基于網絡藥理學的銀杏葉提取物防治老年性聾的作用機制研究＊

王青玲，張夢嫻，郭向東

（1. 河南中醫藥大學第一臨床醫學院 鄭州 450046；2. 河南中醫藥大學第一附屬醫院 鄭州 450000）

1 引言

老年性聾（Age-related hearing loss，AHL）是指隨年齡的增長出現的雙耳、對稱性、以高頻聽力減退為主的感音神經性耳聾。老年性聾逐漸成為世界第三大公共衛生問題，易導致抑郁、跌倒、癡呆和認知障礙等疾病，給社會帶來沉重負擔[1]。截止2018 年，我國65歲及以上人口約占全國總人數的11.9%[2]，該人群中老年性聾的發病率高達70%-80%，且發病率逐年攀升[2]。老年性聾的病理變化主要與耳蝸螺旋神經節細胞及其纖維、基底膜上的毛細胞等發生退行性變有關[3]，其發病機制與氧化應激及細胞凋亡等息息相關。衰老使耳蝸細胞抗氧化能力減弱，毛細胞大量丟失，螺旋神經節細胞超微結構破壞、線粒體功能障礙，進而產生氧化應激反應和細胞凋亡[4]。老年性聾的治療手段極其有限，目前國內外臨床上常用的藥物包括糖皮質激素、阿司匹林、葛根素、耳聾左慈丸等，但長期使用上述藥物可能會產生不良反應，臨床療效也存在爭議[5]。因此，尋求一種具有抗氧化和抗凋亡作用的藥物可能是防治老年性聾的一種有效方法。

銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract,GBE）是從銀杏的干燥葉中提取的有效成分，含有黃酮類、懈皮素、萜類內酯等多種抗氧化和神經保護成分[6]，已被廣泛應用于臨床。多項專家共識指出銀杏葉提取物對突發性聾、耳源性眩暈、神經血管性疾病等具有較好的臨床療效[7]，實驗研究也表明銀杏葉提取物可通過抑制細胞凋亡和抗氧化應激等藥理機制，對噪聲性聾等發揮預防和治療作用[8-9]，但銀杏葉提取物防治老年性聾的機制尚不明確。既往銀杏葉提取物防治老年性聾的研究大多集中于臨床觀察，但未曾對機制進行深入探討；也有應用網絡藥理學研究銀杏葉提取物治療突發性聾的研究，卻缺少實驗驗證[10]。

為此，本研究在既往研究的基礎上[8]，對研究方法進行改進與創新，以銀杏葉提取物的有效成分為基礎，借助網絡藥理學更直觀的呈現其作用靶點及通路，并利用現代實驗技術、將網絡藥理學得出的靶點、信號通路通過動物實驗進行驗證，來探索銀杏葉提取物防治老年性聾的潛在機制，為臨床上探索老年性聾的靶向治療藥物提供幫助。

2 研究思路內涵與實驗方法流程圖

2.1 研究思路的內涵

網絡藥理學是一門前沿、新興、便捷、綜合的學科，是一種基于虛擬預測、蛋白質相互作用和網絡分析的新型工具，已被廣泛應用于中醫藥領域。它通過將藥物活性成分、疾病靶點基因與信號通路聯系起來，為研究藥物治療疾病的具體分子機制提供了充足的證據[11]。為此，本研究人員提出基于網絡藥理學的銀杏葉提取物防治老年性聾作用機制的研究，其內涵主要包括：①銀杏葉提取物可能是通過多種有效成分作用于靶點基因、調控多條信號通路，進而改善老年性聾耳蝸組織的細胞形態和分子生物學功能，從而發揮延緩聽力損失的作用；②本研究從銀杏葉提取物治療老年性聾眾多的靶點基因與信號通路中篩選出相關性較高的靶點基因和信號通路，并結合多種實驗方法進行驗證。

2.2 實驗方法流程圖

見圖1。

圖1 實驗方法流程圖

3 研究與分析

3.1 銀杏葉提取物的網絡藥理學材料與分析

3.1.1 活性成分靶點及疾病靶點篩選

通過TCMSP 中藥系統藥理學分析平臺（https://tcmsp-e.com/）檢索銀杏葉的活性成分及靶點蛋白，根據口服利用度（OB）和類藥性（DL），篩選出OB≥30%且DL≥0.18的活性成分，獲得活性成分靶點蛋白，應用UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）對靶點標準化及去除重復值后獲得靶蛋白對應的靶基因。利用GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）獲得與老年性聾匹配的靶點基因，根據中位數≥5.68 篩選出疾病靶點基因，利用微生信的Venny 數據庫（http://www.bioinformatics.com.cn/login/）獲得藥物成分及疾病靶點的交集靶基因。

3.1.2 GO和KEGG功能富集分析

通過String數據庫（https://string-db.org/）構建疾病靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）的數據及網路圖。Metascape 數據庫（https://metascape.org/gp/index）輸入銀杏葉活性成分及老年性聾的共同靶點基因，選擇GO 的三種富集方式：生物過程（Biological Process，BP）、細胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）及KEGG 的數據，并將Logp轉換為P值，去除重復值及降序后，篩選P＜0.05 的數據，利用微生信平臺構建GO 的BP、CC、MF 三合一（enrichment GO term）網絡圖，應用富集氣泡圖（enrichment dot bubble）繪制KEGG通路圖。

3.1.3 疾病-靶點-通路網絡

用Cytoscape3.8.2 軟件構建銀杏葉提取物防治老年性聾的疾病-靶點-通路網絡圖。

3.2 動物實驗

3.2.1 實驗動物

選取4 周齡、體質量150-250 g、雌雄各半、聽力閾值正常的SD 大鼠30只（河南華興動物養殖中心，許可證號：SYXK(豫)2020-0002），于SPF 級溫度、濕度和光照可控的環境中飼養，自由飲食和攝水，實驗前適應性飼養7天。

3.2.2 試劑與儀器

銀杏葉提取物（舒血寧注射液），北京華潤高科天然藥物有限公司，批號：Z11021351；Bax（批號：GTX32465）與Bcl-2（批 號：GTX100440）均 購 自genetex 公司；Myosin-Ⅶa，批號：256790，購自Protrus Biosciences 公司；Alexa Flour 488 Donkey ，批號：111-545-003，購 自Jackson ImmunoResearch 公 司；HRP Goat anti-Rabbit IgG，Proteintech 公 司，批 號：GTX213110-01；內參抗體GAPDH（批號：UBI6010）、SDS-PAGE 快速凝膠試劑盒（批號：UBI3002）、BCA 試劑盒（批號：UBI2006）均購自上海UBIYOBIBIO 公司；T-SOD（總超氧化物歧化酶，批號：MM-0731R1）、MDA（丙二醛，批號：MM-0385R1）和GST（谷胱甘肽S 轉移酶，批號：MM-21254R1）均購自江蘇寶萊（酶免）生物科技有限公司。

3.2.3 模型制備和給藥方法

30 只SD 大鼠隨機分為5 組，每組均6 只，分別為：對照組、模型組、銀杏葉提取物低、中、高劑量組。除對照組外，其余各組大鼠均頸背部皮下注射劑量為500 mg·kg-1的D-半乳糖（用生理鹽水配制），每日1次，連續給藥8 周。對照組在頸背部皮下注射等量生理鹽水，共8周。造模成功后，銀杏葉提取物低、中、高劑量組分別注射10、20、30 mg·kg-1的舒血寧注射液，對照組及老年性聾組腹腔注射等體積的生理鹽水，每日1次，連續8周。

3.2.4 免疫熒光染色耳蝸基底膜鋪片

腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，麻醉滿意后斷頭取出耳蝸，灌注、固定、脫鈣，將耳蝸用1XPBS 漂洗，解剖顯微鏡下用游絲鑷、顯微剪自蝸尖到蝸底小心的將耳蝸基底膜分離三段，頂回、中回、底回三段。用10%山羊血清與PBST 按照9:1 比例配置1%封閉液，將基底膜置于以上封閉液中封閉通透，4 攝氏度冰箱過夜。用封閉液按照1:500 的比例稀釋一抗（Rabbit anti-Myosin-Ⅶa），4℃冰箱過夜。PBS 漂洗3 遍，每次10 min。用1% 封閉液與Alexa Flour 488 Donkey anti-Rabbit 二抗按照1:500 比例配置，避光孵育2 h，然后1:800比例將DAPI用1XPBS 稀釋，室溫孵育15 min，PBS漂洗3 遍，每次10 min，最后用抗猝滅甘油（Fluoromount-GTM）封片，熒光顯微鏡拍照。

3.2.5 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）

將各組大鼠血清在4℃下解凍，離心后取上清，按照相應試劑盒中提供的說明配制GST、T-SOD 和MDA的標準品和樣品，用酶標儀檢測OD 值及標準曲線，最后分別計算含量。

3.2.6 透射電子顯微鏡

用移液槍將預冷的的2.5%戊二醛（pH 7.4）固定液自耳蝸蝸尖灌注，將灌注后耳蝸置于2.5%戊二醛固定液中4℃固定24 h，37℃恒溫箱內脫鈣1 周，用顯微器械按照頂、中、底三段取下基底膜，PBS 漂洗3 次，用1%的鋨酸4℃固定2 h，梯度乙醇，丙酮脫水，將組織包埋在環氧樹脂中，進行超薄切片，切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙染色，染色后，使用日本透射電子顯微鏡（JEM-1400）拍照。

3.2.7 免疫印跡法（Western blotting）

首先，用剪刀剪開前庭，取出蝸軸和基底膜，稱取20 μg，用消毒的剪刀剪碎組織樣本，放入勻漿機內破碎耳蝸組織，加入250 μL 配制好的裂解液，冰上裂解10 min；4℃，12000 r·min-1離心30 min，取上清至新的離心管。然后根據BCA 試劑盒加入標準品及樣品，在酶標儀繪制標準曲線及加上樣緩沖液變性，計算最終蛋白上樣量。制備SDS-PAGE 凝膠、電泳、將凝膠轉移置PVDF 膜上、5%脫脂奶粉封閉1h、用Bcl-2（1:1,000）、Bax（1:1,000）和GAPDH（1:1,000）一抗在4℃冰箱中孵育過夜，利用HRP 標記的二抗在室溫孵育2 h，最后使用ECL 超敏發光液和成像系統對形成蛋白條帶的斑點進行定量，采用GAPDH 作為內參對照，對數據進行統一處理。

3.3 統計學方法

多個獨立樣本的數據采用均數±標準差表示，并使用SPSS25.0 軟件進行統計學分析,多組間進行單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05為差異有顯著性。

3.4 結果

3.4.1 銀杏葉提取物的活性成分

經TCMSP 數據庫初步檢索，共獲得307 個活性成分靶點，經過OB≥30%與DL≥0.18 篩選出銀杏葉有效成分，UniProt 靶點基因標準化及去重后，得到215 個靶點基因，應用Cytoscape3.8.2軟件構建銀杏葉藥物活性成分及潛在靶點網絡圖（圖2）

圖2 銀杏葉提取物活性成分-潛在靶點網絡圖

3.4.2 老年性聾的疾病靶點及PPI網絡構建

利用GeneCards 數據庫獲得與老年性聾匹配的靶點基因2713 個，根據中位數≥5.68 篩選出1358 個疾病靶點基因。Venny平臺輸入銀杏葉活性成分靶點基因及老年性聾靶點基因，最終得到二者共同基因及繪制Venny 圖（圖3），其中共同基因110 個。String 數據庫構建銀杏葉活性成分與老年性聾共有靶蛋白之間的PPI 網絡圖（圖4），該網絡圖包括110 個節點數，2020條邊線，節點表示蛋白，邊線表示蛋白間相互作用，邊線越粗，表明蛋白間相互作用越強。

圖3 銀杏葉提取物活性成分靶點與老年性聾靶點的Venny圖

圖4 銀杏葉活性成分與老年性聾共有靶蛋白之間的PPI網絡圖

3.4.3 靶點生物學功能富集分析

利用Metascape 數據庫對銀杏葉活性成分及老年性聾的110 個共同靶點基因進行功能富集分析，來獲得GO 和KEGG 數據。其中包含10 條BP、CC、MF 的GO 富集（圖5）。GO 富集結果發現生物過程主要與細胞衰老、細胞形態等相關；細胞成分與過氧化物酶體、谷氨酸突觸等相關；分子功能與氧化還原酶的活性、細胞外配體門控離子通道活性等相關。KEGG包含10條，其中凋亡與谷胱甘肽代謝顯著性較強（圖6）。

圖5 銀杏葉提取物的GO（BP、CC、MF三合一）富集分析圖

圖6 銀杏葉提取物KEGG 通路富集分析圖

3.4.4 疾病-靶點-通路

將篩選的10 條KEGG 運用Cytoscape3.8.2 軟件構建銀杏葉提取物防治老年性聾的疾病-靶點-通路網絡圖，結果顯示，與凋亡相關的靶點基因涉及到Bcl-2、Bax、AKT1、TNF 等；與谷胱甘肽代謝相關靶點基因涉及到：GSTP1、GSTM1等（圖7）。

圖7 疾病-靶點-通結果路網絡圖

3.4.5 免疫熒光染色耳蝸基底膜鋪片

免疫熒光染色耳蝸基底膜鋪片結果顯示，對照組的三排外毛細胞和一排內毛細胞均排列整齊，細胞質飽滿均一（圖8A）。模型組三排外毛細胞明顯缺失，內毛細胞干癟、萎縮（圖8B）。與模型組比較，銀杏葉提取物低、中、高劑量組毛細胞形態逐漸改善，外毛細胞缺失明顯降低（圖8C、圖8D、圖8E），內毛細胞胞漿逐漸變大，尤以高劑量組作用最明顯。

圖8 各組大鼠耳蝸中觀察毛細胞形態變化（×400，標尺：50 μm）

3.4.6 透射電子顯微鏡觀察耳蝸螺旋神經節細胞超微結構變化

透射電子顯微鏡結果顯示：對照組螺旋神經節細胞未見明顯改變，線粒體嵴排列整齊，髓鞘神經纖維完整（圖9A）；與對照組比較，模型組螺旋神經節細胞發生了嚴重破壞，線粒體空泡樣改變，腫脹，溶解，螺旋神經節細胞胞漿內大量脂褐素及溶酶體聚集，并出現“脫髓鞘樣”改變，線粒體嵴模糊不清（圖9B）；與模型組比較，銀杏葉提取物低劑量變化不明顯，中、高劑量組螺旋神經節細胞損傷逐漸改善，線粒體嵴逐漸恢復正常，脫髓鞘現象好轉，脂褐素及溶酶體數量降低（圖9C、圖9D、圖9E）。

圖9 螺旋神經節細胞線粒體超微結構（標尺1 μm）

3.4.7 各組大鼠血清中GST、T-SOD和MDA含量變化

與對照組比較，模型組GST 和T-SOD 含量顯著降低（P＜0.01），而MDA 含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組相比，經不同劑量銀杏葉提取物治療后，GST 和TSOD 含 量 逐 漸 提 高，MDA 含 量 顯 著 下 調（P＜0.05）（表1）。

表1 血清GST、T-SOD、MDA含量變化（n=6）

3.4.8 各組大鼠耳蝸組織Bcl-2、Bax 蛋白表達及Bcl-2/Bax比值變化

模型組Bcl-2 蛋白表達和Bcl-2/Bax 比值均明顯低于對照組（P＜0.01），Bax 蛋白表達高于對照組（P＜0.01）。與模型組對比，銀杏葉提取物低、中、高劑量各組Bcl-2 蛋白表達和Bcl-2/Bax 比值均顯著升高，而Bax 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）（圖10A、圖10B、圖10C）。

圖10 銀杏葉提取物對衰老大鼠Bax、Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值的影響

4 討論

老年性聾是最常見的慢性退行性疾病之一，是耳蝸老化、環境等多種因素、多個靶點共同作用的結果。老年性聾的發病機制仍不十分明確，細胞凋亡和氧化應激在其發生發展中起著關鍵的作用[12]。正常情況下，耳蝸螺旋神經節細胞線粒體產生的ROS、MDA 易被內源性抗氧化系統相關因子如SOD 和GST 等清除，從而維持內耳穩態。隨著年齡的增長，螺旋神經節細胞線粒體的抗氧化防御功能下調，SOD 和GST 活性顯著降低，而ROS聚集、MDA活性明顯升高，引起螺旋神經節細胞氧化損傷，螺旋神經節細胞纖維和韌帶與毛細胞連接，其進一步導致毛細胞丟失與變性[13]。另外，Bcl-2/Bax 信號通路是聯系螺旋神經節細胞線粒體內外凋亡途徑的重要橋梁，Bcl-2 蛋白家族主要包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，二者比值是決定螺旋神經節細胞活性以及毛細胞形態的關鍵因素。當Bcl-2 表達相對高于Bax 時，Bcl-2 可與促凋亡蛋白Bak1、Bax 等結合來抑制細胞凋亡；當Bax 表達相對高于Bcl-2 時，Bax/Bax 結合促進細胞凋亡[14]。在衰老的內耳組織中，螺旋神經節細胞超微結構破壞，線粒體氧化損傷誘導氧化呼吸鏈活性降低并使線粒體膜通透性升高，引起Bax 大量釋放，其抑制Bcl-2 的轉錄及功能，最終導致螺旋神經節細胞凋亡，進而加重毛細胞退變[15]。Falah 等[16]研究表明，老年性聾C57BL/6J 小鼠的Bak1/Bcl-2 比值顯著升高，且比值與聽力閾值呈正相關，而Bak1 基因缺失的C57BL/6J 小鼠即使在氧化應激條件下，也可減少細胞凋亡，減輕螺旋神經節細胞的損傷和毛細胞的丟失，從而延緩老年性聾的發病進程。因此，阻止或延緩內耳細胞氧化應激損傷和細胞凋亡可能是治療老年性聾的重要靶點。

迄今為止，臨床上對老年性聾的治療手段十分匱乏，研究發現鼓室內注射糖皮質激素對早期老年性聾患者具有一定療效，但該治療易導致鼓膜穿孔[17]；阿司匹林雖可延緩老年性聾聽力損傷，但由于其本身也具有一定的耳毒性，合適的藥物劑量很難把握，導致了臨床應用的局限性[18]；陳望燕等[19]研究發現，葛根素能改善老年性聾大鼠聽功能，然而其可致血液、消化、泌尿等多系統出現不良反應；耳聾左慈丸在治療老年性聾方面已被人們所熟知，但療效仍存在眾多爭議[20]。

既往研究已證實銀杏葉提取物可通過抗氧化、抗凋亡等作用治療內耳疾病，因此，通過對GO、KEGG 富集、疾病-靶點-通路圖分析，發現銀杏葉提取物治療老年性聾的潛在通路包括細胞凋亡通路和氧化應激相關的谷胱甘肽代謝通路，潛在靶點基因分別涉及Bcl-2、Bax、AKT1、TNF等和GSTP1、GSTM1等。

本研究選擇檢測GST、MDA 和T-SOD 等氧化應激相關因子，Bcl-2和Bax等凋亡相關蛋白進行驗證。模型組大鼠血清MDA 含量、Bax 蛋白均升高，GST、TSOD含量、Bcl-2蛋白和Bcl-2/Bax比值均降低，經不同劑量銀杏葉提取物治療后，發現GST、T-SOD 含量、Bcl-2 蛋白和Bcl-2/Bax 比值均顯著提高，而MDA 含量、Bax 蛋白均降低。同時通過免疫熒光染色和透射電子顯微鏡觀察毛細胞及螺旋神經節細胞變化情況，結果顯示，模型組毛細胞大量丟失，螺旋神經節細胞超微結構明顯破壞，而銀杏葉提取物治療后毛細胞及螺旋神經節細胞損傷逐漸改善。以上結果進一步證實銀杏葉提取物對老年性聾具有保護作用，其機制可能是銀杏葉提取物通過Bcl-2/Bax 信號通路來調控衰老耳蝸組織中Bcl-2、Bax 的表達，升高Bcl-2/Bax 比值，維持GST、MDA、T-SOD 等氧化/抗氧化平衡，減輕線粒體去極化，保護線粒體膜的穩定性，從而抑制毛細胞、螺旋神經節細胞及線粒體損傷，進而延緩聽力損失[21]。本研究與既往研究結果一致，Li 等[22]也認為銀杏葉提取物可通過Bcl-2/Bax 信號通路減輕氧化應激，抑制線粒體介導的Bax的激活，促進Bcl-2的表達，進而阻斷神經元細胞凋亡。本研究局限性在于，只進行體內動物實驗，未進行體外細胞實驗，也未在基因水平對Bcl-2、Bax、AKT1、TNF、GSTP1、GSTM1 等靶點基因的mRNA 進行驗證，這些將是我們今后研究的重點。

5 結論

綜上所述，我們使用網絡藥理學和動物實驗相結合的方法，突出了銀杏葉提取物對老年性聾的“多成分，多靶點，多通路”治療效果，該研究證實銀杏葉提取物可能通過Bcl-2/Bax 通路減輕耳蝸螺旋神經節細胞和毛細胞的凋亡和氧化應激來延緩聽力損失，但老年性聾的發病機制相對復雜，我們還需要更多基礎實驗從多層次來探討銀杏葉提取物保護內耳的潛在機制，從而為針對老年性聾多靶點藥物的設計與研發提供依據。