艾活性成分生物合成調控相關的WRKY轉錄因子篩選及表達分析＊

易小哲，王夢月，鄔 蘭，劉 霞，劉佳偉，農熠瑛，陳士林，師玉華＊＊

（1. 中國中醫科學院中藥研究所青蒿素研究中心/中藥鑒定與安全性評估北京市重點實驗室 北京 100700；2. 武漢理工大學化學化工與生命科學學院 武漢 430070；3. 湖北艾艾貼健康科技有限公司 黃岡 435300）

艾葉來源于菊科蒿屬植物艾（Artemisia argyi）的干燥葉，是我國的傳統中藥材。艾葉作為藥材正式記載始于《名醫別錄》[1]，具有悠久的藥用歷史，《中國藥典》記載其有溫經止血，散寒止痛的效用[2]。此外，艾葉也是艾灸產品主要原料，具有重要的經濟價值。艾的有效活性成分以揮發性的萜類化合物為主，具有抗菌抗炎、止咳平喘的藥理作用[3]。隨著艾葉和艾灸在醫藥和保健產品工業中的大量應用，艾的品質研究也受到了廣泛的關注。萜類活性成分作為艾葉中的次生代謝產物，是一類重要的天然產物，依賴于植物提取。因此，增加艾葉中萜類活性成分的含量對艾葉品質的提升有著關鍵作用。因此，篩選和鑒定艾中萜類生物合成途徑相關的調控因子研究將有助于解析其生物合成和積累分子機制，為艾中活性成分含量提升提供了分子生物學依據。

轉錄因子（transcription factors, TFs）是可以與DNA 序列以特定的方式結合調節轉錄的蛋白質[4]。在高等植物中，TFs 是信號轉導通路的重要組成部分，參與調節植物生長發育、次生代謝和脅迫反應等重要生理過程[5-6]。WRKY 家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，主要在植物生長發育和響應逆境脅迫中發揮重要作用[7]。WRKY家族轉錄因子含有約60個氨基酸殘基序列組成的高度保守結構域，稱為WRKY 結構域，其N 端是WRKYGQK 保守序列，被稱為WRKY 七肽結構；C 端則是具有一個典型的鋅指結構，由CX4-5-C-X22-23-H-X1-H 或C-X7-C-X23-H-X1-C 組 成[8]。WRKY 結構域是WRKY 蛋白與DNA 分子結合的主要位點，主要通過與目標基因啟動子區的W-box 結合來調控目的基因的轉錄[9]。WRKY 家族根據含WRKY 結構域的數量和鋅指結構的類型劃分為I、II、III三類，具有兩個WRKY 結構域的蛋白為組I；具有一個WRKY結構域且具有C2H2 結構（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）為組II，具有一個WRKY 結構域且具有C2HC 結構（C-X7-C-X23-H-X1-C）的為組III。其中組II中又根據保守氨基酸的差異細分為IIa、IIb、IIc、IIf、IIe 五類[10]。WRKY 家族轉錄因子參與了多種激素的信號通路，例如茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、水楊酸（Salicylic acid，SA）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）等激素信號，從而影響植物生長發育和次生代謝等[11]。例如，擬南芥的AtWRKY70 是SA 與JA 介導抗病信號轉導途徑中的調控因子，是SA 誘導基因的激活劑和JA 響應基因的阻遏物[12]；丹參SmWRKY14被鑒定為受JA、ABA、赤霉素（Gibberellin，GA）等植物激素及機械損傷強烈誘導的WRKY基因，并且與丹參酮合成關鍵酶基因DXS、GGPPS、CPS的表達模式相似，可能參與到了丹參的萜類次生代謝產物的生物合成中[13]；小麥TaWRKY40-D可能參與JA 和ABA 途徑來正調節小麥的葉片衰老過程的WRKY 蛋白[14]。其中，JA 是高等植物內發現的一種內源性植物激素，通過調控與植物抗逆有關基因的表達，緩解植物在生長發育過程中受到的生物與非生物脅迫，是一種重要的生長調節劑[15]。研究表明JA 在調節植物抗逆的過程中，會增加次生代謝產物的積累[16]，而藥用植物中的次生代謝產物通常是其有效成分[17]。很多WRKY 家族轉錄因子在JA 信號誘導的藥用植物次級代謝產物的生物合成和積累過程中發揮著重要作用[18]。例如，Suttipanta 等[19]通過在長春花中過表達一個受JA 誘導的WRKY 蛋白CrWRKY1，發現其能上調長春花中萜類抗癌活性成分吲哚生物堿（terpene indole alkaloids ，TIA）合成基因的表達，增加TIA 的含量；Li 等[20]發現在紅豆杉懸浮細胞中，由外源茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）特異性誘導的TcWRKY1 蛋白的過表達能夠增強紫杉醇生物合成中的關鍵酶DBAT 的表達；Chen 等[21]發現青蒿素腺毛中特異表達的WRKY1基因（AaGSW1）是JA/ABA 響應的轉錄因子，且能夠正向調節CYP71AV1和AaORA的表達，從而提高青蒿素含量。因此，WRKY 家族轉錄因子在JA響應和藥用活性成分累積中具有重要作用。

目前，艾的分子生物學研究開展尚淺，WRKY 家族轉錄因子的鑒定及其功能還沒有報道。本研究擬以艾的外源MeJA 處理轉錄組文庫為基礎，系統鑒定艾的WRKY 家族轉錄因子，并通過其蛋白理化性質、進化關系、保守基序等特征分析和JA脅迫下的基因表達模式分析，篩選在外源MeJA 處理下差異表達的WRKY基因，為艾葉WRKY 家族轉錄因子鑒定和參與MeJA 誘導的艾葉中萜類等活性成分的累積機理研究提供分子生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

本研究所用艾（A. argyi）采自湖北蘄春縣張榜鎮蘄艾種植基地，將新鮮的根狀莖移栽至中國中醫科學院中藥研究所溫室中培育。選擇來自一株植物的根莖繁殖的、長勢一致的90天齡幼苗作為試驗材料。分別用100 μmol·L-1的MeJA 溶液（98% MeJA，Sigma，W341002-SAMPLE-K，以含0.098%無水乙醇的去離子水為溶劑）和空白溶液（含0.098%無水乙醇的去離子水）噴施葉片，取噴灑后12 h的葉片，每3株一組，取三組重復。樣品在液氮中速凍，-80℃下保存備用。

1.2 RNA提取和cDNA合成

稱取葉片樣本100 mg，充分研磨后利用EasyPure? Plant RNA Kit（ER301-01，TransGen Biotech）試劑盒提取總RNA；采用微量紫外分光光度計NanoDrop 2000 檢測RNA 樣品的濃度、OD260/OD280 以及OD260/OD230 值；取檢測合格的RNA 樣本進行cDNA 第一鏈合成，按照TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AT311-02，TransGen Biotech）試劑盒的操作方法進行；cDNA放置-20℃保存備用。

1.3 AarWRKY序列的篩選和鑒定

本研究基于課題組已有的艾轉錄組數據中的unigene 序列，采用ITAK[22]數據庫（http://itak.feilab.net/）進行候選WRKY基因的預測。利用ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測候選基因的包含起始密碼子和終止密碼子的完整的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），選取其中最長的ORF并使用標準密碼子翻譯表翻譯成全長蛋白序列。然后，使用PFAM[23]（http://pfam.xfam.org/）和WRKY 域（WRKY：PF03106）的隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）驗證保守結構域并去除假陽性序列。

AarWRKY 蛋白的理化性質采用ExPASy ProtParam[24]（http://cn. expasy. org/tools）進行分析。AarWRKY蛋白的亞細胞定位使用WoLF PSORT[25]（http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）預測。

1.4 AarWRKY 的分類、系統發育關系和保守結構域分析

基于艾中WRKY 蛋白的WRKY 保守結構域對AarWRKY進行分類。AarWRKY 的WRKY 結構 域 在Jalview 軟件中進行可視化分析[26]。使用MEGA7[27]中的MUSCLE 和Neighbor-Joining 方法（參數設置：進化模 型 為Poisson model；Bootstrap 重 復=1000）構 建AarWRKY蛋白序列的系統發育樹。利用在線保守基序預測網站MEME[28]（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）（motif參數設置為10）驗證AarWRKY 蛋白的保守基序。利用TBtools[29]可視化分析AarWRKY 蛋白的系統發育樹和保守基序。

1.5 表達模式分析與差異基因篩選

提取6個外源MeJA處理組（MeJA）和對照組（CK）下的葉片RNA-seq 數據中AarWRKY基因的表達量（Fragments Per Kilobase Million，FPKM）數據，經row scale 進行均一化處理，并運用TBtools 軟件繪制熱圖，以系統發育關系進行聚類和差異表達分析。以MeJA組和CK 組的AarWRKY基因的表達量（FPKM）數據的差異倍數（fold change）≥2.0 為閾值篩選差異表達的AarWRKY基因。

1.6 實時熒光定量PCR

以Actin為內參基因[30]，通過Primer Premier 5.0 軟件分別設計差異表達基因AarWRKY3、16、18、20、30、37的實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）引物（表1），并利用Primer-BLAST（http://ncbi.nlm.nih.gov./tools/primer-BLAST）進行引物序列特異性分析。引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。qRT-PCR 實驗采用TransStart? Green qPCR SuperMix UDG（AQ111-01，TransGen Biotech）試劑盒，具體操作按說明書進行。qRT-PCR 體系為20 μl：2×TransStart TipTop Green qPCR SuperMix10.0 μl，正向引物（10 μM）0.30 μL，反向引物（10 μM）0.30 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.4 μL，配制過程在冰上完成。PCR 擴增程序為：94℃預變性10 min；95℃、10 s，60℃、15 s，72℃、20 s，40 個循環；熔解曲線分析程序：95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。每個樣品設置3 個技術重復，并設陰性對照。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 基因蛋白功能和互作網絡分析

基于擬南芥同源蛋白，我們使用STRING.4[31]（https://string-db.org/）預測外源MeJA 處理下的差異表達AarWRKY 的同源蛋白和其相互作用網絡。使用BLASTP 鑒定和確定AarWRKY 蛋白在Arabidopsis thaliana中的同源蛋白，選取比對的蛋白中e-value 值最小的蛋白作為AarWRKY 蛋白在Arabidopsis thaliana中的同源蛋白來構建蛋白相互作用網絡。

2 結果與分析

2.1 艾AarWRKY轉錄因子鑒定和蛋白理化性質分析

本研究通過ITAK 數據庫從艾葉的RNA-seq 數據中共預測獲得69 個WRKY候選基因，選定候選基因的最長的完整的ORF，翻譯出全長蛋白序列，通過HMM去除冗余和錯誤序列后，共鑒定出37 個WRKY 蛋白，將其重命名為AarWRKY1-AarWRKY37。AarWRKY蛋白的理化性質結果表明（表2），AarWRKY 基因編碼的氨基酸長度為119-547 aa；蛋白分子量為13426.3-59781 Da；理論等電點（isoelectric point，PI）大小為4.86-10.03。在37 個AarWRKY 蛋白中，有6 個蛋白（AarWRKY2，AarWRKY3，AarWRKY10，AarWRKY16，AarWRKY32，AarWRKY37）為穩定蛋白（不穩定指數，Instability index ＜40），其余蛋白都是不穩定蛋白。所有AarWRKY 蛋白都是親水性蛋白（平均親水性，GRAVY ＜0）。脂肪族指數（Fatty coefficient）為43.5-74.8。蛋白質序列亞細胞定位預測結果表明，大多數的AarWRKY蛋白都可能定位于細胞核，僅有3個蛋白序列可能定位在細胞質或葉綠體中。

表2 艾葉AarWRKY蛋白的理化信息及特征

2.2 艾AarWRKY家族的WRKY保守結構分析與分類

本研究對已鑒定的艾中37個AarWRKY 蛋白的保守WRKY 結構域進行氨基酸序列比對分析（圖1），結果發現大部分AarWRKY 蛋白中WRKY 的七肽序列和鋅指序列非常保守，但也存在一些氨基酸殘基的變異，如組IIc 中的AarWRKY19 的WRKY 七肽結構中的氨基酸殘基被替換為“WRKYGKK”；組IId 中的AarWRKY12 和AarWRKY14 的WRKY 七肽結構中的氨基酸殘基被替換為“WKKYGEK”。參照擬南芥的WRKY 家族分類原則，按照WRKY 保守結構域特征對AarWRKY 蛋白進行分類。34 個AarWRKY 蛋白分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ三組，其中Ⅰ組有8 個成員，Ⅱ組有22 個成員，Ⅲ組有4個成員。Ⅱ組又進一步細分為Ⅱa（1個），Ⅱb（2 個），Ⅱc（6 個），Ⅱd（6 個）和Ⅱe（7 個）。但是AarWRKY3、AarWRKY17 和AarWRKY37 三個蛋白未能歸類，氨基酸比對結果分類發現AarWRKY3 和AarWRKY17 屬于組II，但無a、b、c、d、e 組的特征氨基酸殘基；而AarWRKY37 只含有保守的“WRKYGQK”的七肽結構，鋅指結構域缺失。

圖1 AarWRKY蛋白保守結構域分析和家族分類

2.3 艾AarWRKY蛋白系統發育分析和保守基序分析

本研究進一步利用37個AarWRKY 的全長蛋白構建系統發育樹，并通過MEME 分析蛋白的保守基序分布情況。根據AarWRKY 的全長蛋白系統發育樹（圖2A），同一亞家族的AarWRKY 蛋白序列基本被聚類到了一個分支或相近的分支上。如組I、組IIa、組IIc 和組III。但是，也有不同的亞家族成員聚類到同一分支上的現象，如IIc 的部分蛋白（AarWRKY4、AarWRKY7、AarWRKY37）和IIe 組的部分蛋白（AarWRKY16、AarWRKY21、AarWRKY28、AarWRKY31）與組I 聚集在一類中；剩余的IIc 蛋白（AarWRKY1、AarWRKY2、AarWRKY13、AarWRKY19）與IIa 和IIb 聚集在一起；IId 組則和剩余的IIe 組蛋白（AarWRKY23、AarWRKY27、AarWRKY33）聚在一個分支上。而未被分類的AarWRKY3 和AarWRKY17 與組III 具有C2HC 結構的WRKY 蛋白的親緣關系更近，被分類到了組III 中；AarWRKY37 與組IIc 的成員聚到了一個分支上，它們的親緣關系更近。

蛋白保守基序分析結果發現（圖2B），保守基序表現出組間或者亞組間的特異性。其中motif1是WRKY七肽保守域到鋅指結構的第一個半胱氨酸（Cysteine，C），motif2 是鋅指結構的C-H-H（C）部分，motif1+motif2 的組合均存在于除AarWRKY37 之外的其他蛋白中，由于AarWRKY37 的WRKY 保守結構域僅包含保守的“WRKYGQK”的七肽結構，因此在MEME 的預測中，AarWRKY37 的蛋白序列沒有發現motif1 和motif2。保守基序的特異性表現在：組I 中的AarWRKY 蛋白序列在N 段還含有保守的motif3 +motif10組合，這是組I的AarWRKY 蛋白特有的另一組WRKY 保守結構域；IIb 亞家族含有特有的motif9 基序；motif6 僅在IId 亞家族中被發現；motif5則主要分布在組III的蛋白序列中。

圖2 艾AarWRKY蛋白的系統發育樹和保守基序分布

2.4 外源MeJA 脅迫下AarWRKY 基因的表達模式分析和差異表達基因篩選

本研究基于外源MeJA 處理（MeJA）組和對照（CK）組 的RNA-seq 數據，分析外源MeJA 處理下AarWRKY家族基因的表達模式（圖3）?；虮磉_熱圖的結果發現，在MeJA 的影響下，IIc 亞家族的WRKY基因幾乎都上調；而IIb 亞家族的兩個基因AarWRKY11和AarWRKY30的表達均下調。而其它亞家族的基因并沒有體現上調或下調的整體性差異。我們以差異倍數（fold change）＞2.0 為閾值篩選在MeJA 處理下上調和下調的差異表達基因，結果發現MeJA 處理下AarWRKY3（CK 表達量0）、AarWRKY20（MeJA 上調3.76倍）、AarWRKY37（CK 表達量0）三個基因為上調差異基因；AarWRKY16（MeJA 表達量0）、AarWRKY18（MeJA下調2.30 倍）、AarWRKY 30（MeJA 下調2.15 倍）三個基因為下調差異基因。進一步利用qRT-PCR 測定這6個差異表達基因的表達情況，結果表明（圖4），6 個差異表達基因在MeJA 組和CK 組的趨勢均與轉錄組數據一致，驗證了轉錄組數據的準確性。因此，這6 個AarWRKY家族基因可能參與艾對外源MeJA 處理的應答。

圖4 外源MeJA處理后艾中AarWRKY差異表達基因的qRT-PCR分析

2.5 差異表達的AarWRKY蛋白的功能預測

為了進一步探究AarWRKY 差異基因在MeJA 處理下的調控作用，我們使用STRING 預測了這6 個AarWRKYs 在擬南芥中的同源蛋白（表3），并分析它們和MeJA 處理相關蛋白的相互作用網絡（圖5）。蛋白相互作用網絡關系分析結果預測了2 個上調蛋白AarWRKY3（與擬南芥WRKY70 同源）和AarWRKY20（與擬南芥WRKY33同源）與JA 信號的受體蛋白JAZ1直接作用，也與JA信號調控網絡中的重要調控轉錄因子MYC2 和酶COI1 有相互作用關系，且在JA 信號的脅迫下存在共表達關系。 此外，上調蛋白AarWRKY37（與擬南芥WRKY75 同源）和3 個下調蛋白 AarWRKY16（ 與 擬 南 芥 WRKY3 同 源）、AarWRKY18（與擬南芥WRKY32 同源）、AarWRKY30（與擬南芥WRKY42 同源）雖然并沒有被預測與JA 信號網絡中的重要蛋白具有相互關系，但都可能與JA信號調控的其它蛋白存在相互作用關系。如絲裂原活化蛋白激酶3（MPK3）與JA 信號蛋白、AarWRKY3、AarWRKY20 和AarWRKY16 可能共同參與在植物激素刺激下的防御網絡，但在該過程中AarWRKY3 的表達下調的，且與MPK3 的具體作用關系研究較少。AarWRKY30 和AarWRKY37 與磷酸鹽調控網絡和JA調控網絡中的節點蛋白ZAT6 存在相互作用。此外AarWRKY37 還可能與乙烯反應蛋白EIN3 有相互關系。而以上的蛋白相互作用網絡中，AarWRKY3 和AarWRKY20 都參與到了其中。AarWRKY18 可能參與光敏色素和開花時間調節蛋白（PFT1）相關的調控。

圖5 外源MeJA處理后艾中差異表達AarWRKY蛋白的互作網絡分析

注：CK：空白溶劑對照組；MeJA：外源MeJA處理組。

表3 MeJA處理下差異表達AarWRKY蛋白的擬南芥同源蛋白及其功能

3 討論

艾是重要的藥用植物和經濟作物。目前國內艾的產品主要以艾葉、艾絨以及艾精油三種主要原材料為主，艾葉主要作為藥材使用，艾絨被制備成各種艾灸產品[32]，艾精油則在醫療保健、日化產品、農業等方面廣泛運用[1]。目前，國內艾的整體產業規模已達到了上百億[33]。因此，研究艾葉中活性成分的合成調控機制對提升其藥用價值和經濟價值有重要影響[34]。WRKY 家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，主要在植物生長發育和響應逆境脅迫等重要生理過程中發揮作用。研究發現，玉米ZmWRKY40在擬南芥中過表達可增強其抗旱性[35]；菊花DgWRKY4過表達能夠增強其耐鹽性[36]。這些研究都證實了WRKY 家族在植物應對脅迫方面發揮著重要的作用。除此之外，WRKY 家族的一些轉錄因子也被證實能夠參與到長春花、黃花蒿、紅豆杉、丹參和人參等藥用植物的重要次生代謝產物的生物合成中[37]。因此，WRKY 家族基因可能在艾的抗逆及次生代謝產物累積中也發揮重要作用。

本研究基于艾的轉錄組數據，鑒定出37 個AarWRKY基因。然而艾的基因組尚未發表，本研究僅利用了艾的轉錄組數據對WRKY家族進行鑒定，可能有一部分AarWRKY基因未被發現，許多物種在基因組水平上鑒定出了更多的WRKY基因，例如：De Paolis等[38]在黃花蒿（Artemisia annua）的基因組數據中鑒定了122 個WRKY基因；馬培杰等[39]在百脈根（Lotus corniculatus）的基因組數據中鑒定了79個WRKY基因。

根據WRKY 家族結構特點和系統進化分析，34個AarWRKY 蛋白被歸類在I、II、Ⅲ組被證實的亞家族中。其中I組蛋白有8個，數量最多；II-a中蛋白僅有1個，數量最少。這與擬南芥[10]、葡萄[40]、菠蘿[41]等植物中WRKY 亞家族的蛋白數量排序一致。此外，3 個AarWRKY 蛋 白 （AarWRKY3、 AarWRKY17、AarWRKY37） 未 能 分 類 ，其 中 AarWRKY3、AarWRKY17 具有完整的WRKY 保守結構域的的特征，未能分類的原因是其WRKY 保守結構域的的特征均不符合現有研究中亞家族的分類的特征；AarWRKY37 的蛋白序列僅有WRKY 的七肽序列，后續鋅指結構和保守氨基酸的特征未知，因此未能分類。保守基序分析表明，AarWRKY 的WRKY 七肽結構和C2H2或C2HC的鋅指結構中氨基酸相當保守，37個AarWRKY 蛋白中僅有AarWRKY12、AarWRKY14和AarWRKY19 三個蛋白的七肽結構發生了1 至2 個氨基酸的突變。此外，同一亞家族的也有相似的保守基序種類和數目，可能在功能上也更為相似。WRKY家族全長蛋白系統發育樹分析發現同一亞家族的大部分成員被聚到一支上，但也有部分成員和別的亞家族蛋白聚到一個分支，表現出更近的進化關系。這可能是因為WRKY 家族的分類是基于保守結構域的數量和特點來劃分的，而系統發育樹的進化分析則是基于全長蛋白的序列比對完成的。據報道，在胡蘿卜（Daucus carota）[42]、浮萍（Spirodela polyrhiza）[43]和甘草（Glycyrrhiza glabra）[44]等物種中也存在不同亞家族混合聚在同一進化分支的現象。越來越多的研究已經證明了WRKY 的亞家族具有多重起源，Zhu 等人[45]對小麥的研究表明IIc 亞家族起源于I 組的N 端WRKY域；Zhang和Wang[8]提出將WRKY基因家族分為四個進化枝，包括I+IIc組、IIa+b組、IId組和IIe組。本研究艾的WRKY 轉錄因子中也存在不同亞家族混合聚在同一進化分支的現象，因此為WRKY 的亞家族具有多重起源的假說也提供了新的依據。

茉莉酸是一類重要的植物激素，是植物對外界脅迫防御反應和次生代謝物積累的重要調節劑。Schluttenhofer 等[46]在擬南芥和長春花的WRKY轉錄因子研究中發現，在長春花中至少有25%的CrWRKY對JA有反應，其中75%的CrWRKY基因是已知的受JA調節的AtWRKY直系同源基因。本研究通過分析MeJA處理下AarWRKY的表達模式，尋找艾的WRKY家族中響應JA 的轉錄因子。在轉錄組數據熱圖分析結果中（圖3），部分AarWRKY基因的重復性在三個重復差異較大，這可能是由以下兩點造成的：①盡管我們已經嘗試選擇生長均勻的幼苗，但樣本重復之間的個體差異仍然存在；②RNA-seq 文庫構建過程中的技術錯誤導致。因此，我們使用FPKM 值的平均值來分析基因表達差異并利用qRT-PCR 對篩選出的差異基因的表達進行驗證?；虻牟町惐磉_結果表明，外源MeJA誘導了艾的WRKY家族中一些基因的表達變化，其中有 3 個AarWRKY（AarWRKY3、AarWRKY20、AarWRKY37）的表達量上調了2 倍以上，而3 個AarWRKY（AarWRKY16、AarWRKY18、AarWRKY30）的表達量下調了2倍以上，共有6個基因（16%）在此閾值范圍內對MeJA 有響應。qRT-PCR 結果也驗證了轉錄組表達數據的準確性。這些結果表明這六個基因可能參與到JA的信號轉導途徑中。進一步，本研究利用擬南芥蛋白互作數據庫分析這6個差異表達的AarWRKY基因的蛋白可能參與的調控網絡，結果顯示2 個上調基因AarWRKY3和AarWRKY20的蛋白可能直接與JA信號網絡中的幾個重要蛋白（如JAZ1、MYC2）存在相互作用關系，這兩個蛋白的擬南芥同源蛋白也是目前研究較為深入的植物激素防御蛋白。其中，AtWRKY70 是SA 和JA 介導的植物對細菌病原體反應過程中信號的聚合節點[12,46]；AtWRKY33 在灰葡萄孢（Botrytis cinerea）感染時同時靶向多個信號通路，直接與JA信號傳導受體JAZ1和JAZ5的啟動子結合[48]。此外 ，AarWRKY16、AarWRKY18、AarWRKY30 和AarWRKY37 等蛋白還可能通過與EIN3（ethyleneinsensitive3） 、 PFT1 （PHYTOCHROME AND FLOWERING TIME 1） 、 ZAT6 （Zinc-Finger Transcription Factor）等蛋白直接或者間接的相互作用參與到JA、乙烯、光、抗逆等過程的信號轉導途徑中[49-52]。JA 信號通路中的MYC2 蛋白是萜類次生代謝生物合成中重要的調控因子，它將JA信號整合到倍半萜合成酶基因的轉錄調控中并促進倍半萜的產生[53]。Alfieri等[54]在南歐丹參（Salvia sclarea）的毛狀根中過表達擬南芥中的異源基因AtWRKY18、AtWRKY40和AtMYC2，發現了它們以協同作用的方式共激活萜類骨架合成中MEP 途徑的合成酶基因，從而促進南歐丹參中松香烷二萜的積累。在本研究中，我們預測了在MeJA 處理下差異表達的AarWRKY 轉錄因子與MYC2蛋白可能有相互作用關系，說明在艾中，AarWRKY 蛋白也可能通過與MYC2 等JA 信號調控蛋白進行協同作用，參與到萜類的活性成分生物合成調控中。因此，我們能通過預測JA 等信號蛋白和WRKY 蛋白的相互作用，進一步探究AarWRKY 蛋白參與調控萜類生物合成的機制。因此，通過蛋白調控網絡預測，我們發現這些差異表達的AarWRKY 蛋白可能通過與JA等信號蛋白相互作用參與萜類生物合成的調控，后續還需要對這些候選AarWRKY基因進行克隆和進一步體內外功能驗證。

4 結語

綜上所述，本研究從轉錄組水平首次系統對艾葉的WRKY基因進行鑒定，并對理化性質、保守結構域特點，家族分類等進行了系統分析。進一步，通過基因差異表達分析和qRT-PCR 驗證篩選到6 個JA 信號響應的AarWRKY基因，并預測了這些基因與JA 信號調控蛋白協同作用參與萜類化合物的生物合成可能的調控網絡，為后續研究中AarWRKY 蛋白的功能驗證提供依據和方向。該研究為艾中WRKY家族基因的功能鑒定及其在響應外源MeJA 處理中的作用研究提供了一定的基礎，也為闡明WRKY 轉錄因子在艾的揮發性萜類等有效成分的生物合成中的調控機制提供數據支撐。