異綠原酸C大鼠體內代謝產物鑒定

鄧志鵬，張 喆，周紅燕，劉 謙，張永清，韓利文

（1. 山東中醫藥大學藥學院 濟南 250355；2. 山東第一醫科大學山東省醫學科學院藥物研究所 濟南 250062）

異綠原酸C（isochlorogenic acid C, 結構見圖1）又名4,5-二咖啡酰奎寧酸，是在一分子奎寧酸的基礎上引入了二個咖啡酰基結合而成的化合物，屬于二咖啡酰奎寧酸類。自然界中，忍冬科的金銀花、菊科的甜葉菊、蒼耳、燈盞細辛等多種藥用植物均含有異綠原酸類化合物，資源豐富[1]。近年來，國內外學者對異綠原酸類化合物進行了深入研究，在從植物中提取出異綠原酸成分的基礎上，對其生物活性、臨床價值以及應用前景進一步拓展研究，以便更好地造福人類[2-4]。研究表明，異綠原酸類化合物具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗癌、抗病毒等藥理作用，能顯著抑制HBV 的復制，具有保肝和免疫調節作用，并可改善乙型肝炎病毒引起的肝臟損傷，可用于治療肝炎[5]。臨床上，異綠原酸類化合物可用于降血脂、抗動脈粥樣硬化、抑制組胺釋放、抗纖維化、抑制平滑肌收縮、治療急性肺損傷，具有良好的應用前景[6-11]。此外，異綠原酸類化合物可發揮保護神經細胞、抗氧化、減輕自由基對生物膜的損傷等作用，用于腦中風等疾病治療[12-15]。

圖1 異綠原酸C化學結構

藥物經口服進入機體后，經過吸收、分布、代謝、排泄等過程，被血液運輸至作用部位，達到一定作用濃度后產生特征性藥理作用。異綠原酸C經灌胃進入大鼠體內經過吸收、分布之后，在代謝酶作用下異綠原酸C 化學結構發生改變，即發生代謝[16]，此過程既是藥物在機體最主要的消除方式，同時也是唯一導致外源性物質發生質變的過程。中藥成分的代謝主要發生在肝臟，藥物在肝臟部位經I 相和II 相代謝后得到易排除體外的代謝物，但也有部分藥物代謝發生在腎、脾、肺、皮膚等器官[17]，以及腸內[18]。

異綠原酸C 的生物利用度很低，但是其具有顯著的生物學活性，推測其活性成分可能為代謝產物[19]，經查閱文獻得知代謝物可能具有藥理活性、毒性或引起藥物與藥物間相互作用。研究表明，代謝產物的鑒定在藥物發現和開發階段具有重要指導作用[20,21]。本實驗為全面了解異綠原酸C 及其體內代謝情況，采用UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap MS 聯用技術，利用Wistar 大鼠動物體內模型，分析灌胃給藥異綠原酸C后，考察血漿、尿液與糞便中的異綠原酸C的代謝產物情況，并推測體內的代謝途徑，對于研究異綠原酸C作用機制具有重要參考價值，以及為研發新型藥物提供數據支持。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠5只，體質量：200±20 g，購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司，許可證號SCXK（魯）2019 0003。本研究獲得山東中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號IACUC20210407003）。

1.2 藥品和試劑

對照品異綠原酸C（批號Y-070-180515，純度≥98%）購自成都標純化植有限公司（成都，中國）。乙腈、甲純、甲酸均為色譜純，水為純凈水，其余試劑為分析純。

1.3 儀器

2.4.2 質譜條件

2 方法

2.1 藥物制備

精密稱取異綠原酸C 粉末適量，置于10 mL 量瓶中，加入適量0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶解，定容至刻度，配制成2.0 mg·mL-1異綠原酸C 溶液，供大鼠灌胃使用，其溶液現用現配。

2.2 樣品采集

2.2.1 血漿樣品的采集

將5 只雄性Wistar 大鼠作為給藥組，首先適應性飼養7 天（22±2℃），于實驗前禁食12 h，但自由飲水。給藥組按20 mg·kg-1劑量給予異綠原酸C 溶液，分別于給藥前及給藥后0.5、1、2、4、8 h 于大鼠眼眶靜脈叢取血，每次約0.5 mL，置于含有肝素鈉的離心管中，靜置15 min，然后在3000 rpm條件下離心10 min，取淡黃色上清液，于-20℃冷凍保存備用。

2.2.2 尿液樣品和糞便樣品的采集

雄性Wistar 大鼠5 只，適應性飼養1 周，將大鼠置于代謝籠中禁食12 h，自由飲水，收集空白尿液和空白糞便。大鼠灌胃給予異綠原酸C 后，收集0-12 h、12-24 h、24-48 h 的尿液及0-48 h 糞便。尿液合并后以3000 rpm 離心10 min，取上清液于-20℃冷凍保存備用。糞便合并后在低于50℃條件下烘干后碾碎，于離心管中在4℃保存備用。

2.3 樣品處理

分別取血漿200 μL、尿液樣品1 mL、糞便樣品（稱取糞便樣品200 mg，碾碎研磨，加入1 ml甲醇，超聲10 min 使其溶解，11000 rpm 離心5 min，取出上清液）1 mL，用8 倍量乙腈沉淀蛋白，在11000 rpm 離心10 min，取上清液，溫和的氮氣下吹干。殘渣中加入0.1%甲酸水溶液-乙腈（95:5,v/v）溶液100 μL 超聲溶解，離心后取樣進行分析。

2.4 樣品檢測

2.4.1 色譜條件

父母應該引導孩子不要非常強烈地在乎細節上的對和錯，因為對錯往往是相對的。對于孩子做的事情，父母也不要總用對錯來分析。

在小學語文的教學工作中，不僅僅只是老師與學生的事情，還是老師與老師的事情。所以在小學語文的教學以及管理上，教師之間要積極進行溝通與交流，這樣可以從中獲取一定的經驗，而且有利于提高教師的教育能力，加強師德建設。但是在現實教學中，很多教師都忽略了師師之間相互交流的重要性，在小學語文的教學中都是各顧各的，互相不交流經驗，生怕別人學去了一樣。這樣的現象是十分不利于師德建設工作的開展的，也在一定的程度上影響了教師的專業化發展。所以說在小學語文的教學中，教師不僅僅要注重教學質量，還要注重教師之間的交流，促進教師之間的共同進步。

3.1.3 代謝產物M2結構及代謝途徑推斷

Thermo Scientific 超高壓液相串接Q-Exactive Plus Orbitrap 高分辨質譜（美國Thermo Fisher 公司）；EL204電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sorvall Biofuge Stratos 高速冷凍離心機（中國賽默飛世爾科技有限公司）；WD-12氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

離子源為電噴霧離子化源；離子源溫度為320℃；電離源電壓為3.3 kV；檢測模式為負離子模式；掃描質量范圍為m/z50-1000；鞘氣為氮氣（純度＞99.99%），流速為45 Arb；輔助氣為氮氣（純度＞99.99%），流速為10 Arb。

2.5 數據采集與處理

血漿、尿液及糞便樣品預處理后，利用UPLC-QExactive Plus Orbitrap 高分辨質譜采集數據，并將數據導入Thermo Xcalibur Qual Browser 軟件，對數據進行色譜峰提取、質譜碎片離子峰匹配分析。

校企共同成立教學質量監控管理機構，負責教學質量保障體系的組織運行與實施、信息整理與反饋。依托網絡教學綜合服務平臺，建立持續改進的質量保障體系，深入推進教學模式、教學考核評價和資源體系改革，全面落實以學生為中心的個性化培養體系，真正實現“以學為主”的教學模式轉變。建立學業動態預警機制，讓學生能夠及時正視自身問題，分析并進行改正。通過畢業生就業發展跟蹤、用人單位反饋和第三方教育評估機構的人才培養質量年度報告，評估學生的職業能力與素質并及時反饋，確保人才培養質量的全面提高。

3 結果與分析

本實驗利用UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap-MS/MS 聯用技術分析生物樣品，基于不同基質樣品在負離子模式下的總離子流色譜圖和二級質譜提供的分子離子和碎片離子等精確信息（圖2-圖3），鑒定異綠原酸C在大鼠血漿、尿液、糞便中的代謝產物。根據原型化合物的裂解規律、相對保留時間、質譜數據以及結合文獻來推測代謝產物結構，在血漿、尿液、糞便中共檢測到包括原型在內的11 個成分，其中糞便（F）中發現原型（M0）外，還有4個代謝物（M1-M4）；尿液（U）中發現6 個代謝物（M5-M10）；在血漿中未發現代謝物，詳細信息見表1。其代謝途徑包括有水解、氧化、還原、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化。

在負離子模式下，檢測到M0 準分子離子峰m/z515.121 0([M-H]-，C25H23O12)，其相對保留時間為19.66 min。分子離子碎裂，產生m/z353.088 5 (C16H17O9)、191.055 7 (C7H11O6)、179. 034 6 (caffeoyl，C9H7O4)、173.054 0(C7H9O5)、135.044 2(C8H7O2)碎片離子。其中m/z353.088 5 是異綠原酸C 脫去1 分子咖啡酰基得到的碎片，m/z191.056 1 是異綠原酸C 脫去兩分子咖啡酰形成的奎寧酸負離子碎片，m/z179.034 6 是咖啡酰基的特征碎片，碎片離子m/z135.045 5 是咖啡酰基失去1 分子CO2所得。綜合保留時間以及二級質譜的碎片離子信息，確定化合物M0為異綠原酸C。

表1 異綠原酸C在大鼠糞便和尿液中的代謝產物匯總信息

圖2 空白和給藥大鼠糞便樣品在負離子模式下的色譜圖

圖3 空白和給藥大鼠尿液樣品在負離子模式下的色譜圖

3.1 大鼠糞便中的代謝產物

3.1.1 原型藥物M0質譜裂解途徑推斷

在21世紀的互聯網和人工智能新時代中，有關領導力的出版物不少，而《論領導力》一書是領導力學術界的一朵奇葩，讀此書的人對其評價是“喜歡其中的思想和醍醐灌頂的金句”。

“咬碎了牙齒怎么了呢？咬碎了牙齒和血吐。——老家就有這句話。”她說，“不管怎么說，我總算是憑自己的力量在風城買了房子啊。”

3.1.2 代謝產物M1結構及代謝途徑推斷

在負離子模式下，代謝產物M1 的tR為6.59 min，[M-H]-為m/z221.067 5（C8H13O7），產生m/z203.106 5、159.044 6、141.000 7、137.096 7 碎片離子。其中離子m/z221.067 5比奎寧酸（m/z191.056 1）多30 Da，推測其為C7H11O6+O+CH2，而二級碎片離子m/z203. 106 5比m/z221.067 5 少18 Da ,推測其為m/z221.067 5 失去1 分子H2O 產生的裂片。推測M1 代謝途徑為水解反應、單氧化反應、甲基化反應。

Thermo C18色譜柱（2.1 mm×100 mm, 1.9 μm）；流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫（0-2 min，3% A；2-24 min，3%→25% A；24-25 min，25%→95% A；25-27 min，95% A；27-27.1 min，95%→3%A；27.1-30 min，3% A）。進樣室溫度設置為10℃；柱溫為40℃；流速為0.4 mL·min-1；進樣體積為5 μL。

在負離子模式下，代謝產物M7 的tR為7.39 min，[M-H]-為m/z355.104 7（C16H19O9），得到m/z179.070 9、113.023 6 的碎片離子。其中m/z355.104 7 為異綠原酸C 脫去一個咖啡酰基并發生氫化還原反應的信號，m/z179.070 9 是咖啡酰基在負離子模式的特征信號，推測M7的代謝途徑為水解反應、氫化反應。

3.1.4 代謝產物M3結構及代謝途徑推斷

除了不喜歡人們潑水、扔石子，以及用竿子捅戳以外，明尼對人類并沒有真正的惡感。但此刻它的眼中滿是寒光，滿腔冰冷的恨意全集中在了眼前這個男人身上。這是從古老濕地的深處挖掘出來的、久被遺忘的來自爬行動物的恨意，這股恨意匯聚成了鋒利的目光。將漁線緊拉在船舷上的男人感受到了這道目光古怪的力量，心里有點發毛。這雙充滿敵意的眼睛正一眨不眨地死死地盯著他！

在負離子模式下，代謝產物M3 的tR為11.30 min，[M-H]-為m/z367.101 7（C17H19O9），產生m/z193.0502、178.062 3、134.063 6 碎片離子。其中m/z367.101 7 比m/z353.087 8 多14 Da，推測其為m/z353.087 8 發生甲基化反應產生的信號，m/z193.050 2 為咖啡酰甲基化產生的信號（C10H9O4），推測M3為異綠原酸C水解脫去一個咖啡酰基同時發生甲基化反應的產物，其代謝途徑為水解反應、甲基化反應。

3.1.5 代謝產物M4結構及代謝途徑推斷

體驗式教學法，是指在教學過程中為了達到既定的教學目的，從教學需要出發，引入、創造或創設與教學內容相適應的具體情境或氛圍，以引起學生的情感體驗，幫助學生迅速而正確地理解教學內容，促進他們心理機能全面和諧發展的一種教學方法。體驗式教學法使學生身臨其境或如臨其境，一則帶給學生從形象的感知到抽象的理性的頓悟，二則激發學生的學習興趣和學習情緒，使學習活動成為自主自發的活動。同時，在教學實踐中，體驗式教學法在英語閱讀課、寫作課研究相對較多，而將其運用到語法課研究的則比較少。[1]

五要著力搞好協調配合。水利財務工作涉及水利各個領域，貫穿各個環節，必須加強協調，形成合力。要建立與各有關部門的溝通協調機制，形成相互理解、相互支持的工作氛圍，爭取更多有利于水利改革發展的政策措施。要加強內部上下級之間和部門之間的溝通配合，建立工作信息通報和反饋機制，密切配合，良性互動，切實提高工作水平。

在負離子模式下，代謝產物M4 的tR為14.78 min，[M-H]-為m/z367.104 6（C17H19O7），產生m/z193.050 3、173.044 9、93.033 5 碎片離子。其中m/z367.104 6 為m/z353.087 8 發生甲基化反應產生的信號，m/z193.050 3 為咖啡酰甲基化產生的信號（C10H9O4）；m/z173.044 9 為m/z191.056 1（C7H11O6）脫去一分子H2O 產生的信號，推測M4為異綠原酸C水解脫去一個咖啡酰基同時發生甲基化反應的產物，其代謝途徑為水解反應、甲基化反應。

水利工程的建設，積極推進全面質量管理，采用先進的質量管理模式和管理手段，科學技術和先進的施工技術的推廣，利用科學的方法和科技的力量降低工程的材料成本，提高工程質量。施工企業要實施全面質量管理，建立健全質量保證體系，制定和完善崗位質量標準、質量責任和考核辦法，實施質量責任制。在施工過程中加強質量檢查工作，認真落實“三項制度”，全過程的控制，對項目的質量，關系到企業的前途和命運，是水利水電施工企業基于國內外市場抓住關鍵。

3.2 大鼠尿液中的代謝產物

3.2.1 代謝產物M5結構及代謝途徑推斷

在負離子模式下，代謝產物M5 的tR為8.47 min，[M-H]-為m/z237.061 9（C8H13O8），產生m/z195.113 7、165.057 6（C9H10O3）、149.096 5、121.048 2 的碎片離子，推測M5 的代謝途徑為水解反應、雙氧化反應、甲基化反應。

3.2.2 代謝產物M6結構及代謝途徑推斷

膠原蛋白是動物體內含量最豐富的蛋白質，占人體皮膚蛋白質的70%。在真皮層中，膠原蛋白與其他物質形成網狀結構，有助于皮膚穩定結構、強度、彈性。目前關于口服膠原蛋白肽改善皮膚的研究很多，結果發現口服膠原蛋白肽具有改善皮膚狀況、減少皺紋、提高皮膚水分、修復光損傷皮膚、延緩衰老等功能[2]。其機理主要是攝入膠原蛋白肽后，能夠提高皮膚中膠原蛋白表達，降低基質金屬蛋白酶2的活性[3]，以特異性蛋白的方式影響成纖維細胞的增殖和膠原纖維的形成[4]。

在負離子模式下，代謝產物M6 的tR為6.26 min，[M-H]-為m/z271.011 6（C7H11O9S），產生m/z191.054 2、161.034 7、96.958 9的碎片離子。其中m/z191.054 2（C7H11O6）為m/z271.011 1脫去一分子SO3，即奎寧酸的特征信號；m/z161.034 7為咖啡酰基的特征碎片，即咖啡酸（C9H7O4）脫去一分子H2O 產生的信號，推測M6 的代謝途徑為水解反應、硫酸酯化反應。

3.2.3 代謝產物M7結構及代謝途徑推斷

在負離子模式下，代謝產物M2 的tR為3.60 min，[M-H]-為m/z237.060 8（C8H13O8），產生m/z193.069 6、137.043 5 的碎片離子。其中離子m/z237.060 8 比奎寧酸（m/z191. 056 1）多46 Da，推測其為C7H11O6+2O+CH2，推測M2 的代謝途徑為水解反應、雙氧化反應、甲基化反應。

3.2.4 代謝產物M8結構及代謝途徑推斷

在負離子模式下，代謝產物M8 的tR為13.81 min，[M-H]-為m/z355.103 1（C16H19O9），產生m/z179.070 9、113.023 6 的碎片離子。其中m/z355.103 1 為異綠原酸C 酸脫去一個咖啡酰基并發生氫化還原反應的信號，m/z179.070 9（C9H7O4）是咖啡酰基在負離子模式的特征信號，推測M8 的代謝途徑為水解反應、氫化反應。

(3)凈化過濾機。本項目通過消化、吸收、再創新，解決了通常管式過濾器鋼襯膠骨架橡膠層彈性收縮易開裂等腐蝕問題，使得骨架壽命由半年左右延長至5年多，管式過濾器運行狀況良好，綜合性能指標大幅提升。其他類型過濾機各項技術指標良好，運行正常。

3.2.5 代謝產物M9結構及代謝途徑推斷

（1）假設數據集的維數為d，SU={u1，u2，…，u2d}為沒有鄰近稠密網格的稀疏網格單元，計算各網格的重心點坐標 gi|i=1，2，…，2d；

在負離子模式下，代謝產物M9 的tR為3.87 min，[M-H]-為m/z435.061 6（C16H19O12S），產生m/z355.105 7、191.055 3、173.045 3、113.023 4、96.956 0 碎片離子。其中m/z435.061 6 為m/z353.087 8+2H+SO3產生的信號，m/z355.105 7 為m/z435.061 6 脫去一分子SO3產生的信號，m/z191.055 3（C7H11O6）是奎寧酸在負離子模式的特征信號，m/z173.045 3 為奎寧酸脫去一分子H2O 產生的信號，推測M9 的代謝途徑為水解反應、氫化反應、硫酸酯化反應。

3.2.6 代謝產物M10結構及代謝途徑推斷

在負離子模式下，代謝產物M10 的tR為7.75 min，[M-H]-為m/z529.120 4（C22H25O15），產生m/z353.088 6、179.034 7、135.043 8 碎片離子。其中m/z529.120 4 為m/z353.088 6 與一分子葡萄糖醛酸結合產生的信號，m/z353.088 6（C16H17O9）為異綠原酸C 脫去一個咖啡酰基產生的信號，m/z179.034 7（C9H7O4）是咖啡酰基在負離子模式的特征信號，m/z135.043 8 為咖啡酰基脫去一分子CO2產生的信號，推測M10 為異綠原酸C 水解脫去一個咖啡酰基并與葡萄糖醛酸結合生成的產物，其代謝途徑為水解反應、葡萄糖醛酸化反應。

3.3 異綠原酸C大鼠體內的代謝途徑分析

異綠原酸C經灌胃給藥后在大鼠體內的代謝途徑主要有水解、甲基化、氧化、還原、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化等（圖4）。異綠原酸C（C25H24O12，m/z515.121 0）進入大鼠體內后，首先水解脫去一個咖啡酰基形成單咖啡酰基奎寧酸（m/z353.087 8，C16H18O9），該中間體可以發生甲基化反應形成代謝產物M3 和M4（m/z367.101 7,C17H19O9）、氫化還原形成代謝產物M7 和M8（m/z355.103 5,C16H20O9）、氫化和硫酸酯化反應形成代謝產物M9（m/z435.061 6, C16H19O12S）、葡萄糖醛酸化反應生成代謝產物M10（m/z529.120 4,C22H25O15）。此外，異綠原酸C 進入大鼠體內后也可水解脫去二個咖啡酰基形成奎寧酸中間體（m/z191.055 7,C7H11O6），該中間體可以發生單氧化和甲基化反應形成代謝產物M1（m/z221.067 5,C8H13O7）、雙氧化和甲基化反應形成代謝產物M2 和M5（m/z237.060 8,C8H13O8）、硫酸酯化反應形成代謝產物M6（m/z271.011 6,C7H11O9S）。

圖4 異綠原酸C大鼠體內代謝途徑推測

4 討論與結論

生物樣品組成比較復雜，尤其蛋白質會嚴重影響分離效果以及待測物的離子化效率。因此生物樣品的預處理在樣品分析過程中極為重要[22-23]。測定血漿樣品前，需去除蛋白質，預防發生乳化，影響質譜儀器的信號響應，延長其使用壽命。LC-MS 技術兼具有色譜和波譜兩者優勢，分離度好、適用范圍廣、靈敏度高、分析時間短，可從大量混合物中分離出單一成分進而獲得單一成分的質譜信息，且樣品不需要進行衍生化處理，依靠高分辨質譜給出的一級和二級質譜的精確數據，推斷化合物結構。高分辨率質譜具有分離度好、靈敏度高、檢測范圍寬的特點，液質聯用技術在藥物代謝產物鑒定應用方面發揮了重大作用[24-26]。

本實驗采用UPLC-Q-Exactive Plus Orbitrap MS 技術檢測異綠原酸C 在大鼠血漿、糞便、尿液中的代謝物，然后利用Thermo Xcalibur Qual Browser 軟件分析色譜峰，確證代謝產物。大鼠經灌胃給藥后，異綠原酸C經小腸吸收入血后隨血液循環分布到機體的各個器官發揮治療作用。此外，藥物的首過效應、溶解性、溶出度及生理因素等也會影響藥物在體內的吸收[27]。中藥體內代謝產物的結構鑒定是中藥代謝研究的基礎部分，不僅能為臨床安全用藥提供參考，還可用于指導藥物結構修飾，為新的藥物分子設計提供理論依據。

根據異綠原酸C 具有多個酚羥基、酯鍵和羧基的結構特點和詹美榕等[19]研究實驗結果得到的代謝產物表明異綠原酸C 在體內能發生酯鍵水解、有甲基化反應、水合反應、去水合反應、還原反應、葡萄糖醛酸化反應、硫酸酯化反應等。詹美榕等研究在大鼠血漿中發現多個代謝產物，但在本實驗測定中未發現血漿代謝產物，究其原因我們實驗選擇單次給藥（給藥劑量20 mg·kg-1），而文獻報道[19]采用連續7 天灌胃給予藥物（給藥劑量20 mg·kg-1，每天1 次），連續給藥也許導致大鼠體內代謝酶發生改變，并且會產生代謝產物的富集從而導致血漿中代謝產物的不同。本實驗開展大鼠血漿、尿液、糞便代謝產物的鑒定，可以更全面地了解不同生物基質中異綠原酸C 的可能代謝產物，后期還可以采用大鼠膽管插管模型（BDC）進行研究，探討其膽汁排泄產物。