缺氧誘導因子對灘羊肉宰后初期能量水平及肉色的影響

姬 琛，楊 波，羅瑞明,,*，劉吉娟

（1.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

灘羊是廣泛分布于寧夏、甘肅、陜西等地的區域性家畜品種，具有重要的食用及經濟價值。肌肉轉化為肉的過程始于呼吸和血液循環的停止。當受到缺氧缺血信號刺激時，組織內部發生一系列復雜的生理生化反應，細胞/組織為了維持平衡，通過糖酵解產生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），從而調控肉品質形成過程。因此，研究宰后成熟過程中糖酵解的生化調控對于了解肉品質特性的發展至關重要。

缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是一種廣泛存在于哺乳動物骨骼肌中的轉錄因子，由HIF-1α和HIF-1β亞基組成，在機體缺氧反應和適應中起主導作用，其活性主要取決于HIF-1α蛋白質的表達水平。正常條件下，由于HIF-1α迅速被降解無法合成HIF-1，而缺氧條件下，穩定的HIF-1α與HIF-1β結合，激活許多靶基因，進而維持機體的正常功能，如調節糖代謝。Sun Lianlian等的研究結果表明HIF-1α可將刺參代謝從氧化磷酸化轉化為糖酵解，以應對病原體的挑戰。Verma等的研究結果表明HIF-1通過調節靶基因葡萄糖轉運子、乳酸脫氫酶等促進糖酵解。因此，HIF-1對于活體中糖酵解有重要的調控作用。

糖酵解是宰后成熟過程中重要的代謝過程，對肉的色澤、保水性、嫩度、質構和風味均有重要影響。本課題組前期研究中發現灘羊肉中磷酸丙糖異構酶（triosephosphate isomerase，TPI）在8 d的成熟過程中表達量先上升后下降，且與0 d比較，4 d其表達量上調近2 倍。Zhang Ying等研究發現HIF-1通過調節血管發育、血管生成的能量代謝、血管平滑肌收縮和各種缺氧相關信號通路調控藏雞的缺氧適應性。然而，宰后肉品質形成過程中HIF-1是否同樣具有重要作用，以及宰后HIF-1對糖酵解是否同樣具有調節作用，目前鮮見相關研究報道。由于宰后肉品質形成同樣由缺氧缺血信號調節啟始，因此，本研究假設HIF-1在宰后成熟過程中對糖酵解關鍵酶、能量水平及肉品質有重要影響，故選取4 ℃成熟2、6、12、24、48 h的灘羊背最長肌為研究對象，測定不同成熟期HIF-1表達量的變化，確定其與能量水平、糖酵解關鍵酶TPI活力及肉色變化的關系，以期為宰后肉品品質形成提供新的思路及見解。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灘羊背最長肌購于寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司。選取9 只體質量相近的6 月齡公灘羊，屠宰前統一管理。屠宰后立即采集其右側胴體的背最長肌，剔除可見脂肪與結締組織后放置于保鮮袋中，于4 ℃、風速3 m/s、相對濕度85%條件下成熟。

羊HIF-1試劑盒、TPI、ATP、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）試劑盒 上?？婆d生物科技有限公司；多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲基酯酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、硫酸、醋酸鈉、檸檬酸、HO、乙二胺四乙酸鈉、甘油、四甲基聯苯胺（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DW3.0.1型超低溫冰箱 無錫冠亞恒溫制冷技術有限公司；352型酶標儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司；AC8型洗板機 芬蘭雷勃公司；TG16W型離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；GNP-9080型恒溫培養箱 上海昕儀儀器儀表有限公司；便攜式數字pH計上海德圖儀器國際貿易有限公司；CR-400型色差儀日本柯尼卡美能達公司；FA2104型電子天平 杭州萬特衡器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

分別采集宰后于溫度4 ℃、風速3 m/s、相對濕度85%條件下成熟2、6、12、24、48 h的灘羊背最長肌200 g，用于測定pH值與肉色；分別采集不同成熟時間樣本5 g封裝于滅菌冷凍管中，置于液氮中速凍后轉移至-80 ℃冰箱備用，用于測定能量水平、TPI活力及HIF-1表達量。

1.3.2 pH值測定

使用便攜式數字pH計測量肌肉pH值。使用前以pH 9.18、6.86和4.0的標準緩沖液校正pH計。

1.3.3 肉色測定

剔除可見脂肪與結締組織后將樣品修整為6 cm×6 cm×2 cm的塊狀，采用色差儀測定樣品的*、*、*值。光源為D65，觀察角度為10°，孔徑為8 mm，測定前以白板校正色差儀。

1.3.4 HIF-1表達量、TPI活力及能量物質水平測定

根據相關酶聯免疫吸附測定試劑盒操作說明書測定ATP、ADP、AMP水平及HIF-1表達量與TPI活力。

1.4 數據處理與分析

每個指標重復測定3 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS軟件對數據進行方差分析并進行鄧肯多元方差檢驗后采用Origin軟件繪圖。＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 灘羊肉宰后成熟初期pH值及肉色變化

由表1可知，灘羊肉宰后2～48 h pH值顯著下降（＜0.05），12～48 h內降幅較大。這一結果與陳煉紅等對牦牛肉4 ℃成熟6～72 h內pH值變化規律的研究結果基本一致。宰后由于缺氧缺血，糖酵解作為細胞的主要能量來源，除產生ATP外還會生成丙酮酸及乳酸，且ATP水解產生的磷酸均會促使pH值下降；另外，有研究表明宰后蛋白質降解也會引起肌肉pH值下降。肉色是消費者判斷鮮肉貨架期的重要指標之一，是影響消費者購買行為的決定因素。宰后成熟期間肉色主要由肌紅蛋白的氧化還原狀態決定。宰后2～6 h內*值無顯著變化（＞0.05），6～48 h內*值顯著上升（＜0.05），*值表示亮度，能夠反映肉色的穩定性，6～48 h內*值顯著升高可能是隨著宰后糖酵解的進行肌肉pH值逐漸下降，當pH值降至蛋白質等電點時，蛋白質對于不易流動水的吸附作用降低，導致貯存于肌肉結構中的不易流動水轉化為自由水，當自由水附著于肌肉表面時會增強光的反射，致使*值升高。*值代表紅度，是決定鮮肉色澤的關鍵參數，灘羊宰后2～6 h內*值無顯著變化（＞0.05），6～48 h內顯著升高（＜0.05），這一變化趨勢與李兆亭等的研究結果一致，表明宰后48 h內隨著成熟時間的延長，灘羊肉逐漸呈現櫻桃紅色，可能是由于宰后隨著時間延長，較多的肌紅蛋白與氧結合，形成紅色的氧合肌紅蛋白，致使*值升高。宰后48 h內*值逐漸升高，可能是氧合肌紅蛋白被進一步氧化為褐色的高鐵肌紅蛋白，且該反應不可逆所致。

表1 灘羊肉宰后成熟初期肉色及pH值的變化Table 1 Changes in meat color and pH in Tan sheep meat at the early stage of postmortem aging

2.2 灘羊肉宰后成熟初期HIF-1表達量的變化

大量研究證實HIF-1是多種動物、組織及器官缺氧環境適應性的關鍵調控因子，如牦牛、藏雞、秀麗隱桿線蟲等，然而HIF-1在動物屠宰后對于代謝的調控作用仍缺乏研究。圖1所示為宰后2～48 h內灘羊肉中HIF-1表達量變化，宰后2～24 h內HIF-1表達量呈顯著升高的趨勢（＜0.05），并于24 h達到最大值，為2 h時的1.43 倍，與24 h相比，48 h時HIF-1表達量無顯著變化（＞0.05），但48 h HIF-1表達量仍顯著高于2 h時HIF-1表達量（＜0.05），為2 h時的1.40 倍。6 h時HIF-1表達水平上升至2 h時的1.25 倍，表明宰后由于呼吸與血液循環的停止，灘羊肌細胞立即處于缺氧狀態，受缺氧信號的調控，迅速合成HIF-1復合體。HIF-1的轉錄主要受HIF-1α亞基調控，而HIF-1α是細胞對缺氧反應的重要元件，生理水平條件下由于細胞內氧含量充足，HIF-1α蛋白迅速通過von Hippel-Lindau蛋白因子途徑降解；缺氧條件下，穩定的HIF-1α與HIF-1β形成HIF-1復合體，并與靶基因結合，促進一系列基因的表達，調控機體對缺氧條件的反應和適應。本研究中HIF-1表達量于宰后6 h內迅速升高可能是由于穩定的HIF-1α與HIF-1β形成了HIF-1復合體，導致短時間內HIF-1迅速積累，這說明HIF-1在宰后細胞/組織內的形成過程可能與其在活體中的形成過程類似，均受到缺氧信號的調節，該過程可能反映了動物宰后短期內細胞/組織對于缺氧缺血的調節機制。

圖1 灘羊肉宰后成熟初期HIF-1的表達量Fig. 1 Expression level of HIF-1 in Tan sheep meat at the early stage of postmortem aging

2.3 灘羊肉宰后成熟初期TPI活力的變化

TPI是糖酵解過程的關鍵酶，宰后成熟過程中少量有效能量的產生受糖酵解的調控。如圖2所示，宰后TPI活力在6 h內顯著升高（＜0.05），并于6 h達到最大值，為2 h時的1.07 倍，48 h時顯著降至2 h時的0.73 倍（＜0.05），表明宰后6 h灘羊肌細胞中糖酵解可能已被激活。林珩迅等研究發現豬肉在4 ℃條件下成熟時，TPI活力先升高后降低，并于宰后6 h達到最大值，本研究結果與其一致。尤麗琴等研究發現灘羊背最長肌于4 ℃下成熟4 d時，糖原磷酸化酶、TPI、丙酮酸激酶、磷酸甘油酸異構酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等糖酵解關鍵酶表達量均顯著上調。Schoepflin等研究表明HIF-1形成后立即轉移至細胞核并結合特定的序列。Kumar等認為生理水平條件下，HIF-1的靶基因通過介導紅細胞生成或誘導血管生成從而增加氧氣運輸；或通過增加葡萄糖轉運子和糖酵解酶表達，在低氧狀態下改善組織功能。然而，動物屠宰后機體不能通過紅細胞生成或血管生成增加氧氣運輸，只能通過調整糖代謝以適應缺氧條件，因此，本研究中TPI活力變化可能是由于動物屠宰后缺氧缺血促使6 h內HIF-1表達量迅速升高，HIF-1轉移至細胞核后與靶基因結合，通過調節靶基因促進糖酵解，促使TPI活力升高，以上結果進一步說明HIF-1在宰后成熟過程中對糖酵解的調控作用可能與其在活體中類似。

圖2 灘羊肉宰后成熟初期TPI活力變化Fig. 2 Activity of TPI in Tan sheep meat at the early stage of postmortem aging

2.4 灘羊肉宰后成熟初期能量水平的變化

表2所示為灘羊肉宰后成熟初期能量物質的變化趨勢。ATP是生物體內能量的直接來源，通過水解為機體供能，也是宰后成熟過程中發生各種生理生化反應的必要條件。宰后成熟過程中，由于缺氧缺血，組織不能通過有氧呼吸產生能量，此時，磷酸肌酸在肌酸激酶的催化下將ADP磷酸化為ATP，然而這種轉化只能在短時間內維持ATP的產生；因此，宰后短時間內糖酵解被激活并產生能量。由表2可知，宰后2～48 h內ATP水平顯著降低（＜0.05），12 h后ATP水平降幅較大，宰后48 h ATP水平降至成熟初期的最低值，表明宰后初期細胞內的生理活動消耗了有限的ATP，同時，由于組織內一系列酶促反應，ATP被依次降解為ADP、AMP，導致ATP水平顯著降低。孫志昶研究發現牦牛背最長肌宰后成熟2～48 h內ATP含量顯著下降，本研究結果與其一致。Tassy等發現宰后缺氧和糖酵解的加速造成細胞內ATP含量快速減少。宰后成熟初期灘羊肉中ADP水平呈顯著下降趨勢（＜0.05），2～6 h內ADP水平降幅較大，AMP水平整體呈下降趨勢。羅輝等對秦川牛宰后4 ℃貯藏過程中能量物質變化趨勢的研究表明ATP、ADP、AMP含量均呈下降趨勢。賈青等研究發現牦牛背最長肌貯藏120 h內，ATP、ADP、AMP含量均呈顯著下降趨勢，本研究結果與以上研究結果一致。ATP、ADP、AMP水平均下降可能是由于細胞/組織在缺氧、缺血條件下所生成的ATP水平大幅降低，受ATP水平降低的影響，ADP、AMP水平也隨之降低。高永芳等研究表明，4 ℃貯藏72 h后未處理的牛背最長肌中ATP含量顯著降低，貯藏24～72 h內ADP含量升高，AMP含量于12～24 h內升高，本研究結果與其不一致，可能是物種之間存在差異所致。

表2 灘羊肉宰后成熟初期ATP、ADP和AMP水平的變化Table 2 Changes in the contents of ATP, ADP and AMP in Tan sheep meat at the early stage of postmortem aging

2.5 灘羊肉宰后成熟初期HIF-1表達量與能量水平、TPI活力、pH值及肉色的關系

由表3可知，宰后成熟2～48 h內灘羊肉HIF-1表達量與TPI活力、能量物質水平、肉色及pH值均顯著相關（＜0.05、＜0.01）。其中，HIF-1表達量與ATP及ADP水平呈極顯著負相關（＜0.01），與AMP水平呈顯著負相關（＜0.05），與TPI活力及pH值呈極顯著負相關（＜0.01），與肉色指標*值及*值呈極顯著正相關（＜0.01），與*值呈顯著正相關（＜0.05）。此外，ATP水平與pH值呈極顯著正相關（＜0.01），與*、*值及*值均呈極顯著負相關（＜0.01）；ADP水平與TPI活力及pH值極顯著正相關（＜0.01），與*、*值極顯著負相關（＜0.01），與*值顯著負相關（＜0.05）；AMP水平與pH值極顯著正相關（＜0.01），與*值極顯著負相關（＜0.01），與*值顯著負相關（＜0.05），與*值沒有顯著相關性（＞0.05）；TPI活力與pH值呈極顯著正相關（＜0.01），與*、*值及*值均呈極顯著負相關（＜0.01）；pH值與*、*值及*值均呈極顯著負相關（＜0.01）。劉秋鳳等研究發現宰后24 h北京黑豬pH值與*值呈極顯著負相關，本研究結果與其一致。

表3 宰后成熟初期HIF-1表達量與TPI活力、ATP、ADP和AMP水平、肉色及pH值的相關性分析Table 3 Correlations between the expression level of HIF-1 and TPI activity, ATP, ADP and AMP contents, meat color and pH

相關性分析結果表明HIF-1表達量對宰后糖酵解關鍵酶活力、能量物質水平、肌肉pH值及肉色有顯著影響。研究表明，HIF-1是機體適應缺氧環境最重要的因子，HIF-1復合體形成后立即轉移至細胞核，并與靶基因結合，促進一系列基因的表達，通過級聯調控下游靶基因直接影響機體對低氧環境的反應及適應。本研究結果表明，灘羊肉宰后成熟初期HIF-1表達量迅速升高，HIF-1復合體形成后可能轉移至細胞核與糖酵解基因結合，促進糖酵解相關基因表達，促使糖酵解增強，提高了糖酵解酶TPI活力，致使TPI活力于6 h內顯著升高；活化的糖酵解酶將糖原轉化為乳酸導致乳酸積累，同時伴有丙酮酸的生成，ATP水解生成磷酸，致使肌肉pH值降低；此外，由于宰后糖酵解是組織唯一的供能來源，隨著組織內生理生化反應的進行，ATP迅速被消耗，且伴隨著水解反應的發生，能量物質水平下降。因此，HIF-1可能通過促進糖酵解間接影響了能量物質水平及肌肉pH值下降的速度與程度。此外，有研究表明，糖酵解關鍵酶乳酸脫氫酶活力越高，肉色越穩定。糖酵解決定宰后成熟過程中肌肉pH值下降的速度及程度，而肌肉pH值是影響宰后成熟過程中肉色形成的重要指標。張杏亞等研究發現8 d成熟期內，與秦川牛肌紅蛋白衍生態相關的酶中糖酵解關鍵酶烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乳酸脫氫酶均在成熟期內差異表達。辛建增研究表明糖酵解關鍵酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶催化甘油醛-3-磷酸生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，可還原高鐵肌紅蛋白，進而抑制高鐵肌紅蛋白的累積，提高肉色穩定性。綜上，HIF-1可能是引起宰后能量代謝方式轉變為糖酵解的關鍵因素，對于宰后肉品品質形成具有重要的調控作用。

3 結 論

宰后2～24 h內HIF-1表達量迅速升至最高值，24 h后有所下降，TPI活力于宰后6 h時升至最高值，隨后逐漸降低，宰后48 h內能量物質ATP、ADP、AMP水平均隨成熟時間延長逐漸降低，pH值宰后48 h內顯著降低（＜0.05），*、*值及*值均隨成熟時間延長顯著升高（＜0.05）。宰后成熟2～48 h內灘羊肉HIF-1表達量與TPI活力、能量物質水平、肉色及pH值均顯著相關（＜0.05、＜0.01），可能是由于受宰后缺氧信號誘導，HIF-1表達量于6 h內迅速升高，HIF-1復合體轉移至細胞核與糖酵解基因結合，促進糖酵解相關基因表達，促使糖酵解途徑增強，提高了糖酵解相關酶活力，并降低肌肉pH值。HIF-1可能通過調控宰后糖酵解及肌肉pH值影響肉色。本研究結論有助于理解宰后成熟過程中肉品質形成的復雜機理。