不同毒力副豬嗜血桿菌生物被膜形成能力及特性

趙瑞利 ， 曾 君 ， 于恩遠 ， 榮睿璠 ， 王心如 ， 李 穎 ， 張東超 ， 武瑋卓 ， 張 清 ， 孫英峰

(1.天津農學院動物科學與動物醫學學院天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室 ， 天津 西青 300392 ；2. 天津市動物疫病預防控制中心 ， 天津 北辰 300402)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis, HPS)是一種革蘭陰性短小桿菌，生長時嚴格需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或V因子，有15個以上血清分型[1]。臨床引起以多發性纖維素性漿膜炎和關節炎為特征的豬格氏病(Glasser's disease)，呈世界性分布。Ni 等于2020 年綜合分析了5 個國內外數據庫中關于 HPS 血清流行病學及病原流行病學的數據，結果顯示，2005—2019年HPS在我國豬群中的綜合平均陽性率約為27.8%， 2011—2015年綜合平均陽性率高達41.0%[2]。豬格氏病無季節性，且全年齡段的豬均易感，呈地方流行性，我國以5 型(26.6%)、4 型(22.4%)、7 型(9.1%)、13 型(6.3%)、12 型(5.6%)和未分型(8.4%) HPS菌株為優勢流行血清型[3]。

細菌生物被膜(Biofilm)是細菌及其分泌的糖、蛋白質和核酸等多種基質組成的細菌群落，是造成病原細菌抵御不良生存環境、持續性感染、毒力和耐藥性的重要原因之一[4]。細菌生物被膜基質由復雜的胞外聚合物(Extracellular polymer substances，EPS)構成，包括胞外多糖、蛋白質、胞外DNA (eDNA)和胞外 RNA (eRNA)。黏附素CdrA和凝集素LecB等主要的結構蛋白通過影響多糖的定位和聚集，從而增加了生物被膜結構支架的強度，能固定生物被膜中的微生物群落，維持一系列高度復雜的動態變化[5]。胞外聚合物在生物被膜結構和功能方面均發揮重要作用，包括表面黏附、空間和化學異質性、生物被膜毒力構成，可減弱抗菌劑的影響并促進細胞間相互作用，從而增強生物被膜中細胞的代謝能力和耐藥性[6]。

本試驗以不同毒力HPS的生物被膜形成能力差異為切入點，探究生物被膜動態形成過程、被膜基因含量與表型的相關性、胞外多糖含量、對宿主細胞黏附性和耐藥情況分析，為深入研究不同毒力HPS與生物被膜形成能力和相關特性研究，以及臨床副豬嗜血桿菌病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和細胞 副豬嗜血桿菌血清型4型(HPS-4)、5型(HPS-5)地方分離株，由吉林大學惠贈；副豬嗜血桿菌血清型7型(HPS-7)、未分型(HPS-NT)菌株和豬腎上皮細胞(PK-15)，由天津農學院獸醫學實驗室保存。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、胎牛血清、氧化型輔酶Ⅰ、結晶紫染液、磷酸鹽緩沖液(PBS)和雙抗溶液，均購自北京索萊寶科技有限公司；巧克力平板培養基，購自北京陸橋技術股份有限公司；脫纖綿羊血，購自天津晟佰昊生物技術有限公司；Taq酶和PCR反應溶液，均購自高良生物醫藥科技(北京)有限公司；抗菌藥藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；三氯乙酸、胰蛋白酶和DMEM培養基，均購自賽默飛世爾科技有限公司。本試驗所用引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，信息見表1。

表1 本試驗所用引物信息[7-8]Table 1 Primers used in this study

1.3 主要儀器 恒溫培養箱，上海福瑪實驗設備有限公司；顯微鏡，尼康映像儀器銷售(中國)有限公司；普通PCR儀、iMax酶標儀和凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌分離與鑒定 將病料接種于巧克力平板，置于37 ℃含5%CO2的培養箱中培養16～24 h。挑取疑似HPS的單菌落涂布于TSA固體培養基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，37 ℃含5% CO2的培養箱中培養16～24 h[9]，革蘭染色、鏡檢。

1.4.2 HPS血清型的鑒定 挑取分離純化后的單菌落洗脫于含100 μL無菌水(60 ℃預熱)的EP管中懸浮，渦旋后沸水浴10 min，凍融1次后，10 000 r/min離心2 min，取上清液為PCR模板[10]。PCR擴增體系(25 μL)：模板5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，Taq酶 0.5μL，上、下游引物各 1 μL，ddH2O 13 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min； 94 ℃變性 30 s，退火溫度(根據引物Tm值確定)退火30 s， 72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃結束反應。

1.4.3 藥敏試驗 利用K-B 紙片擴散法檢測不同血清型分離菌株對常見14種抗菌藥的敏感性。將純化后的HPS培養至對數中期，菌液均勻涂布于TSA固體培養基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)，將藥敏紙片平整地貼在平板上，37 ℃倒置培養18～24 h，測定抑菌圈直徑并參照參考文獻[11]進行統計分析。

1.4.4 結晶紫法檢測HPS生物被膜動態形成過程 將對數培養的副豬嗜血桿菌用TSB液體培養基(含5%胎牛血清和0.1%NAD)稀釋至OD值為0.02，每孔菌液200 μL，每種血清型24個重復，37 ℃進行生物被膜形成培養。分別在第12、24、36、48、60、72、84小時和第96小時取不同血清型培養物3個重復吸除菌液，用磷酸鹽緩沖液200 μL洗2次，風干；甲醇200 μL固定15 min，風干；0.1%結晶紫溶液200 μL染色10 min，風干；95%乙醇200 μL溶解色素后，酶標儀檢測630 nm吸光度值。取各血清型OD630nm平均值繪制生物被膜形成曲線[12]。

1.4.5 HPS胞外多糖含量的測定 標準曲線的制定：葡萄糖標準溶液：準確稱取干燥葡萄糖1 g溶解于1 L超純水中，使其終濃度為1 mg/mL。取干凈的玻璃試管按表2配置溶液，在不同濃度的葡萄糖標準溶液中，加6%苯酚溶液1 mL，然后快速加濃硫酸5 mL，在90～95 ℃水浴20 min 并冷卻，紫外分光光度計測量490 nm吸光度值，根據吸光度值繪制標準曲線[13]。

表2 葡萄糖溶液標準曲線繪制所用溶液Table 2 Reagents used for drawing the standard curve of glucose solution (mL)

樣品測定采用苯酚-硫酸法，操作方法同標準曲線制定，挑取純化的單菌落于TSB液體培養基(含5%胎牛血清和 0.1% NAD)中，37 ℃、180 r/min搖床振蕩過夜培養，取菌液2.5 mL于50 mL液體培養基再次于37 ℃、180 r/min搖床振蕩培養 18～24 h。取若干菌液置于水浴鍋95 ℃作用5 min ，去除酶活性，10 000 r/min 離心20 min，取上清液；加4%(w/v)的三氯乙酸振蕩20 min后靜置40 min，12 000 r/min 離心30 min ，取上清液；將收集的上清液中加入3倍體積的95%乙醇，4 ℃過夜；12 000 r/min離心15 min，去上清液，沉淀用錫箔紙封口扎小孔，冷凍干燥24 h，得到細菌胞外多糖。稱取干燥的不同毒力副豬嗜血桿菌胞外多糖1 mg溶于1 mL超純水中，加入6%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL上下輕柔顛倒混勻使之充分反應，90～95 ℃水浴20 min，靜置至室溫后用紫外分光光度計檢測490 nm吸光度值，設3次重復取平均值，并依據標準曲線一次方程計算胞外多糖含量[14]。

1.4.6 被膜基因數量的檢測 采用PCR方法檢測被膜基因，PCR模板制作、PCR擴增體系和PCR擴增程序參考1.4.2，PCR引物信息見表1。

1.4.7 細胞黏附試驗 將5×105個PK-15接種于24孔細胞培養板中，每孔含10%熱滅活胎牛血清的DMEM培養基200 μL。細胞在37 ℃、5%CO2的濕式培養箱中培養24 h至細胞生長到100% 融合后，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，感染約1×107CFU的HPS。培養板在37 ℃孵育最多2 h，以允許細菌黏附。細胞用磷酸鹽緩沖液洗滌5次以消除未黏附細菌，然后加入0.25%胰蛋白酶100 μL在37 ℃孵育10 min。孵育結束后，將細胞從每個孔底重新懸浮。將貼壁細菌的細胞懸液稀釋10倍，平鋪于TSA固體培養基(含5%胎牛血清和0.1% NAD)上37 ℃培養12 h進行菌落計數,計算黏附率[15-16]。

黏附率/%=(黏附細胞細菌數/添加細菌數)×100%

1.5 數據統計分析 采用SPSS 21.0軟件對試驗結果進行統計分析，采用方差分析和t檢驗進行分析比較數據，數據用平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 細菌分離與鑒定 純化的HPS培養20 h后在固體培養基上呈表面光滑、無色透明的小菌落(圖1)，為革蘭陰性短桿菌(圖2)。

圖1 副豬嗜血桿菌的TSA瓊脂平板培養Fig.1 TSA AGAR plate culture ofHaemophilus parasuis

圖2 副豬嗜血桿菌革蘭染色 (1 000×)Fig.2 Gram staining of Haemophilus parasuis (1 000×)

2.2 HPS血清型的鑒定 通過HPS 16S rRNA 和各血清型特異性引物進行PCR擴增，得到大小為821 bp的16S rRNA、320 bp的血清型4型wciP基因、450 bp的血清型5型wcwK基因、490 bp的血清型7型funQ基因的特異性條帶(圖3和圖4)，與預期的片段大小相符。

圖3 副豬嗜血桿菌血清型4、5、7的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of Haemophilus parasuis serotypes 4, 5 and 7M：DL-2 000 DNA相對分子質量標準; 1、3、5: 陽性對照; 2: wciP基因片段; 4: wcwK基因片段; 6: funQ基因片段M： DL-2 000 DNA Marker; 1,3,5: Positive control; 2: wciP gene fragment; 4: wcwK gene fragment; 6: funQ gene fragment

圖4 副豬嗜血桿菌未分型菌株血清型的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of the unclassified Haemophilus parasuis strainsM：DL-2 000 DNA相對分子質量標準; 1: funB基因片段; 2: wzx基因片段; 3: glyC基因片段; 4: wciP基因片段; 5: wcwK基因片段; 6: gltI基因片段; 7: funQ基因片段; 8: scdA基因片段; 9: funV基因片段; 10: funX基因片段; 11: amtA基因片段; 12: gltP基因片段; 13: funAB基因片段; 14: funI基因片段; 15: 陽性對照M：DL-2 000 DNA Marker; 1: funB gene fragment; 2: wzx gene fragment; 3: glyC gene fragment; 4: wciP gene fragment; 5: wcwK gene fragment; 6: gltI gene fragment; 7: funQ gene fragment; 8: scdA gene fragment; 9: funV gene fragment; 10: funX gene fragment; 11: amtA gene fragment; 12: gltP gene fragment; 13: funAB gene fragment; 14: funI gene fragment; 15: Positive control

2.3 藥敏試驗 由表3可知，HPS-4僅對四環素、頭孢噻肟、林可霉素、多西環素耐藥，其余均敏感或中等耐藥；HPS-7僅對林可霉素耐藥；HPS-5對測試抗生素均敏感；HPS-NT僅對多西環素敏感，耐藥性強且主要集中在β-內酰胺類、氨基糖苷類藥物。

表3 不同毒力副豬嗜血桿菌的藥敏試驗Table 3 Drug sensitivity testing of Haemophilus parasuis of varying virulence

2.4 生物被膜動態形成過程 不同毒力HPS生物被膜形成曲線結果見圖5，各血清型HPS在培養36 h后生物被膜含量開始明顯增多，特別是微菌落形成階段(48～60 h)和生物被膜成熟階段(60～72 h)增加顯著，并且第60小時和第72小時之間生物被膜含量呈極顯著差異(P<0.01)。在72 h時生物被膜形成量達到峰值，隨后減少，生物被膜逐漸消散。在生物被膜形成過程中，強毒菌株(HPS-5)的生物被膜形成量在36 h后始終多于中等毒力菌株(HPS-4)、無毒型菌株(HPS-7)和未分型菌株(HPS-NT)。但在細菌初始黏附階段(0～24 h)、生物被膜黏附階段(24～48 h)，無毒型菌株(HPS-7)生物被膜形成量多于中等毒力菌株(HPS-4)。在生物被膜散播期(72～96 h)，不同毒力HPS生物被膜量均減少，并且第72小時和第84小時之間生物被膜含量減少呈極顯著差異(P<0.01)，第84小時后四者差異不顯著(P>0.05)。

圖5 不同毒力副豬嗜血桿菌的生物被膜形成Fig.5 Biofilm formation of Haemophilus parasuis of varying virulence** ：P<0.01，差異極顯著** ：P<0.01，extremely significant difference

2.5 胞外多糖含量測定 葡萄糖標準曲線制作結果見圖6，線性回歸方程：y=0.609 3x-0.011 4，R2=0.998 8表明線性關系良好。不同毒力HPS胞外多糖含量測定結果表明：中等毒力菌株(HPS-4)胞外多糖含量最多，為0.929 6，強毒株(HPS-5)胞外多糖含量最少，為0.854 1，但差異不顯著(P>0.05)。

圖6 葡萄糖標準曲線Fig.6 Standard curve of glucose

2.6 生物被膜相關基因檢測 通過PCR檢測生物被膜相關基因，擴增得到675 bp的CRP基因、650 bp的LuxS基因、100 bp的LpxM基因、1 400 bp的qseC基因的特異性條帶(圖7和圖8)，與預期片段大小相符。中等毒力菌株(HPS-4)被膜基因CRP、LpxM呈陽性；強毒株(HPS-5)被膜基因LpxM、LuxS、qseC呈陽性；無毒型菌株(HPS-7)被膜基因LpxM呈陽性；未分型菌株(HPS-NT)被膜基因LpxM、CRP呈陽性。

圖7 副豬嗜血桿菌血清型4、5、7被膜基因的PCR檢測Fig.7 PCR detection of envelope genes of Haemophilus parasuis serotypes 4, 5 and 7M：DL-2 000 DNA相對分子質量標準; 1: 陽性對照; 2～5: HPS-4 CRP、LuxS、LpxM、qseC基因片段; 6～9: HPS-5 CRP、LuxS、LpxM、qseC基因片段; 10～13: HPS-7 CRP、LuxS、LpxM、qseC基因片段M：DL-2 000 DNA Marker; 1: Positive control; 2-5: CRP、LuxS、LpxM、qseC gene fragment of HPS-4; 6-9: CRP、LuxS、LpxM、qseC gene fragment of HPS-5; 10-13: CRP、LuxS、LpxM、qseC gene fragment of HPS-7

圖8 未分型副豬嗜血桿菌被膜基因的PCR檢測Fig.8 PCR detection of envelope genes of unclassified Haemophilus parasuis M：DL-2 000 DNA相對分子質量標準; 1: 陽性對照; 2: LuxS基因片段; 3: qseC基因片段; 4: LpxM基因片段; 5: CRP基因片段M：DL-2 000 DNA Marker; 1: Positive control; 2: LuxS gene fragment; 3: qseC gene fragment; 4: LpxM gene fragment; 5: CRP gene fragment

2.7 細胞黏附試驗 各血清型HPS黏附PK-15細胞后菌落計數和黏附率見圖9，中等毒力菌株(HPS-4)菌落計數為2.63×106CFU/mL，細胞黏附率為26.3%；強毒菌株(HPS-5)菌落計數為3.00×106CFU/mL，細胞黏附率為30.0%；無毒型菌株(HPS-7)菌落計數為2.39×106CFU/mL，細胞黏附率為23.6%；未分型菌株(HPS-NT)菌落計數為2.20×106CFU/mL，細胞黏附率為22.0%。結果表明，強毒和中等毒力HPS對宿主細胞黏附能力更強。副豬嗜血桿菌黏附細胞的能力與該細菌毒力呈正相關。

圖9 不同血清型HPS對PK-15黏附率Fig.9 Adhesion rates of different HPS serotypes to PK-15

3 討論

細菌生物被膜(Bacterial biofilm，BF)是指細菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質、纖維蛋白、脂質蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣物[4]。生物被膜對細菌黏附、定殖和侵襲宿主細胞過程中至關重要，臨床約 80%的慢性感染性疾病與細菌生物被膜有關[17]。不同細菌生物被膜形成能力與其毒力是否呈正相關結論不一致[18-19]，本試驗HPS-5強毒株生物被膜形成能力最強。本試驗中強毒菌株(HPS-5)對宿主細胞黏附率為30.0%，中等毒力菌株(HPS-4)為26.3%，無毒型菌株(HPS-7)為23.6%,未分型菌株(HPS-NT)為22.0%，結果表明，毒力越強對宿主細胞黏附能力越強，更有利于細菌定植。生物被膜形成是一個復雜而有規律的動態過程，包括細菌起始黏附期、生物被膜黏附期、生長期、成熟期和播散期5個階段[20]。本試驗結果顯示，不同毒力副豬嗜血桿菌在培養36 h后生物被膜含量開始明顯增多，并且第60小時和第72小時之間生物被膜含量呈極顯著差異(P<0.01)。在生物被膜散播期(72～96 h)不同毒力HPS生物被膜量均減少，并且第72小時和第84小時之間生物被膜含量減少呈極顯著差異(P<0.01)，第84小時后四者差異不顯著(P>0.05)。由此推測，由于起始黏附、黏附階段是可逆的，抗菌藥物在黏附階段對細菌的抑制效果相對較好，播散期后可適當延長用藥期或聯合用藥加強清除生物被膜。

微菌落形成是起始吸附階段進入生物被膜成熟階段經歷的過渡期，胞外多糖是這一過程中必不可少的物質，其含量多少與生物被膜形成量和黏附、侵入黏膜上皮細胞有關[21]。成熟生物被膜中形成的胞外多糖可使用酶或其他抑菌劑降解，破壞基質的物理完整性，促進生物被膜的破壞和清除[22]。使用糖苷水解酶 PslG 靶向分解胞外聚合物中的胞外多糖，在體外可破壞銅綠假單胞菌的成熟生物被膜[23]。胞外多糖降解酶可作為常規抗菌劑的輔助劑，增強藥物滲透性和微生物殺滅活性[24]。本試驗中中等毒力菌株(HPS-4)胞外多糖含量最多，強毒株(HPS-5)胞外多糖含量最少，但兩者差異不顯著(P>0.05)，與預期生物被膜形成能力越強胞外多糖含量越高不符，可能與細菌生物被膜的形成不僅受到外界因素的影響，同時也受細菌自身基因的調控有關[25]。本試驗中中等毒力菌株(HPS-4)有2個被膜基因呈陽性；強毒株(HPS-5)有3個被膜基因呈陽性；無毒型菌株(HPS-7)有1個被膜基因呈陽性；未分型菌株(HPS-NT)有2個被膜基因呈陽性，結合基因數量和被膜形成量以及毒力來看，生物被膜形成量與被膜基因數量相關，但與文獻報道弱毒株比強毒株生物被膜形成量多這一觀點不相符，可能與研究菌株來源不同有關，因為生物被膜形成是細菌適應環境保護機制，不同區域HPS生長環境不同，形成生物被膜的能力就有所區別。

生物被膜的形成降低了細菌對抗菌藥的敏感性，與游離菌相比，其耐藥性提高10～1 000倍，微菌落進一步發展并分泌胞外基質，形成具有不同三維結構的成熟生物被膜，這個階段內的生物被膜對藥物、紫外線等抗性最強[26]，是引起臨床上細菌性疾病難以治療的主要原因之一。HPS-4對常見14種抗菌藥耐藥率為28.6%， 而HPS-5的敏感性為100%，這可能是不同地區豬場用藥情況不同導致的。其中，中等毒力菌株(HPS-4)來源于吉林省，耐抗生素種類較多，集中于廣譜殺菌、抑菌藥，為避免耐藥性的產生和水平傳播，應及時調整更換抗菌藥或用抗菌肽等生物活性物質替抗。