芪黃湯對免疫性血小板減少癥小鼠作用機制研究

周 林， 禹 紅， 萬 敏， 劉毓玲， 段 波， 王進軍

武漢市中醫醫院 1.檢驗科；2.風濕血液病科，湖北 武漢 430050

免疫性血小板減少癥(immune thrombopenia，ITP)是以皮膚黏膜出血、外周血小板水平降低等為臨床表現的一種自身免疫性疾病[1]，其發病機制主要與血小板自身抗原免疫耐受性缺失有關。自身抗原免疫耐受缺失使體液免疫和細胞免疫被異常激活，導致血小板生成不足及破壞加速[2]。ITP治療的目的在于使血小板計數(platelet count，PLT)維持在安全水平內，控制出血，阻止血小板過度破壞并促進血小板生成[3]。芪黃湯是武漢市中醫醫院萬遠鐵教授的臨床經驗方，此方經多年實踐證明具有顯著治療ITP的臨床療效。本研究旨在探討芪黃湯對ITP模型小鼠的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Balb/C小鼠90只，雌雄各半，體質量18～22 g，7～8周齡，由武漢華聯科生物技術有限公司提供，使用許可證號：SYXK(鄂)2018-0104。豚鼠25只，雌性，體質量240～260 g，12周齡，由興平市天瑞實驗動物養殖場提供，使用許可證號：SYXK(鄂)2017-0065。

1.2 試劑與儀器 芪黃湯：生地黃15 g，熟地黃15 g，枸杞子15 g，山萸肉12 g，菟絲子15 g，女貞子15 g，旱蓮草15 g，黃芪15 g，太子參15 g，茯苓15 g，蔻仁12 g，山藥18 g(由武漢市中醫醫院藥學部提供)，水煮濃縮至2 g/ml。醋酸潑尼松片由山東魯抗醫藥集團賽特有限公司生產，國藥準字：H20033023，生產批號：190713。用生理鹽水將潑尼松粉末配置成混懸液(濃度為0.72 g/L)，置于4℃冰箱冷藏備用。磷酸鹽緩沖液(貨號P4417)、不完全弗氏佐劑(FICA，貨號F5506)、完全弗氏佐劑(FCA，貨號F5881)購自Sigma公司；FITC anti-mouse CD4(貨號102348)、FITC anti-mouse CD8a(貨號101428)、PE anti-mouse CD279(PD-1，貨號135206)、PE anti-mouse CD274(PD-L1，貨號102298)購自Biolegend公司。HEMAVET 950FS動物血液分析儀(美國Drew)；FACS Calibur流式細胞儀(美國BD)。

1.3 研究方法

1.3.1 豚鼠抗小鼠血小板血清制備 取10只Balb/C小鼠，麻醉后提取抗凝全血，階梯式離心獲取血小板(分別以1 000 r/min、3 000 r/min離心10 min，半徑為6 cm)，用磷酸鹽緩沖液調整濃度為2.5×106個/ml，分別與等量的FCA和FICA混合作為抗原，于造模第0周注射含FCA抗原1 ml，注射于豚鼠的足掌、背部、腹部皮下等至少6點，每點100 μl；于第1、2、4周注射含FICA抗原，方法同上。第5周取豚鼠心臟未抗凝全血，離心后分離血清，得到豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)，-20℃冷凍保存備用。使用前制備Balb/C小鼠5%紅細胞懸液吸附2次，檢驗抗體效價，稀釋成最佳濃度待用。

1.3.2 實驗分組 取剩余Balb/C小鼠80只，適應性喂養1周后，按隨機數字表法將小鼠分為正常組、模型組、潑尼松組、芪黃湯組，每組各20只。模型組、潑尼松組、芪黃湯組均用GP-APS建立ITP模型。具體方法：正常組以100 μl/20 g生理鹽水進行腹腔注射，模型組、潑尼松組、芪黃湯組以100 μl/20 g的GP-APS進行腹腔注射，隔日1次，共8次。PLT在原始水平的11%～25%提示ITP動物模型造模成功[4]。造模成功第5天開始灌胃給藥，正常組、模型組用生理鹽水0.2 ml灌胃；潑尼松組用生理鹽水制成的潑尼松混懸液0.2 ml灌胃；芪黃湯組用芪黃湯0.2 ml灌胃。每組均1次/d，連續灌胃10 d。

1.4 觀察指標 眼球摘除法取血，EDTA-Na2抗凝管、動物血液分析儀檢測小鼠PLT，流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞CD4+、CD8+、CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+表達。處死小鼠，快速剝離股骨，用6號針頭以1 ml生理鹽水沖出骨髓，置于EDTA-Na2抗凝管內，制成骨髓細胞懸液，采用動物血液分析儀檢測骨髓有核細胞數量[5]。剖腹取脾，稱重。

脾指數=脾重/體質量

2 結果

2.1 各組PLT、骨髓有核細胞、脾指數比較 與正常組比較，模型組、芪黃湯組、潑尼松組的PLT、骨髓有核細胞降低，脾指數升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，芪黃湯組、潑尼松組的PLT、骨髓有核細胞升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組PLT、骨髓有核細胞、脾指數比較

2.2 各組外周血淋巴細胞亞群表達比較 與正常組比較，模型組小鼠外周血CD8+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達升高，CD4+表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，波尼松組、芪黃湯組小鼠外周血CD8+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達降低，CD4+表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組外周血淋巴細胞亞群表達比較

3 討論

ITP是一種自身免疫性血液病，可能的發病機制包括機體免疫耐受失衡，細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導的血小板破壞，骨髓巨核細胞發育成熟障礙，以及血小板生成減少[5-6]。免疫反應包括抗原提呈細胞、T細胞和B細胞間的相互作用，自身反應性T細胞對血小板自身抗原缺失耐受，通過T細胞受體識別血小板抗原。活化的T細胞不僅激活B細胞導致自身抗體產生，還促進細胞因子的生成和CTL的活化。PD-1(CD279)是一種Ⅰ型跨膜蛋白受體，屬于免疫球蛋白CD28家族，在多種免疫細胞中表達，對維持淋巴細胞穩態起關鍵作用；PD-1的配體PD-L1(CD274)是Ⅰ型跨膜蛋白受體B7家族的成員，廣泛表達于T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、間充質干細胞、骨髓來源的肥大細胞和一些非造血細胞[7-8]。PD-1/PD-L1在T細胞成熟、分化和增殖過程中能夠提供負性共刺激信號，在機體免疫功能異常亢進時代償性分泌增多，參與多種自身免疫性疾病的發生發展[9-10]。

中醫認為，ITP歸屬于“血證”“紫斑”等范疇，將其命名為“紫癜病”，多由外感及內傷所致，外感風熱毒邪等因素，因實致虛，內傷則為脾不統血，氣不攝血，致臟腑氣血虧虛，兩者共同導致血不循經，血溢脈外，出現紫斑，因此應以益氣養血、健脾補腎為治療原則。芪黃湯中，生地黃清熱涼血，養陰生津；熟地黃養血滋陰，益精填髓；枸杞平補肝腎、滋補強壯；山萸肉滋肝補腎、益氣血；菟絲子為補腎、肝、脾之良藥；女貞子養陰益腎，補氣舒肝；旱蓮草補益肝腎，涼血止血；黃芪補氣健脾，太子參補益脾肺，益氣生津，配伍黃芪，補益之效大增；茯苓、蔻仁、山藥可健脾和胃，全方共奏益氣養血，健脾補腎之效[11]。現代藥理研究發現，地黃含有糖類、氨基酸、苯乙醇苷類等多種成分，具有抗衰老、抗氧化、增強免疫力等作用。地黃多糖能夠誘導脾淋巴細胞增殖，調節T淋巴細胞，發揮免疫調節作用，還能夠抑制免疫抑制模型小鼠單核細胞吞噬功能，提高PLT[12]。黃芪有增強機體免疫、抗應激、降壓等作用，其主要成分黃芪多糖可提高T淋巴細胞，促進淋巴細胞轉化，增強機體對干擾素的誘生，具有雙向調節免疫功能的作用[13]。黃芪和生地黃配伍，清熱涼血、益氣扶正，可抑制體液免疫亢進，調節T細胞亞群失衡，糾正免疫紊亂[14]。

本研究發現，與正常組比較，模型組小鼠外周血CD8+表達升高，CD4+表達降低，提示ITP小鼠外周血CD8+T細胞活性更高。CD4+T細胞免疫調節方式主要通過調節細胞對抗原的反應及分泌相關細胞因子實現；而ITP患者中的CD8+T細胞在體外可以直接破壞血小板，經治療后緩解的ITP患者CD8+T細胞在體外破壞血小板的能力則明顯下降[15]。有研究發現，某些自身免疫疾病的外周血CD4+T淋巴細胞表面PD-1升高，且與疾病的活動度可能相關[16]。此外，新發ITP患者CD4+T淋巴細胞表面PD-1升高，且PD-1/PD-L1升高與ITP患者疾病活動程度有一定關系[17]。本研究結果顯示，模型組小鼠外周血CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+均較正常組升高，而CD8+PD-1+、CD8+PD-L1+與正常組無差異，提示異常的CD4+T細胞PD-1/PD-L1負性刺激通路可能參與ITP的發病過程，是自身免疫系統的一種保護機制，發揮免疫抑制反應作用。

自身反應性T細胞通過T細胞受體識別血小板抗原并被激活，不僅可以上調活化T細胞的PD-1+表達，還可以促進Th1炎性細胞因子的分泌，從而進一步提高活化T細胞上PD-1+的表達[18]。本研究中，正常組T細胞因不能識別血小板抗原而被激活，CD4+T細胞上的PD-1+、 PD-L1+表達較模型組明顯呈現低水平狀態，保持機體正常的免疫功能；芪黃湯組和潑尼松組PLT、骨髓有核細胞高于模型組，而脾指數無明顯差異，提示芪黃湯和潑尼松具有同樣良好的治療效果，但均不能控制脾增大；芪黃湯組小鼠外周血CD4+、CD8+、CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達低于模型組，提示芪黃湯可能通過調節CD4+、CD8+T淋巴細胞降低機體細胞免疫功能亢進，CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達降低提示負性調節的自身保護機制也趨于平衡，最終達到免疫平衡，進而改善病情。

綜上所述，芪黃湯可顯著提高ITP模型小鼠PLT、骨髓有核細胞數，其機制可能與降低CD4+、CD8+T淋巴細胞表達，抑制T細胞活化和增殖，調節CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+表達平衡有關。