男性不育患者精子頂體酶活性、精子DNA碎片指數與精液質量參數相關性

蘭貴斌， 梁林慧， 余 飛， 黃承樂， 馮國鋼， 黃敏玉

1.百色市人民醫院 檢驗科，廣西 百色 533000；2.右江民族醫學院附屬醫院 泌尿外科，廣西 百色 533000

世界范圍內，不孕不育發生率在逐步升高[1-3]。有研究認為，50%及以上的不孕不育歸因于男性，且與精子質量、數量等因素相關[4-5]。精子濃度、活性及形態等多項指標可評估男性精子質量[6]。2014年，《WHO人類精液檢查及處理實驗室檢驗手冊(第5版)》發行增加了生化指標，如頂體酶活性，豐富了精子質量研究的內容[7]。但由于主客觀因素，精子質量參數無法得到統一的參考指標，這為各參數標準的設置提供了挑戰。有研究認為，DNA碎片指數(DNA fragmentation index，DFI)異常會影響男性正常生育能力，主要與精子、胚胎發育能力降低有關[8]。另有研究發現，DFI測量值與男性不孕不育存在一定的相關性，可作為男性生育的預測指標[9]。精子頂體酶是參與男性頂體反應的重要蛋白水解酶，其活性大小影響受精成功率，精子頂體酶活性降低會引起精子活性能力降低，精子畸形率升高[10-11]。然而，目前研究DFI、精子頂體酶活性與男性精子質量參數的內容較為單一，主要集中于濃度及形態學[12]，無法深層剖析DFI、精子頂體酶活性在男性生殖中的診斷價值。本研究旨在探討DFI、精子頂體酶活性與精子質量參數間的相關性。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集自2019年1月至2021年12月于百色市人民醫院及右江民族醫學院附屬醫院就診的153例男性不育患者的精液樣本。患者年齡22～43歲，平均年齡(33.70±7.87)歲；婚后2年及以上正常性生活無生育子女。納入標準：(1)無外傷史；(2)無家族遺傳病史；(3)無明顯睪丸、輸精管異常發育；(4)無生殖系統炎癥。排除標準：(1)嚴重高血壓、糖尿病史；(2)存在生育障礙史。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 患者禁欲3～7 d后采用手淫方式獲得精液，存于Eppendoorf管內，置于37℃水浴箱15～30 min或室溫1 h至完全液化，未液化的可適當延長液化時間。

1.2.2 精子頂體酶活性測量 采用改良的Kennedy方法測量精子頂體酶活性，具體步驟：測定管和對照管均加入2×106～10×106個精子(少于250 μl)，常溫條件下2 000 r/min離心20 min，棄管內精漿后加入100 μl A液吹打混勻；隨后對照管加入100 μl C液；測定管和對照管均加入1 ml E液，24℃孵育1 h；測定管加入100 μl C液，常溫條件下2 000 r/min離心15 min，取上清。在410 nm波長處用紫外分光光度計測量OD值。測量值≥48.2 μIU/106個精子為活性正常，測量值<48.2 μIU/106個精子為活性異常[13]。將患者分別納入頂體酶活性正常組與頂體酶活性異常組。

1.2.3 精子DFI測量 采用吖啶橙染色法測量精子DFI。使用試劑A液稀釋精子濃度至2×106～3×106個/ml，隨后將樣本加入至流式細胞儀小管中，加入試劑A液50 μl，輕輕混勻，然后加入試劑B液100 μl，輕輕混勻30 s，立即加入試劑C液300 μl，輕輕混勻，隨后上流式細胞儀檢測(488 nm激發光)。DFI<30%為檢測正常，DFI≥30%為檢測異常[14]。將患者分別納入DFI正常組與DFI異常組。

1.2.4 精液質量參數分析 采用全自動精子分析儀測量精子總數、精子濃度、活動率、a+b級活動力等指標，采用Diff-Quik染色法進行精子形態學(畸形率)分析[15]。液化時間≤60 min為液化完全；活動率≥40%為正常；a+b級活動力≥50%為正常；精子畸形指數(TERATOZOOSPERMIA INDEX，TZI)正常范圍為1～3。

2 結果

2.1 不同頂體酶活性患者精液質量參數比較 頂體酶活性正常組精子濃度、活動率、a+b級活動力均高于頂體酶活性異常組，TZI、液化時間低于頂體酶活性異常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同頂體酶活性患者精液質量參數比較

2.2 不同DFI患者精液質量參數比較 DFI異常組精子濃度、活動率、a+b級活動力低于DFI正常組，TZI、液化時間高于DFI正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同DFI患者精液質量參數比較

2.3 相關性分析 Pearson線性相關結果顯示，頂體酶活性與精子總數、精子濃度、a+b級活動力呈正相關(r=0.128、0.289、0.284，P<0.05)，與TZI、DFI呈負相關(r=-0.058、-0.248，P<0.05)；DFI與精子濃度、a+b級活動力、頂體酶活性呈負相關(r=-0.582、-0.374、-0.248，P<0.05)，與TZI呈正相關(r=0.128，P<0.05)。

3 討論

男性不育主要與精液異常相關。常見的精液質量分析方法為顯微鏡觀察，但由于存在主觀因素誤差，該方法觀察各種指標無法統一量化[16]。因此，為男性精液質量評估尋找可靠的實驗方法尤為重要。精子頂體酶是以酶原形式合成并儲存的一種胰蛋白酶，主要位于精子頂部。頂體酶釋放可為精卵結合提供有利條件，頂體酶活性降低會阻礙精子順利穿透卵細胞透明帶，引起男性不育[17-18]。本研究結果顯示，頂體酶活性異常組精子濃度降低，與程玲等[19]研究結果相似，這可能與頂體酶活性改變DFI有關，畸形精子數量增加，可用于繁殖的精子濃度降低，從而降低生育概率[20]。

本研究發現，精子頂體酶活性異常者精子活動率及a+b級活動力明顯降低，與劉洋[21]研究結果相似。但Raad等[22]研究認為，頂體酶活性僅與a+b級活動力相關，與本研究結果存在差異，可能與本研究納入患者較少有關，需要進一步分析。a+b級活動力是指前進精子的總量，可用于判斷精子的活性[23]。沈麗燕等[24]研究認為，頂體酶活性降低會影響精子穿透膜的能力，精子運動能力減弱，a+b級活動力也同步降低。本研究發現，DFI異常(即升高)可增加TZI，即增加精子畸形率，從而降低男性生育率，與朱元等[25]研究結果一致，分析原因為DFI異常使精子完整性降低，因此TZI增加；DFI異常者液化時間延長，與朱佳等[26]研究結果一致，這可能是DFI增加使精子完整性減弱，進而影響精囊分泌一系列生理因子，如凝固因子、纖維蛋白溶解酶等。值得注意的是，DFI異常雖會增加精子液化時間，但數值仍在正常參考范圍內(≤60 min)，提示DFI延長精子液化時間可能非男性不育的重要原因。

相關性分析結果顯示，頂體酶活性與精子濃度呈正相關，提示頂體酶活性會影響精子的生成狀態。此外，本研究還發現，頂體酶活性與a+b級活動力呈正相關，表明頂體酶活性對于精子向前運動尤為重要。本研究對DFI與男性精子質量各參數進行相關性分析結果顯示，DFI與精子濃度相關性最強(r=-0.582)，可能原因為DFI過高從而使精子結構異常，影響了其正常的存活率，精子濃度下降[27]。此外，本研究還發現，DFI與a+b級活動力呈負相關(r=-0.374)，且兩者相關性強度大于頂體酶活性與a+b級活動力，提示DFI可能相較于頂體酶活性更能預測精子質量。值得注意的是，頂體酶活性與DFI也呈一定的負相關關系，提示DFI與頂體酶活性聯合預測男性生殖能力可靠性更高。

綜上所述，DFI、頂體酶活性可反映精子濃度、運動能力及完整性，兩者可作為靈敏的生化指標預測男性不育，為男性生育能力研究提供理論依據。