基于CSE/H2S通路探討蔥白提取物干預大鼠動脈粥樣硬化的作用及機制

雷 杰 段剛峰 董 瑩 陳忠輝 夏 雯

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS) 是一種慢性炎癥性血管疾病，病變涉及大、中動脈，其特征在于血管脂質積累、炎癥及免疫系統活化、氧化應激、內皮細胞活化、動脈平滑肌細胞增殖、巨噬細胞活化和泡沫細胞形成等導致內皮功能障礙。動脈粥樣硬化相關炎癥是由促炎性細胞因子、炎性信號通路和黏附分子介導。目前，胱硫醚γ裂解酶(cystathionine γ lyase，CSE)被證實可通過內源性合成硫化氫(hydrogen sulfide，HS)來減少血管內膜炎癥和抑制黏附分子表達以發揮保護血管的作用，故CSE/HS途徑是預防動脈粥樣硬化的重要治療靶標。

蔥白提取物是從雙子葉百合科植物分蔥(allium fisturosum L var．eaespitosum makio)的近根部的鱗莖中提取的活性成分。前期實驗發現，蔥白提取物能調節大鼠血脂水平、抑制血管內膜脂質沉著、調節免疫、抑制炎性細胞因子分泌，發揮抗AS的作用。但蔥白提取物抗AS的具體機制目前尚未完全清楚。為此，本實驗建立大鼠動脈粥樣硬化模型，用蔥白提取物進行干預，觀察、比較血脂、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)、基質金屬蛋白酶(MMP7、MMP9)、CSE的水平，探討蔥白提取物抗AS的作用機制。

材料與方法

1.實驗動物：健康純種SD大鼠40只，3～4月齡，體質量為200±20g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證編號：HNASLKJ20100330。

2.實驗藥品：蔥白提取物由雙子葉百合科植物分蔥的新鮮鱗莖經冷凍干燥和超臨界CO萃取得到，干燥蔥白超臨界萃取的總得率在1.85%左右，相當于每54g干燥蔥白粉可萃取得到1g蔥白提取物，主要含有含硫化合物、甾體、皂苷、不飽和脂肪酸等化合物，濃度為25%。辛伐他汀(舒降之)片由杭州默沙東制藥有限公司提供。

3.實驗試劑：血脂檢測試劑盒均購自長春匯力生物技術有限公司；ELISA Kit購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Trizol購自美國Ambion公司(貨號：15596-026)；RNase H、5×HiScript Buffer購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司(貨號:R101-01/02)；dNTP、Taq Plus DNA Polymerase、DL2000 DNA marker購自北京天根生化科技有限公司(貨號分別為CD117、ET105-01、MD114-02)；Random Primer(N6)購自日本TaKaRa公司(貨號:3801)；內參對照(GAPDH)購自杭州賢至生物有限公司(貨號：AB-P-R001)；一抗：基質金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)購自武漢三鷹生物技術有限公司(貨號:10374-2-AP);基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)、血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion,VCAM-1)購自美國Affinity公司(貨號分別為AF0220、DF6082);細胞間黏附分子-1(intercellular adhesion,ICAM-1)購自英國Abcam公司(貨號:Ab179707)；CSE購自武漢愛博泰克生物科技有限公司(貨號：A11727)；HRP標記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司(貨號：BA1054)。

4.實驗儀器：JT-12J電腦生物組織脫水機購自武漢俊杰電子有限公司；RM 2016輪轉式切片機購自德國Leica公司；BX53型生物顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；JK-6生物組織攤烤片機購自武漢俊杰電子有限公司；全自動生化分析儀購自美國Rayto公司；離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；電熱恒溫培養箱購自日本ASONE 公司；FlexStation 3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices 公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；電轉儀購自北京六一儀器廠。

5.動物分組、造模及給藥：將實驗動物編號，隨機分為正常組、模型組、蔥白提取物組、辛伐他汀組，每組10只。參照郭延松等的方法制備動脈粥樣硬化模型，第5周開始，按照《人和動物及各類動物間藥物劑量的換算方法》，以成人每日服用劑量換算為大鼠用藥量，蔥白提取物組大鼠給予蔥白提取物600mg/kg灌胃，給藥體積10ml/kg，辛伐他汀組給予辛伐他汀混懸液600mg/kg灌胃，給藥體積10ml/kg。正常組、模型組均給予等容積0.9%氯化鈉溶液10ml/kg灌胃，連續8周。

6.標本采集：第12周，各組大鼠禁食過夜，從腹腔注射戊巴比妥麻醉后，腹主動脈取血，繼之插管入升主動脈。先用0.9%氯化鈉溶液沖洗，解剖后取下整段主動脈，部分灌注含1%多聚甲醛及1.25%戊二醛的0.1mol/L磷酸緩沖液備用，部分主動脈置于-80℃冰箱備用。

7.主動脈病理學觀察：取大鼠主動脈制備病理切片，進行Masson染色。

8.檢測血脂水平：全自動生化分析儀檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterin，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterin，HDL-C)水平； ELISA法檢測血清載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)水平。

9.RT-PCR檢測大鼠主動脈ICAM-1、VCAM-1、CSE及心肌CSE mRNA表達水平：Trizol法提取大鼠主動脈組織RNA。再依次加入Oligo (dT) 18(10μmol/L) 2μg、dNTP (2.5mmol/L) 4μg、5×Hiscript Buffer 4μg、Hiscript Reverse Transcriptase 1μg、Ribonuclease Inhibitor 0.5μg、RNA 4μl，最后用ddHO滴定至20μl，分別于25℃孵育5min，50℃孵育15min，85℃孵育5min，4℃孵育10min。實時熒光定量PCR檢測，將cDNA稀釋8倍，以Rat GAPDH為內參，經過95℃預變性10min，再循環重復95℃變性15s、60℃退火延伸60s共40次，最后60℃ 60s、95℃ 15s溶解曲線采集。用QPCR算法(相對定量，2-法)進行相對表達量計算。所用引物序列詳見表1。

10.Western blot法檢測主動脈MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1、CSE表達水平：制備蛋白樣品，測定蛋白濃度，計算蛋白上樣量,5×蛋白上樣緩沖液加熱使蛋白變性，制備電泳膠進行電泳分離，根據marker切下目的條帶進行電轉移(轉膜條件：MMP7：200mA 70min，MMP9、ICAM-1、VCAM-1：200mA 120min后300mA 15min，CSE、GAPDH：200mA 90min)，用含5% 脫脂奶粉的TBST(封閉液)封閉2h，用封閉液稀釋一抗(稀釋比例詳見表2)，4℃孵育過夜，洗去多余一抗，再加入稀釋的HRP標記羊抗兔二抗(1∶50000)，室溫搖床孵育2h，洗去多余二抗，顯色曝光，曬干膠片，用BandScan分析膠片灰度值，以兔多抗GAPDH作為內參。

結 果

1.主動脈Masson染色:正常組主動脈管壁厚度均勻，內膜光滑，膠原纖維和平滑肌細胞排列整齊。模型組管壁厚度不均勻，血管內膜增生，膠原纖維呈藍色染色，血管平滑肌細胞呈紅色染色，膠原染色不均，排列紊亂迂曲。與模型組比較，蔥白提取物組和辛伐他汀組管壁膠原纖維染色均勻，排列較為整齊，血管內膜增生較輕(圖1)。

2.血脂水平：與正常組比較，模型組TC、TG、LDL-C、ApoB水平均明顯升高(<0.05)，HDL-C水平明顯降低(<0.05)。與模型組比較，蔥白提取物組和辛伐他汀組TC、TG、LDL-C、ApoB水平均明顯降低(<0.05)，HDL-C水平明顯升高(<0.05),詳見表3。

3.大鼠主動脈ICAM-1、VCAM-1、CSE及心肌CSE基因mRNA表達水平：與正常組比較，模型組大鼠主動脈ICAM-1mRNA、VCAM-1mRNA表達均上調，主動脈及心肌CSE mRNA表達均下調。與模型組比較，蔥白提取物組與辛伐他汀組主動脈ICAM-1mRNA、VCAM-1mRNA表達均下調，主動脈及心肌CSE mRNA表達均上調(表4)。

4.主動脈MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1、CSE表達水平：與正常組比較，模型組大鼠主動脈MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1表達均上調，CSE表達下調。與模型組比較，蔥白提取物組和辛伐他汀組主動脈MMP7、MMP9、ICAM-1、VCAM-1表達均下調，CSE表達上調(表5、圖2)。

討 論

動脈粥樣硬化病變過程歷經脂質條紋、纖維斑塊、粥樣斑塊，斑塊穩定性降低、斑塊破裂甚至血栓形成。目前大量研究證實，血脂水平異常對AS進展有預測意義。LDL-C會導致動脈粥樣硬化，而HDL-C則能對抗損傷反應這一病理過程。前期實驗已證實蔥白提取物具有調節AS大鼠血脂水平的作用。本實驗結果也支持蔥白提取物具有改善內膜增生、降低血清TC、TG、LDL-C、ApoB及升高HDL-C含量的作用。

細胞黏附分子是AS的炎性成分中的重要元素，有助于單核細胞和淋巴細胞的活化及募集。ICAM-1和VCAM-1是免疫球蛋白超家族成員，ICAM-1可通過促進內皮細胞激活、增加血管壁內的炎性反應而促進動脈粥樣硬化斑塊形成。ICAM-1、VCAM-1與AS的嚴重程度呈正相關，被證實為AS病理變化及斑塊進展的潛在機制。本實驗結果提示，蔥白提取物能夠抑制ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA及ICAM-1、VCAM-1蛋白的表達，從而發揮抗AS作用。

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)參與了AS病變重構，能夠引起血管細胞外基質的局灶性破壞，細胞外基質的破壞和無休止的單核-吞噬細胞堆積可以加速斑塊破裂。MMP7由巨噬細胞表達，能促使斑塊核心擴張、纖維帽稀疏、血管平滑肌細胞凋亡，是AS進展的有害因素。MMP9主要來源于單核-吞噬細胞，可降解AS斑塊纖維帽，參與不穩定斑塊形成。本實驗證實，蔥白提取物可抑制MMP7、MMP9的表達，發揮穩定動脈粥樣硬化斑塊的作用。

CSE是脈管系統中主要的HS產生酶。HS已被證明可以多方面抑制AS的進展，如抑制氧化應激、抑制炎性反應、抑制細胞凋亡與一氧化氮相互作用等。本實驗證實，蔥白提取物可以提高主動脈及心肌CSE的表達水平。有研究證實，外源性補充HS，可使MMP7、MMP9表達顯著升高，同時能明顯抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導的ICAM-1、VCAM-1表達。

綜上所述，本研究證實蔥白提取物能夠調節血脂、抑制黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)和基質金屬蛋白酶(MMP7、MMP9)表達而發揮抗動脈粥樣硬化作用，其機制可能與促進CSE表達、調節CSE/HS通路相關。