磁性微球免疫層析試紙快速檢測牛奶中恩諾沙星和環丙沙星

劉 暢 ， 楊琳燕 ， 張 偉 ， 宋翠平 ， 趙思俊 ， 李道穩 ， 李留安 ， 王宏宇 ， 李 存

(1. 天津農學院動物科學與動物醫學學院 天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室 ， 天津 西青 300392 ；2. 中國動物衛生與流行病學中心 ， 山東 青島 266032)

恩諾沙星屬于氟喹諾酮類藥物，是動物專用的抗菌藥，環丙沙星是恩諾沙星的主要代謝產物，二者的結構如圖1所示[1-3]。恩諾沙星的抗菌譜廣，在畜禽和水產養殖中應用廣泛[4-5]，但藥物不規范使用造成的食品、環境中的藥物殘留可能引起消費者的胃腸道反應、過敏反應或其他毒性作用，而且會增強病原菌的耐藥性，嚴重影響動物疾病的防治和食品的安全[6-9]。因此，亟需建立一種簡便、準確的分析食品中恩諾沙星殘留的方法。

圖1 恩諾沙星(A)和環丙沙星(B)的化學結構[1-3]Fig.1 Chemical structure of enrofloxacin (A) and ciprofloxacin (B)[1-3]

20世紀70年代，Faulk等開創了膠體金在免疫分析領域應用的先河，之后有學者將此方法應用到人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)的檢測，膠體金免疫層析技術逐漸發展起來[10]。近年來，磁性微球作為一種新型標志物受到越來越廣泛的關注。磁性微球常以Fe3O4作為磁性內核，但Fe3O4容易被氧化為Fe2O3，變為褐色或紅棕色。氧化程度不同的磁性微球，其顏色存在差異。磁性微球具有理想標志物應有的許多特征，能夠通過簡單的手段與生物分子形成穩定的結合物，適用于多種待測物的分析檢測，并且存在技術上的潛在革新。修飾后的磁性微球對待測物表現出良好的吸附性能，能夠滿足待測物的檢測需要[11-12]。陳璐萍等[12]建立了一種磁性免疫層析試紙條，通過單純的肉眼觀察即可實現哈維弧菌的檢測。

因此，本試驗旨在以磁性微球為標志物，以競爭性反應原理為基礎，建立一種磁性微球免疫層析試紙，用于快速檢測牛奶中的恩諾沙星和環丙沙星。

1 材料與方法

1.1 材料與設備 恩諾沙星(98.5%)和環丙沙星(92.3%)，均購自Dr. Ehrensorfer GmbH (Augsburg,Germany); 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、吐溫-20和BCA蛋白濃度測定試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司(中國，北京)；抗喹諾酮類單克隆抗體和山羊抗小鼠IgG，均購自北京維德維康生物科技有限公司(中國，北京)；羧基化的磁性微球，購自佰邁格生物技術有限公司(中國，無錫)。

NC膜(Vivid 90)、共軛墊(GL-0194)、樣品墊(GL-b02)、吸水墊和聚氯乙烯(Polyvinyl chloride，PVC)底板，均購自上海杰一生物科技有限公司(中國，上海)；噴金劃膜儀(HGS510)和可編程切條機(HGS201)，均購自杭州峰航科技有限公司(中國，杭州)。

1.2 磁性微球標記抗體的制備 本試驗選擇了表面含有羧基的磁性微球，參照參考文獻[13-14]中的方法用EDC活化并偶聯抗體。分別使用10、20、40 μg和60 μg的抗體進行偶聯，對抗體的用量進行優化。首先，取400 μL 磁性微球，用2-(N-嗎啉)乙磺酸[2-(N-morpholine) ethanesulfonic acid，MES] 緩沖液洗滌3次，在外磁場的作用下分離，棄去上清液。加入5 mg/mL EDC和10 mg/mL NHS，在30 ℃ 180 r/min的條件下活化25 min。活化完成后，用磷酸鈉溶液(0.15 mol/L，pH 7.2)洗滌2次，去除未反應的EDC和NHS。隨后快速加入一定量的單抗，在30 ℃ 180 r/min的條件下反應，使抗體與磁性微球偶聯。反應2～4 h后，將上清液轉移到干凈的離心管中用于計算偶聯率，用終濃度2%的BSA封閉30 min，PBST(0.01 mol/L，pH 7.2，含0.05%吐溫-20)洗滌3次，最后用PBS(0.01 mol/L，含0.3% BSA和0.01% NaN3)復溶，4 ℃保存備用。用BCA蛋白濃度測定試劑盒分別測定偶聯前后單抗溶液的濃度，按公式(1)計算偶聯率，從而確定單抗是否成功地與磁性微球偶聯，并確定最適的抗體用量。

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1.3 磁性微球免疫層析試紙的構建和條件優化 首先，對抗原的包被濃度進行優化。NC膜上羊抗鼠IgG的包被濃度固定為0.8 mg/mL，抗原的濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL，以1 μL/cm的速度分別劃線，45 ℃鼓風干燥2 h。磁性微球標記抗體用BS緩沖液(0.05 mol/L，pH 9.0，含10%蔗糖、5%海藻糖、0.1%PVP、1%吐溫-20和2%NaCl)稀釋后分配到共軛墊上，25 ℃干燥30 min。樣品墊用PB緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4，含0.1%PVP和4%吐溫-20)浸泡處理1 h，37 ℃環境下干燥[15-18]。之后將NC膜、共軛墊、樣品墊和吸水紙按照次序依次組裝到PVC底板上。切成3 mm寬的條狀，密封保存，備用。

隨后，對羊抗鼠IgG的包被濃度進行優化。在最適的抗原包被濃度下，將羊抗鼠IgG的包被濃度分別設置為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL，以1 μL/cm的速度分別劃線，45 ℃干燥2 h。磁性微球標記抗體用BS緩沖液(0.05 mol/L，pH 9.0，含10%蔗糖、5%海藻糖、0.1%PVP、1%吐溫-20和2%NaCl)稀釋后分配到共軛墊上，25 ℃干燥30 min。樣品墊用PB緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4，含0.1%PVP和4%吐溫-20)浸泡處理1 h，37 ℃環境下干燥。之后將NC膜、共軛墊、樣品墊和吸水紙按照次序依次組裝到PVC底板上。切成3 mm寬的條狀，密封保存，備用。通過上述方法選擇最適的抗原和羊抗鼠IgG包被濃度，構建磁性微球免疫層析試紙并進行后續試驗。

1.4 方法性能分析

1.4.1 靈敏度和基質耐受性分析 用0.02 mol/L PB緩沖液(pH 7.4)和基質添加標準溶液驗證該方法的靈敏度和基質耐受性[19]。取10 mg的恩諾沙星和環丙沙星標準品，分別配成100 μg/mL的高濃度儲備液，置于4 ℃保存。分析前用0.02 mol/L PB緩沖液(pH 7.4)將高濃度儲備液依次稀釋至0.5、1、2、5、10、20 ng/mL和50 ng/mL的工作濃度。

牛奶樣品購自當地超市，經超高效液相色譜-串聯質譜法(Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)分析不含待測物。牛奶用4 mL酸化乙腈提取，8 000 g離心10 min，將上清液轉移至干凈的離心管中，加入4 mL正己烷除脂。50 ℃旋轉蒸發至近干，少量乙腈復溶，用0.02 mol/L PB緩沖液(pH 7.4)稀釋10倍[20]。在處理后的牛奶樣品中分別添加終濃度為0.5、1、2、5、10、20 ng/mL和50 ng/mL的待測藥物。

用磁性微球免疫層析試紙對上述2種溶液進行測定，用Image J軟件(Version 1.52v)分析試紙顏色強度的變化，記錄檢測線(Test line,T線)和質控線(Control line,C線)的顏色強度的比值隨待測藥物濃度的變化趨勢，并以T/C值為縱坐標，藥物濃度的log函數為橫坐標，擬合標準曲線，得到對應的線性方程[21]。計算陰性樣本T/C信號的平均值加上2倍標準差對應的目標分析物的濃度，將該濃度定義為本方法的檢測限[16]。

1.4.2 添加回收率的計算 在牛奶樣品中分別添加一定量的恩諾沙星和環丙沙星，之后按照1.4.1中的方法，用酸化乙腈和正己烷進行預處理，并使稀釋后恩諾沙星和環丙沙星的終濃度分別為2、5 ng/mL和10 ng/mL。用磁性微球免疫層析試紙進行分析，計算添加回收率。

1.4.3 交叉反應性分析 對氟甲喹、諾氟沙星、沙拉沙星進行分析，評價該方法對其他藥物的交叉反應性。取上述藥物的標準溶液，用0.02 mol/L PB緩沖液稀釋至0.5、1、2、5、10、20 ng/mL和50 ng/mL，用磁性微球免疫層析試紙進行測定。根據顏色強度和濃度的關系，擬合標準曲線并計算各個藥物的半抑制濃度(Half-inhibitory concentration，IC50),按公式(2)計算交叉反應率(Cross reactivity，CR)。

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2 結果

2.1 磁性微球標記抗體的鑒定與抗體用量的優化 用BCA蛋白濃度測定試劑盒分別測定偶聯前和偶聯后單抗溶液的濃度，采用OriginPro 2017軟件對數據進行統計學分析，與偶聯前相比，偶聯后的溶液中單抗含量顯著降低(P<0.05)，說明單抗已經偶聯到磁性微球表面。

為了確定磁性微球與抗體的最佳投料比，本試驗對比了抗體的用量為10、20、40 μg和60 μg時對應的偶聯率和實際參與偶聯的抗體的量，結果見圖2。偶聯率隨單抗濃度的增加而下降；偶聯到磁性微球表面的單抗的量在40 μg時達到最大，為24.73 μg，單抗的添加量增加至60 μg時，偶聯到磁性微球表面的抗體反而減少，為19.97 μg。因此，在后續的試驗中，添加40 μg抗體與磁性微球偶聯。

圖2 單抗在磁性微球表面的偶聯率與偶聯抗體量的關系Fig.2 Relationship between quantity and coupling rate of monoclonal antibody to magnetic microspheres

2.2 磁性微球免疫層析試紙的構建和條件優化 NC膜上不同包被濃度的抗原對結果的影響見圖3A。抗原濃度較低時，隨著抗原濃度的增大，T線顏色逐漸加深，到0.8 mg/mL時T線顏色最深；繼續增大抗原濃度至1 mg/mL，T線顏色不再加深。因此，確定0.8 mg/mL為最適的抗原包被濃度。

羊抗鼠IgG的包被濃度對結果的影響見圖3B。隨著羊抗鼠IgG濃度的增大，C線顏色逐漸加深，在0.8 mg/mL時C線與T線的顏色強度相當。如果C線上羊抗鼠IgG的包被濃度偏高，會抑制T線的顯色。因此，確定0.8 mg/mL為最適的羊抗鼠IgG包被濃度。

圖3 免疫層析試紙條件優化Fig.3 Optimization of magnetic microsphere immunochromatography test strip conditionA：T線上抗原包被濃度的優化； B：C線上羊抗鼠IgG包被濃度的優化A: Optimization of antigen coating concentration on T line; B: Optimization of goat-anti-mouse coating concentration IgG on C line

2.3 方法性能分析

2.3.1 靈敏度和基質耐受性分析 恩諾沙星和環丙沙星的T/C值隨濃度的變化趨勢如圖4A和圖4B所示，曲線呈倒S形，T/C值隨濃度的升高而降低。在0.5～20 ng/mL范圍內，恩諾沙星和環丙沙星的T/C值與濃度的log函數之間表現出相關性，標準曲線見圖4C，其中恩諾沙星的線性方程為y=1.122 9-0.791 1×log(c恩諾沙星+1)，R2=0.998 2，環丙沙星的線性方程為y=1.135 1-0.883 0×log(c環丙沙星+1)，R2=0.958 9。本試驗將陰性樣本T/C信號的平均值加上2倍標準差對應的目標分析物的濃度定義為方法的檢測限。計算出恩諾沙星的檢測限為0.37 ng/mL，環丙沙星的檢測限為0.23 ng/mL。

圖4 恩諾沙星和環丙沙星的T/C值隨濃度的變化曲線及標準曲線Fig.4 Tendency of T/C values with concentration and standard curves of enrofloxacin and ciprofloxacin

基質添加標準曲線與PB緩沖液稀釋的標準曲線的相關性分析見圖5，二者具有較好的相關性(恩諾沙星和環丙沙星對應的R2分別為0.995 1和0.999 9)，說明該方法對基質的耐受性較好。

圖5 PB緩沖液和基質添加標準溶液分析恩諾沙星(A)和環丙沙星(B)的相關性Fig.5 Correlation between PB buffer and matrix spiked standard solution of enrofloxacin (A) and ciprofloxacin (B)

2.3.2 添加回收率的計算 牛奶樣品中成分復雜，有必要在檢測前對牛奶樣品進行預處理。分析前對樣品進行恰當的預處理能幫助除去樣品基質中的待測物，降低復雜成分對結果的干擾。本方法依次對低、中、高3個水平的藥物進行了分析，添加回收率見表1。該方法對恩諾沙星的回收率為14.63%～30.56%，對環丙沙星的回收率在19.65%～49.81%。

表1 磁性微球免疫層析試紙對恩諾沙星和環丙沙星的添加回收率Table 1 Spiked recovery of enrofloxacin and ciprofloxacin by magnetic immunochromatography test strip

2.3.3 交叉反應性分析 幾種喹諾酮類藥物的IC50和CR見表2。磁性微球免疫層析試紙對氟甲喹和諾氟沙星的IC50分別為3.03 ng/mL和3.33 ng/mL，CR分別為141.13%和128.66%。對于沙拉沙星的反應交叉率較低，僅為23.21%。

表2 磁性微球免疫層析試紙對幾種喹諾酮類藥物的交叉反應率Table 2 Cross reactivity of magnetic microsphere immunochromatographic test strip for several quinolones

3 討論

本試驗基于間接競爭的原理，將藥物分子與NC膜上的包被抗原競爭結合標記抗體，因此NC膜上的信號強度與待測物含量成反比，通過記錄NC膜表面的顏色強度并進行灰度分析，對溶液中的恩諾沙星或環丙沙星進行定量檢測。這種方法比肉眼觀察更靈敏，結果更客觀，但基于可見光的分析方法一般只能采集NC膜表面(約10 μm厚)的信號。另一方面，該磁性微球免疫層析試紙還可以根據磁信號進行分析，磁信號屬于穿透信號，磁信號分析設備可以處理整個NC膜厚度的磁信號[19]，能夠滿足高靈敏度和定量檢測的需求。但目前商品化的磁信號分析設備仍不普遍，磁信號分析設備的便攜性和成本限制了定量設備的推廣和應用；而且免疫層析方法的變異系數較大，這也給定量分析增加了難度。

本試驗用磁性微球作為信號標志物構建了一種免疫層析快速檢測試紙，該試紙能夠對喹諾酮類藥物進行定性，或者對某種已知的喹諾酮類藥物進行定量分析。該方法對于牛奶中恩諾沙星和環丙沙星的檢測限分別為0.37 ng/mL和0.23 ng/mL。同時該方法表現出較好的基質耐受性，基質添加溶液與標準溶液具有較高的相關性，添加回收率的范圍在14.63%～49.81%。該磁性微球免疫層析試紙可推廣到動物性食品中其他獸藥、毒素或致病菌的測定，為食品質量安全提供有力的技術支撐。