南疆與北疆代表性規(guī)模化豬場沙門菌耐藥性的比較分析

軒慧勇 ， 陳月月 ， 易海波 ， 徐琦琦 ， 秦 蕾 ， 吳慧敏 ， 夏利寧

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 新疆 烏魯木齊 830052 ； 2. 新疆霍城縣職業(yè)技術(shù)學(xué)校 ， 新疆 霍城 835200 ；3. 新疆昭蘇縣喀夏加爾鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 ， 新疆 昭蘇 835618)

沙門菌(Salmonella)是腸桿菌科沙門菌屬的兼性厭氧革蘭陰性菌，是一種可以在人畜之間直接或間接傳播的重要人獸共患病原菌[1]，其宿主廣泛，而豬和雞是沙門菌的主要儲存宿主[2]。目前，抗菌藥物是治療細菌性疾病的重要手段之一，但隨著抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致耐藥沙門菌甚至是多重耐藥沙門菌的出現(xiàn)[3]。耐藥沙門菌可作為攜帶耐藥質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子等可轉(zhuǎn)移元件的供體菌，將耐藥基因轉(zhuǎn)移到其他細菌宿主的基因組或質(zhì)粒中，促進更具毒性和耐藥性的分離株出現(xiàn)[4-5]，導(dǎo)致更難以治療的感染發(fā)生，阻礙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的同時也對公共衛(wèi)生健康造成嚴重威脅。新疆地域遼闊，有南疆和北疆之分，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，細菌耐藥問題也凸顯出來，但有關(guān)新疆不同地域沙門菌耐藥現(xiàn)狀的研究報道較少，因此有必要針對不同地區(qū)開展沙門菌耐藥性調(diào)查，以給予豬場用藥指導(dǎo)。本試驗選取新疆南北疆代表性地區(qū)焉耆縣和石河子市豬場分離的豬源沙門菌，比較其對12種抗菌藥物的耐藥表型，分析其耐藥基因型的差異，結(jié)合藥敏試驗結(jié)果可指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物以治療豬源沙門菌病。本試驗對兩地區(qū)不同豬場豬源沙門菌進行耐藥性調(diào)研和耐藥基因檢測，以期為沙門菌的防控工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2019年5月在新疆北疆地區(qū)石河子市1個規(guī)模化豬場采集豬肛拭子樣品200份，經(jīng)用藥情況調(diào)研，該豬場曾使用土霉素、氟苯尼考、新諾明、多西環(huán)素、青霉素和恩諾沙星等藥物。2019年10月在新疆南疆地區(qū)焉耆縣1個規(guī)模化豬場采集豬肛拭子樣品300份，經(jīng)用藥情況調(diào)研，該豬場曾使用氟苯尼考、頭孢噻呋、慶大霉素、二甲氧芐胺嘧啶(敵菌凈)和慶大霉素等藥物。

1.2 培養(yǎng)基與試劑 SS瓊脂培養(yǎng)基和沙門顯色培養(yǎng)基，均購自奧博星生物技術(shù)有限公司(北京)；甘油和50×TE緩沖液，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix、瓊脂糖和核酸染料，均購自天根生化科技有限公司(北京)。

1.3 沙門菌的分離鑒定 根據(jù)軒慧勇等[6]使用的方法對樣品進行菌株分離，挑取分離的單菌落于沙門顯色培養(yǎng)基上進行純化。純化后的菌株進行沙門菌特異性侵襲基因invA的鑒定[7]，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)加核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結(jié)果經(jīng)比對，同源性>96%的判定為沙門菌。在裝有400 μL新鮮菌液的2 mL無菌EP管中，加入200 μL 60%甘油，一式兩份，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 最小抑菌濃度值測定 本試驗采用美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)[8]發(fā)布的M100-S23，運用瓊脂稀釋法檢測沙門菌對12種抗菌藥物的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)值，以大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，測試菌株藥敏試驗結(jié)果以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)3種形式記錄。

抗菌藥物包括環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、阿米卡星(Amikacin，AMK)、慶大霉素(Gentamicin，GEN)、氨芐西林(Ampicillin，AMP)、頭孢噻呋(Ceftiofur，CEF)、頭孢曲松(Ceftriaxone，CRO)、亞胺培南(Imipenem，IPM)、四環(huán)素(Tetracycline，TET)、氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)FC)、多黏菌素(Polymyxin，CL)、磺胺異噁唑(Sulfaisoxazole，SMZ)和磷霉素(Fosfomycin，F(xiàn)OS)，上述藥物均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.5 耐藥基因檢測 通過煮沸法進行DNA模板的制備[9]，制備好的DNA模板于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ψ蛛x鑒定菌株進行blaTEM、blaCMY-2、oqxB、qnrS、oqxA、tetA、tetB、sul1、aadA2、ant(3″)-Ia、floR和aac(6′)-Ib共12種耐藥基因的檢測，根據(jù)參考文獻[10-14]合成所需要的引物。反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，加滅菌超純水8.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，對獲取的序列上傳至NCBI進行比對，以同源性大于96.0%的結(jié)果判定為基因比對結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計分析 不同地區(qū)豬場的耐藥差異性采用SPSS 20軟件進行卡方檢驗分析，以P<0.05表示有顯著性差異，以P>0.05表示無顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同豬場豬源沙門菌的分離鑒定 經(jīng)SS培養(yǎng)基、沙門菌顯色培養(yǎng)基和invA基因鑒定，北疆地區(qū)石河子市沙門菌的分離率為40.5%(81/200)，南疆地區(qū)焉耆縣沙門菌的分離率為9.0%(27/300)。

2.2 不同豬場豬源沙門菌的藥敏試驗 不同豬場豬源沙門菌對被檢藥物的耐藥率結(jié)果如表1所示，焉耆縣豬場分離的豬源沙門菌對磺胺異噁唑的耐藥率高達100.0%，對氟苯尼考(55.6%)和四環(huán)素(40.7%)的耐藥率也超過40.0%；石河子市豬場分離的豬源沙門菌對磺胺異噁唑耐藥率高達100.0%，對環(huán)丙沙星、氨芐西林、氟苯尼考和四環(huán)素的耐藥率超過70.0%。不同地區(qū)豬場分離的豬源沙門菌均對阿米卡星、頭孢曲松、亞胺培南、多黏菌素和磷霉素高度敏感，無耐藥菌株檢出。經(jīng)卡方檢驗分析，石河子市豬場豬源沙門菌對環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢噻呋和四環(huán)素的耐藥率顯著高于焉耆縣豬場豬源沙門菌(P<0.05)；焉耆縣豬場豬源沙門菌對慶大霉素的耐藥率顯著高于石河子市豬場豬源沙門菌(P<0.05)；不同地區(qū)豬場豬源沙門菌對氟苯尼考和磺胺異噁唑耐藥率無顯著性差異(P>0.05)。

表1 不同豬場豬源沙門菌的耐藥率比較Table 1 Comparison of drug resistance rates of Salmonella strains from different pig farms

2.3 不同豬場豬源沙門菌多藥耐藥性 不同豬場豬源沙門菌對被檢抗菌藥物的多藥耐藥性結(jié)果如圖1所示，不同豬場豬源沙門菌對被檢12種抗菌藥物的多藥耐藥在1～6耐分布，焉耆縣豬場豬源沙門菌多藥耐藥以5耐為主(14.8%，4/27)，單藥耐藥占48.2%(13/27)；石河子市豬場豬源沙門菌多藥耐藥主要集中在5耐(59.2%)和6耐(17.3%)，占76.5%。

圖1 不同地區(qū)豬場豬源沙門菌多重耐藥性Fig.1 Multidrug resistance of Salmonella strains from different pig farms不同地區(qū)比較，*：P<0.05;下圖同Comparison of different regions,*：P<0.05. The same as below

2.4 不同豬場豬源沙門菌的耐藥基因檢測 不同豬場豬源沙門菌耐藥基因檢測結(jié)果如圖2所示，焉耆縣豬場豬源沙門菌中檢出所有被檢耐藥基因，其中floR耐藥基因檢出率最高，達40.7%，ant(3″)-Ia和sul1基因檢出率次之，均為33.3%，其余耐藥基因的檢出率介于3.7%～22.2%；石河子市豬場豬源沙門菌的耐藥基因檢測結(jié)果顯示：除blaCMY-2和tetA基因未檢出外，其他被檢耐藥基因的檢出率均高于焉耆縣，對blaTEM(74.1%)、tetB(76.5%)、oqxA(77.8%)、aadA2(77.8%)、ant(3″)-Ia(77.8%)和sul1(77.8%)基因的檢出率均在70.0%以上，對floR、qnrS、oqxB和aac(6′)-Ib基因的檢出率依次為66.7%、64.2%、53.1%和49.4%。

圖2 不同地區(qū)豬場豬源沙門菌耐藥基因檢測Fig.2 Detection of drug resistance genes in Salmonella strains from different pig farms

3 討論

3.1 沙門菌的耐藥性 沙門菌作為人獸共患病病原菌可引起人和動物的多種疾病，隨著耐藥沙門菌的出現(xiàn)，對人類健康造成威脅，且延長動物疾病治療時間，增加治療成本。新疆地廣人稀，南北疆路途遙遠，不同地域之間動物源沙門菌耐藥性是否存在差異值得研究。本試驗中新疆南北疆地區(qū)不同豬場豬源沙門菌對磺胺異噁唑的耐藥率均高達100.0%，耐藥率結(jié)果高于段瑤等[15](73.32%)和彭斌等[16](61.5%)報道的沙門菌對磺胺異噁唑的耐藥率；本試驗中，不同豬場豬源沙門菌對氟苯尼考的耐藥率均超過50.0%，說明有必要對耐藥菌株進行深入研究與緊急預(yù)防。

值得注意的是，新疆南北疆地區(qū)不同豬場豬源沙門菌整體耐藥結(jié)果趨勢相同，都有環(huán)丙沙星、氨芐西林、四環(huán)素、氟苯尼考和磺胺異噁唑耐藥菌株檢出。但北疆地區(qū)石河子市豬源沙門菌耐藥情況更嚴峻，對氨芐西林和環(huán)丙沙星的耐藥率均高達80.0%以上，對四環(huán)素和氟苯尼考的耐藥率也超過70.0%，該結(jié)果低于加春生[14]的研究結(jié)果(對氨芐西林耐藥率達到100.0%，對四環(huán)素耐藥率達到88.0%)。此外，北疆地區(qū)石河子市豬場豬源沙門菌對環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢噻呋和四環(huán)素這4種抗菌藥物的耐藥率均顯著高于南疆地區(qū)焉耆縣豬場豬源沙門菌，造成這種現(xiàn)象的原因可能是：石河子市作為新疆重要的畜牧養(yǎng)殖地，養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展趨于集約化大規(guī)模養(yǎng)殖，長期處于低劑量的抗菌藥物選擇壓力下，更易于耐藥菌的產(chǎn)生。而焉耆縣作為回族自治縣，養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展較滯后，抗菌藥物的使用頻率和劑量較少，因此耐藥率低于石河子市豬源沙門菌。焉耆縣和石河子市豬場豬源沙門菌均對慶大霉素具有較好的敏感性，焉耆縣豬場豬源沙門菌對慶大霉素的耐藥率為11.1%，石河子市豬場豬源沙門菌對慶大霉素完全敏感。不同地區(qū)豬場豬源沙門菌均無阿米卡星、頭孢曲松、亞胺培南、多黏菌素和磷霉素耐藥菌株檢出，與曹陽等[17]報道的耐藥結(jié)果一致。

本試驗多藥耐藥結(jié)果顯示，石河子市豬場豬源沙門菌的多藥耐藥以5耐為主，焉耆縣豬場豬源沙門菌多藥耐藥雖然也以5耐為主，但其數(shù)量遠低于石河子市豬場豬源沙門菌的多藥耐藥，其單藥耐藥沙門菌數(shù)量占主導(dǎo)。因此不同地區(qū)豬場可結(jié)合藥敏試驗結(jié)果，合理選用抗菌藥物提高療效，以降低耐藥菌的出現(xiàn)。

3.2 沙門菌的耐藥基因 耐藥基因的攜帶不僅使細菌對抗菌藥物的耐藥性升高，并且會造成環(huán)境污染，導(dǎo)致更嚴重的耐藥性產(chǎn)生。本試驗?zāi)退幓驒z測結(jié)果顯示，焉耆縣和石河子市不同豬場豬源沙門菌中耐藥基因攜帶率不同，石河子市豬場豬源沙門菌耐藥基因攜帶率高，10種耐藥基因檢出率都超過49.0%；而焉耆縣豬場豬源沙門菌耐藥基因攜帶種類更多，12種耐藥基因都有檢出，但耐藥基因檢出率均低于41.0%。結(jié)合耐藥結(jié)果可以看出，耐藥基因攜帶率與耐藥率呈正相關(guān)。有趣的是，焉耆縣豬場豬源沙門菌耐藥率和多藥耐藥率都低于石河子市，盡管基因的檢出種類高于石河子市，但檢出基因的攜帶率都遠低于石河子市。比較發(fā)現(xiàn)，焉耆縣豬場豬源沙門菌對四環(huán)素的耐藥性是由tetA(22.2%)和tetB(29.7%)這2種基因共同作用的結(jié)果，而石河子市豬場豬源沙門菌對四環(huán)素的耐藥性主要是由tetB(76.5%)基因介導(dǎo)。焉耆縣豬場豬源沙門菌對氨芐西林的耐藥性主要由blaTEM和blaCMY-2基因共同介導(dǎo)，但石河子市豬場豬源沙門菌對氨芐西林的耐藥性主要由blaTEM基因介導(dǎo)。以上結(jié)果說明，雖然對同一種抗菌藥物耐藥，但不同地區(qū)豬場主要流行的耐藥基因型不同。不同地區(qū)豬場豬源沙門菌對酰胺醇類耐藥基因floR的檢出率均在40.0%以上，遠低于王剛等[18]報道的西藏地區(qū)豬源沙門菌floR耐藥基因的檢出率(96.96%)，氟苯尼考作為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準使用的動物專用抗菌藥，臨床中的長期使用不僅導(dǎo)致沙門菌對其耐藥率提高，相關(guān)耐藥基因的攜帶率也升高。在養(yǎng)殖過程中，需要實時跟蹤細菌耐藥情況的變化，制備更科學(xué)的治療方案。

此外，腸道作為耐藥基因的儲存庫，腸道菌群在獲得耐藥性后，往往可以通過多種方式將耐藥性傳播，如喹諾酮類耐藥基因可通過質(zhì)粒進行傳遞，導(dǎo)致細菌產(chǎn)生多重耐藥現(xiàn)象[19]，還可通過轉(zhuǎn)座子和整合子在不同細菌之間進行轉(zhuǎn)移，而新型耐藥基因的發(fā)現(xiàn)[如已報道的tet(X5)、tet(X6)等]證實細菌產(chǎn)生耐藥性的速度極快[20]。因此研究沙門菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播，對于耐藥菌株的追蹤溯源和預(yù)防控制具有重要意義。

綜上所述，新疆石河子市豬場豬源沙門菌對環(huán)丙沙星、氨芐西林和四環(huán)素的耐藥率高于焉耆縣豬場豬源沙門菌，在進行沙門菌病治療時，可選用敏感性高的抗菌藥物，如慶大霉素、頭孢曲松等。石河子市豬場豬源沙門菌耐藥基因攜帶率高，但焉耆縣豬場豬源沙門菌耐藥基因攜帶種類更多，且耐藥率與耐藥基因呈正相關(guān)。本試驗結(jié)果可為不同地區(qū)豬場豬源沙門菌病的治療和合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。