豬肌肉多發(fā)性膿腫病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李康健 ， 趙賢杰 ， 郭敏儀 ， 付 強(qiáng)，3 ， 馬春全，3

(1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院 ， 廣東 佛山 528225 ； 2. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院大學(xué)科技園 ，廣東 佛山 528225 ； 3. 佛山佛科院動(dòng)物醫(yī)院有限公司 ， 廣東 佛山 528225)

豬膿腫是豬場中常見的多發(fā)病，多見單一腫塊膿包。哺乳仔豬的膿腫多發(fā)于臍部，中大豬和種豬的膿腫多發(fā)于頸部，該現(xiàn)象主要是由藥物、疫苗等不規(guī)范注射引起的。豬多發(fā)性膿腫在臨床上比較少見，主要是因皮膚或黏膜損傷，化膿性病原菌直接侵入體內(nèi)并大量繁殖造成的，也可由原發(fā)性病灶經(jīng)血液或淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移至新的組織器官而產(chǎn)生[1-2]。其特征是在豬肌肉形成外有膿腫膜包囊，內(nèi)有濃汁潴留的局限性膿腔。膿腫膜包囊內(nèi)的致病菌容易擴(kuò)散，常可形成局部潰瘍、組織壞死等并發(fā)癥[3]。豬肉膿腫的常見病原菌有葡萄球菌、鏈球菌、伯克氏菌、氣單胞菌以及化膿性棒狀桿菌等[4-6]。其中多數(shù)致病菌可感染人，引起食物中毒等嚴(yán)重后果，威脅我國的食品衛(wèi)生安全[7]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的豬肌肉多發(fā)性膿腫分布于全身肌肉，但眼觀體征無異常，屠宰過程中才被發(fā)現(xiàn)。因此，本試驗(yàn)對(duì)該病例進(jìn)行了病原菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)和組織病理學(xué)觀察，為類似的豬多發(fā)性膿腫的診治和鑒別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品 豬肌肉多發(fā)性膿腫病料采集自廣東某大型養(yǎng)殖場。該豬肌肉多發(fā)性膿腫分布于全身肌肉，屠宰前體征無異常，屠宰過程中才被發(fā)現(xiàn)，同批次屠宰豬發(fā)病率為3%。

1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×ExTaqDNA聚合酶、DL-2 000 DNA Marker、載體pMD19-T、感受態(tài)細(xì)胞DH5α，均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，購自Axygen公司；異丙醇、無水乙醇、氯仿等試劑均為分析純，購自廣州鼎國生物技術(shù)有限公司；革蘭染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA培養(yǎng)基)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基)、藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司；微生物微量生化鑒定管，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌的分離鑒定 無菌條件下，切開膿腫囊膜，使用無菌、潔凈的接種環(huán)蘸取膿汁，并重復(fù)劃線于TSA瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，待平板上長出菌落后，挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色。

1.3.2 病原菌16S rDNA擴(kuò)增 首先使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取病原菌全基因組，并以其為模板，使用16S rDNA通用引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16S-R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成]。擴(kuò)增體系為50 μL，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性，5 min后進(jìn)入循環(huán)；94 ℃ 40 s、55 ℃ 35 s、72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 16S rDNA的克隆與序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收后克隆至載體pMD19-T中，再轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行鑒定，獲得的重組陽性質(zhì)粒由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序獲得的16S rDNA基因序列在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)，并用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.3.4 生化試驗(yàn) 將獲得的菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，包括葡萄糖、蔗糖、鼠李糖等糖發(fā)酵試驗(yàn)，V-P試驗(yàn)，硝酸鹽還原試驗(yàn)，試驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行。

1.3.5 藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)選取臨床上較為常用的14種抗菌藥物，運(yùn)用紙片擴(kuò)散法，在固體培養(yǎng)基上涂滿獲得的分離菌株并將藥物紙片置于上面，放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～48 h。根據(jù)抑菌圈的大小將細(xì)菌分為敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)，結(jié)果判讀參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)2015年[8]中規(guī)定進(jìn)行。

1.3.6 組織病理學(xué)石蠟切片制作 參照參考文獻(xiàn)[9]方法對(duì)病灶進(jìn)行病理切片制作，取膿腫病料通過固定、流水沖洗、脫水、包埋、切片、染色、鏡檢等過程制備組織切片,用以觀察病料的病理組織變化。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離與鑒定 采集豬肌肉多發(fā)性膿腫病料(圖1)，將膿汁劃線接種于TSA瓊脂平板上，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，在瓊脂平板上形成白色隆起、濕潤、光滑、不透明的直徑2～3 mm圓形菌落(圖2)。涂片進(jìn)行革蘭染色，鏡檢可見大量革蘭陽性、短鏈狀或葡萄串狀的球菌(圖3)。

圖1 豬肌肉多發(fā)性膿腫病灶Fig.1 Multiple abscess foci between the pig muscles

圖2 分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長Fig.2 Bacterial isolate grown on agar medium

圖3 病原菌革蘭染色結(jié)果 (1 000×)Fig.3 Gram staining results of pathogenic bacteria (1 000×)

2.2 16S rDNA基因的序列分析 應(yīng)用MEGA 7.0軟件，將獲得的分離菌株16S rDNA基因序列與8株葡萄球菌參考株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。結(jié)果顯示，本試驗(yàn)分離得到的葡萄球菌(Staphylococcussp. SG00263)與巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuris)處于同一進(jìn)化分支上，親緣關(guān)系最為接近。

圖4 基于16S rDNA的葡萄球菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of staphylococci based on 16S rDNA▲：本試驗(yàn)分離菌株▲:The strain isolated in this test

2.3 生化試驗(yàn) 將分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，該分離菌株可發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、葡萄糖和松二糖，不能發(fā)酵木糖、乳糖和阿拉伯糖等；同時(shí)，分離菌株還能夠還原硝酸鹽，V-P試驗(yàn)測定為陽性。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of biochemical test

2.4 藥敏試驗(yàn) 使用14種豬場常用抗菌藥物對(duì)該分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，該菌株主要對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥，如青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐等；對(duì)部分氨基糖苷類藥物耐藥，如萬古霉素；對(duì)部分氨基糖苷類藥物敏感，如大觀霉素；對(duì)鏈霉素中度敏感；對(duì)磺胺類藥物耐藥；對(duì)四環(huán)素類、喹諾酮類藥物等敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of drug sensitive test

2.5 組織病理石蠟切片觀察 取豬肌肉膿腫病料，制作病理石蠟切片。切片觀察發(fā)現(xiàn)，豬肌肉膿腫病灶中有大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞浸潤，病灶與正常組織界限不明顯，見圖5。

圖5 豬膿腫病灶病理切片(H.E.染色，A：40×；B：400×)Fig.5 Pathological section of pig abscess (H.E. staining，A:40×；B:400×)紅色箭頭：淋巴細(xì)胞浸潤 Red arrow:Lymphocyte infiltrations

3 討論

豬膿腫是大型豬場中常見的一種外科疾病，但關(guān)于該病的報(bào)道在我國相對(duì)較少。近期僅有張?zhí)焯斓萚10]在貴州某豬場的豬體表膿腫中分離出金黃色葡萄球菌、化膿隱秘桿菌等病原菌的報(bào)道。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一病豬肌肉間多發(fā)性膿腫病例，國內(nèi)尚未見報(bào)道。肌肉間多發(fā)性膿腫可以通過2種途徑實(shí)現(xiàn)——直接通過創(chuàng)口和注射部位感染和血源性感染[11]。本試驗(yàn)通過組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，病灶處的肌肉既有較大的膿腫灶，也有很小的病灶，且病灶與正常組織間界限不明顯，具有一定的蜂窩織炎特點(diǎn)，與常見的普通膿腫有很大差異。而除肌肉外的其他內(nèi)臟器官未見化膿灶，表明該病原菌主要通過肌膜擴(kuò)散，提示該病例的出現(xiàn)可能與疫苗注射過程操作不規(guī)范有關(guān)。

巴氏葡萄球菌是一種人獸共患的病原菌，可引起多種局部或全身性的感染疾病[12-13]，但其引起的豬的疾病卻未見報(bào)道。本試驗(yàn)使用病例膿汁進(jìn)行了病原菌分離鑒定，經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析其是1株巴氏葡萄球菌。葡萄球菌具有產(chǎn)透明質(zhì)酸酶特性，該酶能溶解肌膜，使化膿性病灶沿著肌膜鞘擴(kuò)散。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的豬肌肉多發(fā)性膿腫分布于全身肌肉的病理特點(diǎn)，可能與該菌株的產(chǎn)透明質(zhì)酸酶特性有關(guān)。另外，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株耐藥性強(qiáng)，對(duì)多數(shù)臨床常用抗生素均耐藥，也是該批次豬肉發(fā)病比例較高的重要原因之一。

本試驗(yàn)從一豬肌肉多發(fā)性膿腫病例中分離出1株巴氏葡萄球菌，并對(duì)該菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)、生化試驗(yàn)和組織病理學(xué)分析。肌肉多發(fā)性膿腫及其病原菌的鑒定在國內(nèi)尚未見報(bào)道，因此，本試驗(yàn)對(duì)肌肉多發(fā)性膿腫的檢測及診斷具有臨床指導(dǎo)意義，有助于提高我國的食品衛(wèi)生安全水平。