodiodes niponica只有一個OSC 基因，編碼環阿屯醇合酶催化產生環阿屯醇，是植物生長所必需的[58]。而高等植物基因組中往往含有多個OSC 基因，對植物中OSCs 基因的進化分析表明，植物中OSCs 基因可能來自于同一個祖先CAS 基因[17,46]。Xue 等人利用已知的所有植物OSCs 共101 個基因進行了系統性進化分析，結果表明高等植物中的OSCs基因起源于一個CAS祖先，OSCs基因家族在進化過程中發生了兩次古老的復制事件，一次是在單子葉和雙子葉植物分化之前，經過基因復制形成了兩個原始的OSC 基因：原環阿屯醇合酶（ancestral cycloartenol synthase，ACS）基因和原類羊毛甾醇合酶（ancestral lanosterol synthase-like，ALSL）基因，在單子葉植物從雙子葉植物分化出來之后，ACS 基因經過多次復制擴張形成了現在單子葉植物中OSCs 基因，另一次古老的復制事件是ALSL 基因在單子葉和雙子葉植物分化之前又發生了一次復制，原始的LSS基因在多數雙子葉植物中保留了下來但在單子葉植物中丟失，而復制的ALSL 基因拷貝進化形成了現在雙子葉植物中的OSCs 基因。同時對進化樹的不同分支進行選擇壓力檢測發現，不同分支的OSCs基因在進化過程中受到的選擇壓力明顯不同，CAS 和LSS 和LUS 基因受到了凈化選擇的作用，而其中大多數OSCs 基因受到了正向選擇的作用，這加快了重復基因獲得新功能的速度。因此，OSCs基因家族的擴增及功能多樣性由全基因組倍增、局部串聯復制等形成的多拷貝基因在不同選擇壓力下獲得不同功能的結果[24]。

4 OSC 酶結構和催化機制的研究進展

4.1 OSC基因結構和酶結構

一直以來，科學家們比較感興趣的是為什么數量不多的OSCs 能催化產生結構如此豐富多樣的產物，其中一種假設是這些OSCs 基因的序列差異會很大，核酸序列分析表明，目前發現的OSCs 基因外顯子數量差別不大，大多數包含18 個外顯子，除了第一個和最后一個外顯子序列差異大，其它相對應位置的外顯子大小比較一致，序列也高度保守，但內含子序列變化 很 大 。 目 前 嗜 熱 球 菌（Alicyclobacillus acidocaldarius） 的 鯊 烯 環 化 酶（Squalenehopenecyclase，AaSHC）[59]和人類（Homo sapiens）的羊毛甾醇合成酶（hLSS）[50]的晶體結構已經解析。但是植物OSC 屬于膜蛋白且分子量較大，難以獲得晶體結構，到現在為止，仍沒有植物OSC 晶體結構的報道。OSC是一類較為保守的酶家族，蛋白序列相似度高，目前對植物OSC 的研究主要通過同源建模及點突變對催化機制進行研究[59-60]（圖2）。

圖2 hLSS的三維結構和催化的基本過程

來自于嗜熱球菌的AaSHC，催化角鯊烯環化為何帕烯，將其基因在大腸桿菌表達（Escherichia coli）后，通過陰離子交換色譜和凝膠過濾法純化蛋白，最終得到分辨率為2.9? 的蛋白晶體，AaSHC 為同源二聚體蛋白，為膜單側結合蛋白，但并不穿透膜雙分子層，每個單體的長度為631 個氨基酸，有兩個結構域，形似“啞鈴狀”，分別用Domain1和Domain2表示，Domain1是一個由兩個α6-α6 組成的同心環狀螺旋組成的桶狀結構域，Domain2是一個α-α螺旋桶狀結構域，這兩個結構由loop 環連接形成一個β 結構的空腔，在這兩個桶裝螺旋結構域外有8 個QW 基序，它們具有堆疊的Gln和Trp 側鏈，其中有7 個具有幾乎相同的構象，通過氫鍵作用將外部的螺旋結構連接起來起到穩定蛋白結構的作用，同時還有一個非極性的通道便于底物細胞膜進入到β 結構的空腔中的催化活性中心區域進行反應。

將人類的羊毛甾醇合酶（hLSS）基因在酵母（Pichia pastoris）中表達，通過金屬螯合色譜和凝膠過濾法純化蛋白，最終獲得了分辨率為2.1? 的蛋白晶體。晶體結構解析發現，hLSS的結構與AaSHC的非常相似，也都是有兩個α-α 螺旋桶裝結構域，這兩個結構域也由loop 環連接形成一個β 結構的空腔，但在桶狀螺旋外圍只有5 個保守的與AaSHC 中構象相同的QW 基序，但同樣起著穩定蛋白結構的作用，另外，hLSS 的N 端區域多了一個填充于兩個結構域之間的區域，這段區域在維持蛋白構象和方向上起著重要作用，hLSS 最大的活性位點口袋位于Domain1 和Domain2 之間，hLSS 是一類膜單側結合蛋白，通過Domain2中的部分區域附著于膜的一側，Domain2與膜結合部分含有一個直徑為25? 的平面及底物進入活性位點的通道，該通道允許底物2,3-氧化鯊烯進入疏水活性位點，但該通道與活性口袋之間被一收縮位點嚴格分開[59]，通過改變Tyr237、Cys233 和Ile524 等氨基酸側鏈的構象或者對516-524 及697-699 兩個loop 環重排可以形成底物通道。根據OSC 和0.8%n-辛基-D-β-葡萄糖苷（β-OG）膜重結晶衍射分析，β-OG 的葡萄糖頭部基團和OSC 的膜結構域平行排列，而β-OG 的辛基和雙分子層的脂肪酸平行。例如OSC/LAS的疏水活性中心，Asp455、Cys456 和Cys533 等殘基提供了極性帽子，有利于羊毛甾醇3 位氫鍵的形成，在A、B 環形成之后，Phe44、Tyr503 和Trp581 等殘基通過陽離子-π 相互作用穩定C6 和C10 的陽離子。OSC 中的保守基序DCTAE決定了底物特異性，如果把鯊烯環化酶SC（squalene-hopene cyclase）保守基序DDTAV 變為DCTAE，SC也可以結合2,3-氧化鯊烯。

4.2 OSCs催化基本過程的推測

化學家們以OSC 催化產物的空間構象和化學反應基本原理為依據推測其催化的基本過程：①酶與底物的結合，底物的預折疊；②底物環氧基團質子化，環化反應起始；③各個環的形成；④在環骨架上發生一系列質子轉移和甲基重排反應；⑤去質子化或捕獲一個水分子形成最終產物[61]（圖2）。底物的預折疊對環化反應的起始至關重要，同時決定了環化產物是CC-C 還是C-B-C 構型。OSC 產物多樣性主要是由反應過程中一系列具有嚴格構象的部分環化的中間陽離子分子與酶催化活性中心的蛋白結構之間的相互作用決定的。

4.3 OSCs催化功能的關鍵氨基酸

目前對于LSS 的催化反應路徑研究得較為透徹，為了研究羊毛甾醇形成的環化機制，研究者進行了許多針對LSS 活性中心氨基酸的定點突變實驗。Tyr510Ala 突變后可以生成羊毛甾醇，而Tyr510Lys 和Tyr510Trp 突變后不能生成羊毛甾醇，說明Tyr510 參與單環到四環產物的生成[40,62]。有實驗證明His234 和Tyr510之間的氫鍵相互作用能夠穩定三環C14陽離子和C20 陽離子[63-64]；Phe445 能夠穩定C14 陽離子，影響去質子化[65]；Trp232 對D 環形成起重要作用[66]；Tyr99有穩定B 環構象和C14 陽離子、形成C 環的作用[67]；Phe699 穩定C17 陽離子之間產物[68]；Cys703 不僅穩定C-B 構象C8 陽離子，還可以與Phe699 相互作用[69]；Ile705 影響羊毛甾醇C 環和D 環形成[70]；Tyr707可能影響C-B 構象C8 陽離子和lanosteryl C8/C9 陽離子的穩定[58]。

環阿屯醇和羊毛甾醇有相似的結構且都是C-BC 構型，許多環阿屯醇合酶（CAS）的定點突變實驗也證明突變后的CAS 可以生成羊毛甾醇[29,71-74]，為LSS 從CAS 進化而來的觀點提供了依據[75]。在β-香樹素合酶中Phe728 影響D 環和E 環形成，Phe474 通過π 電子相互作用和空間位阻效應影響底物折疊[76-77]。Salmon等發現燕麥中的β-香樹素合酶Ser728Phe突變會導致催化產物由五環β-香樹素變為四環達瑪烯二醇II（Dammarenediol-Ⅱ），且突變后的β-香樹素合酶的底物特異性發生了變化，能夠同時催化2,3-氧化鯊烯和2,3;22,23-二氧化鯊烯[78]。Banta 等使用大腸桿菌異源甾醇表達系統證明了細菌羊毛甾醇合酶中的四個氨基酸殘基的取代使得除了四環甾醇之外還能合成五環脂肪醇[79]。

Xue[80]鑒定出粳稻OsPS 合成C-B-C 構象的四環三萜帕克醇，秈稻和野生稻OsOS 合成C-sC-C 構象的五環三萜秈稻醇以及12 種副產物。利用分子進化分析和蛋白結構模擬等方法從34 個稻屬植物的46 個多態位點中鑒別出3個影響產物構象和結構變化的關鍵氨基酸位點。而且這三個氨基酸殘基影響第四個氨基酸殘基Tyr257 側鏈的空間方向，從而決定了產物是C-B-C構象的四環三萜帕克醇還是秈稻OsOS合成CsC-C 構象的五環三萜秈稻醇[80]。因此，一些非直接作用氨基酸殘基通過影響直接作用氨基酸殘基的構象，可能引起酶功能的轉換。

5 小結與展望

5.1 新穎功能OSC酶的挖掘

雖然通過分離提取植物鑒定到的三萜骨架超過120 種，但目前進行過功能驗證的OSC 僅覆蓋了其中的51 種三萜骨架[7]，仍有大量三萜骨架不清楚其OSC序列，這限制了三萜的異源生產和更廣泛的應用。隨著二代及三代測序技術的發展，提高了測序讀長和通量，已經有數十個藥用植物基因組完成了全基因組測序及組裝工作，未來會有越來越多的藥用植物基因組被報道。從測序基因組中挖掘新的三萜合酶，利用酵母和煙草異源表達體系，將有更多產生新骨架的OSC酶被鑒定。

5.2 OSC酶催化機制研究

OSC催化線性底物2,3-氧化鯊烯生成多環三萜產物是自然界中最復雜的酶級聯反應之一，2,3-氧化鯊烯經過底物預折疊、環氧質子化、環形成、D 環擴張、E環形成、質子和甲基轉移、脫質子或水合生成最終三萜產物[81]。已有研究利用同源建模及定點突變對人羊毛甾醇及β-香樹素等三萜合酶的環化機制進行研究，但是其它三萜骨架類型比如大戟烷、甘遂烷、木栓烷等的環化機制還少有報道，可能是因為相關類型三萜合酶還少有發現。近年來發展的Alphafold 2基于深度學習蛋白質折疊過程從頭預測蛋白空間結構，比同源建模預測精度更高，未來會成為酶催化機制研究的有力工具[12-13]。

5.3 異源表達體系

酵母是目前應用最廣泛的真核表達系統，但植物源基因在微生物體內蛋白表達普遍較低，可能需要進行密碼子優化才能在酵母底盤成功表達。煙草在次生代謝合成途徑和蛋白的翻譯后修飾上與候選基因的來源植物具有更多的相似性，因此在植物蛋白的異源表達上具有一定的優勢。但由于底盤細胞自身復雜的代謝流，需要進一步通過優化整個體系，比如在酵母中敲低內源性的固醇代謝途徑，在煙草中過表達上游限速酶—3-羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶，進而提高目的產物的產量便于檢測。