針刀松解“三合陽”對KOA模型兔膝關節IL-1β、IL-10、TNF-α的影響＊

孫季維，李園源，侯逸敏，魏嘉碧，柴玉卓，張雨晴，王榮國

（北京中醫藥大學針灸推拿學院 北京 100029）

膝骨關節炎是以關節軟骨退行性改變為特征的慢性病[1]，典型臨床表現為關節疼痛、腫脹、僵硬及關節活動受限，是中老年人喪失勞動力乃至日常活動能力的重要原因之一。近年來KOA 的患病率越來越高，且呈年輕化趨勢[2-3]，以及致病因素和發病機制復雜，目前尚未完全明確，但越來越多的證據表明炎癥與KOA 進程密切相關[4]，當前已成為研究熱點之一。有研究表明，正常的關節軟骨處于降解和修復的動態平衡中，當炎癥因子過度表達，則會促進關節軟骨的降解，加速KOA 的發展[5]。研究證實[6-7]，IL-1β 和TNF-α在關節炎患者中高濃度存在，是參與軟骨退變和降解的重要促炎因子。然而IL-10 作為抗炎細胞因子，能通過抑制軟骨細胞凋亡的方式發揮對軟骨的保護作用[8]。因此調控炎癥因子的表達對于防治KOA 至關重要。

我們在前期臨床觀察中發現膝后側牽拉痛和明顯壓痛是不同程度KOA患者的共同臨床體征，并且有研究發現腓腸肌上的“合陽內”“合陽外”“合陽次”（簡稱“三合陽”）三個結筋病灶點出現頻次較高[9]。針刀療法可通過松解結筋病灶點，直達病所，以松解粘連，調控相關因子的表達，進而調節膝關節內環境，延緩關節軟骨退變和破壞來治療KOA[10]。在既往的實驗研究中，針刀的治療部位主要集中在松解股四頭肌、腘繩肌或膝周韌帶等結筋病灶點[10-12]，但關于針刀松解腓腸肌上的結筋病灶點治療KOA 的相關研究鮮有報道。故本研究采用MIA 關節腔注射建立兔KOA 模型，觀察針刀松解“三合陽”改善膝關節功能的效果，明確針刀調控膝關節內IL-1β、TNF-α、IL-10 炎癥因子的表達和保護關節軟骨的作用，初步揭示針刀松解“三合陽”治療KOA 的相關機制，為完善臨床治療方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

采用健康雄性6 月齡新西蘭大白兔36 只，體質量2.5±0.5 kg，實驗動物由北京富龍騰飛實驗動物研究院有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2018-0009。實驗期間分籠獨立飼養，溫度20-25℃，相對濕度50-70%，可自由獲取食物和水。本實驗已通過北京中醫藥大學動物倫理委員會批準（批件號：BUCM-4-20200112003-4070），整個實驗過程嚴格按照實驗動物管理規定進行。

1.1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：單碘乙酸（貨號：I4386，美國Sigma 公司），Zoletil?50（法國Virbac 公司），HE 染色試劑盒（貨號：G1120，中國Solarbio公司），IL-1β（貨號：16806-1-AP，武漢Proteintech 公司），TNF-α（貨號：bsm-33207M，北京Bioss 公司），β-actin 抗體（貨號：BS6007M，南京Bioworld 公司），兔IL-10 酶聯免疫吸附測定試劑盒（貨號：ml041623，上海酶聯免疫公司），反轉錄試劑盒（貨號：K1622，美國Thermo Scientific公司）

主要儀器：一次性小針刀（江蘇華友醫療器械有限公司）、醫用診斷X 射線管組件（型號：E7239X，生產序列號：19J1036，佳能電子管器件株式會社），石蠟包埋機、石蠟切片機（型號分別為：EG1150，RM2245德國Leica 公司），BX43F 光學顯微鏡（型號：BX43，日本Olympus 公司），電熱鼓風干燥箱（型號：101-1A，天津市泰斯特儀器有限公司），高速臺式離心機（型號：5430R，德國Eppendorf 公司），多功能酶標儀（型號：M2e 美國Molecular Devices 公司），CFX ConnectTM熒光定量PCR 儀、ChemiDocTMMP 化學發光成像系統（型號分別為：1855201，12003154，美國Biorad公司）

1.2 方法

1.2.1 分組

將36只新西蘭兔采用隨機數字表法分為空白組、模型組、針刀組，每組12 只。分別于造模第4 周、第6周后每組隨機挑選6只取材。

1.2.2 模型制備及評價

造模前一天，隨機挑選24只實驗兔右膝關節周圍剃毛備用。具體造模方法如下：俯臥位固定實驗兔，采用Zoletil?50 1 mL 在兔左臀大肌注射麻醉后取仰臥位，于右膝關節周圍碘伏消毒，將MIA以2.5 mg·kg-1向關節腔內推注，以建立兔KOA模型。各組實驗兔每日籠外驅趕活動30 min。模型鑒定：造模2 周后，行膝關節Lequesne MG 評分[13]，其總分≥4 分表示造模成功，并對針刀組進行相應干預。

1.2.3 干預方法

造模成功后，針刀組依據《中國經筋學》[14]和《動物解剖學》[15]，選取筋結點“合陽次”（足太陽經筋：小腿后側，腘窩下緣中點下，平腓骨小頭下緣水平處；位于腓腸肌肌腹聯合處），“合陽內”（足太陽經筋：小腿后側，合陽次內上方，腘窩下緣處；位于腓腸肌內側頭），“合陽外”（足太陽經筋：小腿后側，腘窩下緣，腓骨小頭內側；位于腓腸肌外側頭），在施術部位用碘伏消毒三遍，然后鋪無菌洞巾，使治療點正對洞巾中央，術者戴無菌手套，采用一次性0.4×40 mm 無菌小針刀進行松解。刀口線平行小腿長軸，垂直進針，分別抵達病變處縱向疏通3 次，操作結束后用無菌干棉球在手術部位按壓1 min，每3 天干預1 次。空白組和模型組只做相同的抓取和固定，不予針刀治療。

1.2.4 標本采集及制備

（1） 采集關節液

取材前備皮，碘伏消毒，取Zoletil?50 1 mL 肌肉注射麻醉，兔右膝關節保持半屈曲位，用5 mL 注射器抽取2 mL生理鹽水于外膝眼處緩慢注入，反復活動膝關節，然后回抽關節液至EP 管中，做好標記，于冰凍離心機4℃，3000 rpm·min-1，離心15 min，用移液槍吸取上清液置于-80 ℃冰箱中保存。

（2） 采集膝關節股骨內外側髁

打開關節囊，暴露關節腔，用眼科剪離斷周圍韌帶及前后交叉韌帶，清理半月板，分離膝關節，取股骨下段1/3，清理周圍脂肪、韌帶和肌肉等組織，用生理鹽水沖洗干凈后，用咬骨鉗分離股骨內側髁軟骨，放入凍存管中，做好標記，-80℃冰箱中保存。股骨外側髁投入4%的多聚甲醛溶液中固定72 h 后，轉移至10%EDTA脫鈣液中。

1.2.5 主要指標檢測及方法

（1） 行為學觀察

采用Lequesne MG 量表，分別在造模第4 周、第6周后觀察各組實驗兔行為學變化。從局部疼痛刺激反應、步態改變、關節活動范圍、關節腫脹度四個方面去評估兔右膝關節功能，總分11 分，分值越高提示膝骨關節炎病變程度越重，關節活動能力越差。要求由2 位對分組情況不知情人員分別進行評分并記錄分值，結果取二者平均值，每次評分均由相同人員進行。

（2） 影像學觀察

對各組實驗兔行右膝關節正位X 線攝片。X 線檢測方法：取仰臥位，保持髕骨位于正前方，放射球管距離膝關節120 mm，檢測參數設置為照射電壓50 kV、照射電流200 mA、照射量1000 mAs、照射時間5 ms。采用K-L 分級標準[16]對各組實驗兔右膝關節骨質增生、脛股關節間隙狹窄程度進行分級。

（3） 大體形態觀察

觀察所采集關節液色澤，并且在完全暴露膝關節后，肉眼觀察膝關節軟骨、滑膜大體情況，包括顏色、形態等情況。

（4） 病理形態學觀察

將脫鈣完全的股骨外側髁修切為適宜大小后經過脫水、透明、浸蠟后進行石蠟包埋，制備6 μm厚的石蠟切片以行HE 染色，光鏡下觀察軟骨形態改變并進行Mankin’s評分，評分越高說明軟骨破壞越嚴重[17]。

（5） ELISA檢測關節液中IL-10水平

從4℃冰箱中取出試劑盒室溫平衡1 h，并從-80℃冰箱中取出待測樣品冰上解凍，設置標準品孔和樣品孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL。于待測樣品空中先加40 μL 樣品稀釋液，再加10 μL 待測樣品，輕輕晃動均勻，除標準品孔外每孔加入酶標試劑100 μL，封板膜封板后置37℃恒溫箱中溫育60 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后其去，重復5次，拍干。每孔先后加入顯色劑A、B 液各50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min后每孔加終止液50 μL，在15 min內使用多功能酶標儀以450 nm波長檢測樣品中的IL-10的含量。

（6）WB檢測關節軟骨中IL-1β和TNF-α的蛋白表達水平

從-80℃冰箱取出軟骨組織，用液氮將軟骨組織磨碎，加入RIPA 裂解液充分勻漿，冰上裂解30 min后，置于冰凍離心機4℃，12000 rpm，離心15 min，收集上清液，BCA 定量法測定上清液蛋白濃度，加入Loding Buffer 后95℃加熱5 min 變性。制備濃縮膠和分離膠，取6 μg 上樣，經電泳、電轉至PVDF 膜后，用8%的脫脂奶粉封閉2 h，TBST 洗3 遍，每遍10 min，將膜分別浸泡于IL-1β、TNF-α 抗體（1:2000）孵育液中，4℃孵育過夜，加入二抗（1:8000），室溫搖床孵育1 h，ECL 法顯色照相并用Image J 軟件分析IL-1β、TNF-α的蛋白和內參蛋白的灰度值，分別以IL-1β、TNF-α和內參蛋白灰度值比值作為目標蛋白的相對表達量。

（7）RT-PCR 檢 測 關 節 軟 骨 中IL-1β 和TNF-α 的mRNA表達水平

從-80℃冰箱中取軟骨組織，置于研缽中加入液氮快速研磨，隨后裝入預冷的EP 管中，以Trizol 試劑提取軟骨組織的總RNA，用核酸紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度；根據濃度取1 μg 總RNA 反轉錄成cDNA后置于-20℃保存備用。采用10 μL PCR 反應體系：取cDNA 1 μL，上下游引物各0.4 μL，無酶水3.2 μL 及Power SYBRTMGreen PCR 預混液5 μL；PCR 反應程序：預變性95℃5 min，變性95℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃1 min 15 s，45 個循環。以GAPDH 為內參基因，計算各目的基因2-△△Ct比較分析mRNA 表達水平。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6 統計學處理

采用SPSS20.0 軟件進行統計學分析。符合正態分布和方差齊性的數據方可以使用均數±標準差（±s）表示，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。采用Graph pad Prism 9.0軟件繪制各種統計圖。

2 結果

2.1 各組Lequense MG 評分結果

分別在造模第4 周、第6 周后，模型組Lequense MG 行為學評分較空白組顯著升高（P ＜0.01），針刀組較模型組顯著降低（P ＜0.01）（圖1）。

圖1 Lequesne MG 評分結果

2.2 X線觀察結果

造模第4周后，空白組關節間隙對稱，邊緣未見明顯骨贅增生；模型組關節間隙變窄，有骨贅形成，K-L評分顯著高于空白組（P ＜0.01）；針刀組關節間隙稍有變窄但未見明顯骨贅，K-L 評分顯著低于模型組（P ＜0.01）。造模第6 周后，空白組關節間隙可疑狹窄，邊緣未見明顯骨贅增生；模型組關節間隙明顯變窄，甚至消失，有明顯骨贅形成，骨端明顯硬化，少數伴有畸形，K-L 評分顯著高于空白組（P ＜0.01）；針刀組關節間隙雖有變窄但未見消失情況，少量骨贅形成，骨端輕度硬化，K-L 評分顯著低于模型組（P ＜0.01）（圖2-圖3）。

圖2 膝關節K-L 評分結果

2.3 大體觀察結果

造模第4 周后，空白組軟骨表面光滑，呈淡藍色，邊緣無骨贅，關節液透明澄清，滑膜未見肥厚；模型組較空白組軟骨表面粗糙有裂紋，顏色變黃，暗淡無光澤，邊緣有疑似骨贅，滑液呈淡黃色，滑膜增厚；針刀組較模型組軟骨表面欠光滑，裂紋較模型組少，邊緣欠光滑，關節液呈淡黃色半透明狀，滑膜稍增厚。造模第6 周后，空白組軟骨表面光滑，但色澤稍暗，邊緣規整，關節液呈透明狀，滑膜未見肥厚；模型組較空白組軟骨部分缺失，暴露黃色軟骨下骨，邊緣明顯骨贅增生，膝關節增大，關節液呈渾濁狀淡黃色，滑膜明顯增厚；針刀組較模型組軟骨表面僅有裂紋，邊緣有骨贅，關節液呈淡黃色，滑膜增厚（圖3）。

2.4 關節軟骨HE 染色及Mankin’s 評分結果

造模第4 周后，空白組軟骨表面規則，4 層結構清晰可辨，基質染色正常；模型組較空白組軟骨結構不規則，有血管翳形成，軟骨細胞簇集或明顯減少，基質著色減少，潮線模糊或缺失，Mankin’s 評分顯著高于空白組（P ＜0.01）；針刀組較模型組軟骨細胞增加，基質著色增加，Mankin’s 評分顯著低于模型組（P ＜0.01）。造模第6 周后，空白組軟骨表面規則，結構清晰可辨，基質染色正常；模型組較空白組軟骨結構分辨不清，軟骨層部分剝脫至輻射層或全部剝脫，軟骨細胞排列紊亂，彌漫性增加，簇集現象嚴重，基質著色減少，潮線消失，Mankin’s 評分顯著高于空白組（P ＜0.01）；針刀組較模型組軟骨結構趨于規則，軟骨層剝脫減少，Mankin’s 評分顯著低于模型組（P ＜0.01）（圖3-圖4）。

圖3 各組兔膝關節X線正位、股骨髁大體、關節軟骨病理染色比較（HE，×100μm）

圖4 關節軟骨Mankin’s評分結果

2.5 關節液中IL-10蛋白表達結果

造模第4 周、第6 周后，模型組較空白組關節液中IL-10 表達水平顯著降低（P ＜0.01）；針刀組較模型組顯著升高，其中造模第4 周后（P ＜0.01），造模第6 周后（P ＜0.05）（圖5）。

圖5 關節液中IL-10表達結果

2.6 關節軟骨中IL-1β和TNF-α蛋白表達結果

造模第4 周、第6 周后，模型組較空白組IL-1β 和TNF-α 蛋白表達水平顯著升高（P ＜0.01），針刀組較模型組顯著降低（P ＜0.01）（圖6-圖7）。

圖6 關節軟骨中IL-1β和TNF-α的蛋白表達Western Blot圖

圖7 關節軟骨中IL-1β和TNF-α蛋白表達結果

2.7 關節軟骨中IL-1β和TNF-α mRNA 表達結果

造模第4 周、第6 周后，模型組較空白組IL-1β 和TNF-α mRNA 表達水平顯著升高（P ＜0.01）；針刀組較模型組IL-1β 和TNF-α mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.01）。（圖8）。

圖8 關節軟骨中IL-1β和TNF-α mRNA 表達結果

3 討論

中醫稱KOA 為“膝痹”，是一種筋骨共病、痿痹共存的臨床常見疾病，屬于“筋痹”范疇[18]。韓清民等[19]認為KOA 的病機演變規律為：筋傷是起因，筋病損骨是病變過程，筋骨同病是最終結果。當“筋傷”時周圍的筋結點因經脈氣血津液運行不暢而失去濡養，經久形成粘連、條索、結節等，即結筋病灶點[20]。本研究采用的治療部位“三合陽”是足太陽經筋在膝關節周圍的常見病灶點[19]。“陽氣者，精則養神，柔則養筋”，“合陽”為膀胱經上行陽熱之氣聚集之義。因此針刀松解“三合陽”的刺激量大，可以快速激發足太陽經筋膝周的陽氣，溫通局部氣血，進而濡養經筋，達到柔筋緩節的目的。

腓腸肌是人體步行中的一組重要肌肉群，“三合陽”分別位于腓腸肌內側頭、外側頭和肌腹聯合處。有研究認為太極拳運動中腓腸肌被優先激活，其作用可能不是補償，而是先導[21]。Morrison[22]指出在一個完整步態中，膝關節反作用力最大的時候，腓腸肌的肌力也達到最大，并且腓腸肌收縮時間的占比較大。以上說明膝關節受力變化與腓腸肌狀態的改變密切相關。王建等[23]通過針刀松解腓腸肌內側頭止點治療KOA 后對恢復伸膝功能取得較好療效。王維軍[24]采用手術治療重度膝關節屈曲攣縮畸形后，行后關節囊的廣泛松解，同時對腓腸肌及周圍攣縮組織進行適度松解，以期恢復合理的軟組織平衡。因此本研究采用針刀松解“三合陽”，可以直接松解腓腸肌并緩解其痙攣或勞損狀態使其柔軟，激活腓腸肌的生物力學特性，進而改善膝關節力學平衡，保護關節軟骨。結合針刀治療明顯減輕了KOA 模型兔的關節腫脹、疼痛程度，增加關節活動范圍，所以評估膝關節功能的Lequense MG 評分才降低。本研究證實針刀松解“三合陽”改善膝關節功能與減少軟骨退變和保留關節間隙密切相關。利用X 線結果進行K-L 評分是KOA 分級診斷的重要依據[25]，其中關節間隙越小提示軟骨存留越少。本研究結果顯示KOA 模型兔的脛股關節間隙隨時間推移逐漸變窄，甚至消失，而接受針刀干預的兔脛股關節間隙始終保留。上述影像學的變化與病理學染色結果也是吻合的。關節軟骨HE 染色發現針刀干預后的股骨髁上軟骨結構趨于規則，軟骨層少量剝脫，軟骨面輕微磨損，證實針刀松解“三合陽”可以減少軟骨退變，有保護關節軟骨的作用。此外，軟骨細胞簇集現象較輕、基質著色保留較好的現象也提示針刀松解“三合陽”與減輕膝關節炎癥反應有重要關系。IL-1β 和TNF-α 是OA 進程中促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞的兩種最為關鍵的促炎細胞因子[26-27]。IL-1β 和TNF-α 上調促進軟骨破壞相關的因子生成（如金屬蛋白酶、誘導酶、自由基等），同時抑制軟骨特異性基因表達（如Ⅱ型膠原蛋白、連接蛋白、蛋白聚糖等）[28]。本研究結果顯示模型組較空白組IL-1β 和TNF-α 的蛋白和mRNA 表達水平增高，且隨著時間的推移第6 周較第4 周更加嚴重。針刀組較模型組表達水平降低，說明針刀松解“三合陽”可以通過抑制IL-1β 和TNF-α 的表達，減輕炎癥反應，減少對關節軟骨細胞和軟骨基質的破壞，達到保護關節軟骨的效果。

退行性關節炎在發病的早期往往因為軟骨磨損、骨質增生而刺激誘發滑膜炎癥反應，引起滑膜增厚、水腫、積液等變化[29]。滑膜炎又會通過其所產生的炎癥遞質直接作用于關節軟骨而導致結構改變[30]。IL-10是一種具有抗炎特性的細胞因子，能促進關節軟骨Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，抑制IL-1β和TNF-α的分泌，阻止軟骨細胞凋亡，從而保護關節軟骨[8,31-32]。本研究結果顯示在造模第4 周、第6 周后，針刀組較模型組關節液顏色稍淡，滑膜稍薄以及關節液中IL-10表達水平顯著增加。因此針刀松解“三合陽”也能通過增加抗炎因子IL-10 的分泌來改善關節內環境，減輕炎癥反應，發揮軟骨保護效應。

綜上所述，針刀松解“三合陽”能保護關節軟骨，改善膝關節功能。其作用機制可能是一方面能激發膝周的陽氣，溫通氣血以濡養筋脈，進而發揮“柔筋緩節”的作用。另一方面針刀能通過松解腓腸肌，糾正膝關節力學失衡，減少關節軟骨中IL-1β 和TNF-α 的表達減輕炎癥反應，增加關節液中IL-10 的分泌抑制相應炎癥因子釋放，共同保護關節軟骨，減少軟骨破壞，保留脛股關節間隙從而改善關節功能。本研究也為臨床從足太陽經筋治療KOA 提供了實驗依據。KOA 的進展與滑膜炎癥密切相關，但本實驗尚未研究針刀松解“三合陽”調控滑膜組織炎癥相關因子的表達規律，后續將深入研究。