超聲波輔助酸/堿溶解等電點沉淀法提取雞架分離蛋白的組成及其凝膠特性

田金河，王艷婕，周亞旗，藺 芳，王書麗，王利平

（1.新鄉學院生命科學與基礎醫學學院，河南 新鄉 453003；2.河南科技學院生命科技學院，河南 新鄉 453003）

我國是雞肉生產與消費大國，在日常生產與消費過程中會產生大量副產物雞架。傳統的機械采肉及水解方式無法充分利用雞架蛋白，雞架常被用于生產飼料或直接丟棄，造成資源浪費和環境污染。

酸/堿溶解等電點沉淀（isoelectric solubilization/precipitation，ISP）法可用于從水產原料、低值禽肉中提取肉類蛋白，具有工藝簡單、蛋白回收率高以及保持蛋白凝膠特性等優點。Zhao Xue等采用ISP法提取PSE（pale, soft and exudative）雞肉蛋白，發現蛋白二級結構發生明顯變化，相比PSE雞肉糜具有更好的凝膠形成能力（儲能模量增大）。Li Xin等采用堿溶ISP法制備的鵝肝分離蛋白表現出良好的凝膠形成能力以及持水性。ISP法能有效降低PSE肉體系中的促氧化成分如脂類、色素及肌紅蛋白等含量，使蛋白在氧化條件下產生更少的羰基衍生物和席夫堿，從而改善PSE肉蛋白的氧化穩定性。高強度超聲（high intensity ultrasound，HIU）是一種利用空化與微射流效應有效提高生物質提取效率的綠色環保方法。álvarez等采用HIU輔助ISP法提取馬鮫魚分離蛋白，所得蛋白提取率較高。

肉雞胴體分割后，仍有少量雞肉附著于雞架，由于雞骨纖細復雜，造成這些蛋白不易分離。采用鹽溶法提取肉類蛋白耗時較長（24 h），且蛋白不易富集分離（蛋白質量濃度約20～30 mg/mL）。ISP法適于從結構復雜的原料中提取蛋白，如磷蝦和魚排加工副產物等，具有耗時短（約30 min）、提取蛋白含量高（100 mg/g以上）的優勢。但目前鮮見ISP法用于提取雞架蛋白的報道。作為肉雞加工行業的大宗副產物，雞架的高值開發利用可大幅提升行業利潤，減少蛋白資源浪費。本實驗利用HIU輔助ISP法，以雞架為原料提取分離蛋白（protein isolate，PI），研究不同酸/堿溶解及HIU輔助條件下雞架PI組成及其凝膠特性，以期為雞架的高值化利用提供理論數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉、雞架（白條雞去除內臟、胸肉、雞翅、雞腿、雞爪、頭尾后所剩骨架，于-5 ℃保存） 洛陽六合惠泉食品有限公司。

實驗所用化學試劑均為分析純及以上等級。

1.2 儀器與設備

HLQ-8斬拌機、HFM型絞肉機 安徽華菱西廚裝備股份有限公司；TKLD-650L速凍機 廣東南海太康制冷設備有限公司；Neofuge18R臺式高速冷凍離心機上海力申科學儀器有限公司；FJ-200高速分散均質機上海標本模型廠；JN-IID超聲波細胞破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司；T6紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；FiveEasy Plus pH計/LE438電極 瑞士Mettler Toledo公司；Invitrogen電泳分離系統（Mini Gel Tank）、NuPAGE 4%～12% Bis-Tris蛋白預制梯度膠板（厚1.0 mm、12 孔） 美國賽默飛科技公司；TA.XTC質構儀 上海保圣實業發展有限公司；PQ001臺式核磁共振分析儀 上海紐邁電子有限公司；NH310色差計 深圳市三恩時科技有限公司；QUANTA FEG 250電子掃描顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將雞架斬拌為粒徑小于1 cm的顆粒，絞碎（直徑3 mm孔板）2 次制成雞架糜，分裝入聚乙烯樣品袋，速凍機30 min內凍結至-30 ℃以下，后轉移至-80 ℃冰箱內保存。

1.3.2 雞架蛋白溶解特性測定

雞架糜在4 ℃條件下過夜解凍，以質量比1∶7加入4 ℃蒸餾水，高速均質（均質頭直徑15 mm、20 000 r/min、2 min）得到勻漿液。加入堿液（2 mol/L NaOH溶液）或酸液（2 mol/L HCl溶液）分別調節勻漿液pH值至2.0～12.0（以0.5為梯度），待pH值穩定后繼續攪拌5 min，將勻漿液離心（4 ℃、12 000×、10 min，記為第1次離心），取中間層，采用雙縮脲法，以牛血清白蛋白為標準品，測定蛋白質量濃度，以蛋白質量濃度最小的pH值作為雞架蛋白表觀等電點。

1.3.3 HIU處理

為研究HIU對PI提取效率以及PI凝膠特性的影響，在第1次離心前對雞架勻漿液進行HIU處理。將超聲波發生器變幅桿（直徑18 mm）浸入雞架勻漿液（約320 mL）10～20 mm，在20 kHz、900 W、60%振幅條件下以工作3 s、間歇2 s的模式處理3 min。HIU處理期間通過冰水浴控制勻漿液溫度在4 ℃以下。根據Hagenson等的方法計算得到上述HIU處理條件下的能量密度為12.6 W/cm。

1.3.4 ISP法提取PI

采用1.3.2節方法，調節雞架勻漿液pH值至3.0或11.5，并對勻漿液離心（4 ℃、12 000×、10 min），取中間層蛋白溶液調節pH值至雞架蛋白表觀等電點后進行第2次離心（4 ℃、12 000×、10 min），所得沉淀即為PI，于4 ℃以下保存。酸溶或堿溶以及是否通過HIU處理所得的PI樣品分別以酸溶PI（PI3.0H、PI3.0）以及堿溶PI（PI11.5H、PI11.5）表示。采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（凱氏定氮法）分別測定對照（雞胸肉）、雞架、第1次離心沉淀和各PI樣品中的蛋白含量。

1.3.5 PI組成分析

參考田金河等的方法稍作改動，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析所提取的PI組成。將凝膠置于緩沖溶液（8 mol/L脲素、20 mmol/L Tris、2%（質量分數）SDS、2%（體積分數）巰基乙醇，pH 8.0）中，以200 V恒壓模式電泳分離，上樣量15 μg，采用Mark12蛋白標準樣品（10～200 kDa）作為參照。

1.3.6 PI凝膠的制備

根據Zhao Xue等的方法稍作修改。將PI調節至pH 7.0±0.1，測得蛋白含量為100 mg/g。按質量分數1%向PI中加入NaCl，充分攪拌均勻，注入50 mL離心管，離心（500×、4 ℃、3 min）排氣，然后80 ℃水浴20 min制成凝膠。凝膠自然冷卻后轉移至4 ℃冰箱隔夜保存。以1.3.1節相同方法獲取雞胸肉糜直接制備的凝膠作為對照。

1.3.7 凝膠特性測定

采用CIE L*a*b*色差系統，取PI凝膠光滑切面分別測定*、*、*值，平行測定3 次，結果取平均值。凝膠白度按式（1）計算。

PI凝膠質構測定參考Zhao Xue等的方法。樣品于室溫平衡30 min后，切為圓柱形（直徑25 mm、高20 mm），采用P/50探頭TPA模式，兩次壓縮間隔1 s，測前、測中、測后速率分別為2、1、2 mm/s，記錄硬度和彈性測定結果。

PI凝膠持水力測定參考Zhao Xue等的方法稍作修改。按式（2）計算蒸煮損失率。取常溫凝膠樣品，稱質量后裝入100 mL離心管（底部墊有5 層濾紙），離心（20 ℃、10 000×、10 min），再次稱質量，按式（3）計算離心損失率。

式中：為加熱前凝膠質量/g；為凝膠冷卻后用濾紙吸干表面水分后質量/g；為凝膠樣品質量/g；為離心后凝膠質量/g。

1.3.8 低場核磁共振分析凝膠水分分布

根據計紅芳等的方法稍作修改。稱取約2.0 g凝膠樣品放入核磁測試管（直徑15 mm）內，測定水分弛豫時間。測定溫度30 ℃，質子共振頻率20 MHz，采樣頻率100 kHz，半回波時間250 μs，重復掃描16 次，掃描間隔110 ms，掃描回波數12 000，利用CPMG序列測定得到指數衰減圖形，經Multi Exp Inv Analysis軟件反演，得到弛豫時間峰值、峰面積比例、峰起始時間和結束時間等。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察凝膠微觀結構

根據Zhao Xue等的方法稍作改動。將凝膠樣品切成長方體（2 mm×4 mm×4 mm），置于4 ℃、體積分數2.5%戊二醛溶液（用0.1 mol/L磷酸鈉溶液配制，pH 7.0）浸泡48 h后，0.1 mol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH 7.0）清洗3 次，再進行梯度乙醇脫水（體積分數30%～100%，8 個梯度，每個梯度15 min），乙酸異戊酯浸泡15 min，然后冷凍干燥和噴金處理（厚度約10 nm），以10 kV加速電壓進行掃描電子顯微鏡觀察。

1.4 數據處理與分析

以上指標至少重復3 次測定，計算平均值及標準差，利用SAS 8.1分析軟件，采用Duncan Multiple Range進行不同樣品平均值間的方差分析，確定差異顯著性，置信度95%。采用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 雞架蛋白溶解特性

由圖1可知，未經HIU處理時，隨著雞架勻漿液酸/堿性逐漸增強，蛋白質量濃度逐漸增加，在pH 3.0和pH 11.5處，蛋白質量濃度分別增加至11.87 mg/mL和13.37 mg/mL，繼續增強酸性或堿性，蛋白質量濃度不再有明顯變化。pH 5.5時勻漿液中蛋白質量濃度最低，即pH 5.5為雞架蛋白的表觀等電點。上述溶解特性與雞胸肉蛋白基本一致，表明肌原纖維蛋白（骨骼肌）是雞架中的主要蛋白。HIU處理可提高勻漿液中蛋白質量濃度，HIU處理后，在pH 11.5處，蛋白質量濃度提高至14.38 mg/mL，有研究報道，馬鮫魚肉勻漿蛋白質量濃度在HIU處理后也得到顯著提高。HIU促進蛋白溶解主要由于其空穴效應。這一效應的微米級物理振蕩可能促進了骨骼肌與雞骨架的分離以及肌原纖維蛋白超微結構的崩潰。根據上述結果，綜合考慮PI得率、酸堿液消耗量等因素，選擇pH 3.0和pH 11.5作為本實驗ISP法提取雞架PI的溶解pH值，并分別研究在pH 3.0和pH 11.5下HIU處理對PI組成以及凝膠特性的影響。

圖1 不同pH值下不同處理雞架勻漿液中蛋白質量濃度Fig. 1 Protein concentration in the homogenate of chicken ribs treated by different methods as a function of pH

2.2 蛋白樣品的SDS-PAGE分析結果

如圖2所示，雞架與雞胸肉的主要蛋白組分一致，均為肌原纖維蛋白，且雞架SDS-PAGE圖譜中較雞胸肉新出現的4 個條帶可能來源于骨骼內的膠原蛋白。與雞胸肉相比，PI含有更多小分子質量蛋白（分子質量約14.4 kDa以及＜10 kDa），可能來自于骨髓。

第1次離心沉淀的主要蛋白組分為4 種膠原蛋白、少量肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）、肌動蛋白以及小分子質量蛋白，堿溶后第1次離心沉淀與酸溶后第1次離心沉淀相比，MHC、肌動蛋白以及小分子質量蛋白條帶數量減少，且HIU處理加強了減少的趨勢，說明第1次沉淀中肌原纖維蛋白已經溶解并與膠原蛋白分離，堿溶和HIU處理均能促進肌原纖維蛋白溶出。

酸溶PI相對于雞架新增3 個條帶，而MHC條帶明顯減弱，表明MHC發生了降解，這與Marmon等的研究結果一致，可能是由雞架附著的骨骼肌所含內源蛋白酶引起。HIU處理減弱了MHC的降解，可能是HIU抑制了蛋白酶活性。有報道稱HIU會對蛋白三級甚至二級構象產生一定影響，如HIU對胰蛋白酶活性具有一定抑制作用。堿溶PI主要蛋白組成與雞胸肉基本一致，HIU處理增加了堿溶PI中MHC和肌動蛋白含量，表明堿溶解和HIU處理均有助于雞架中肌原纖維蛋白的溶解。

圖2 雞胸肉、雞架、第1次離心沉淀以及PI組成SDS-PAGE分析結果Fig. 2 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of protein profiles of chicken breast, chicken ribs, first centrifugal precipitate and PI

2.3 PI凝膠質構特性

硬度和彈性是反映凝膠質構特性的主要指標。如表1所示，堿溶PI凝膠硬度和彈性顯著高于酸溶PI凝膠（＜0.05），原因可能在于：一方面，酸溶PI中MHC發生降解，含量減少、分子鏈長度縮短，影響了蛋白的交聯聚集，如Chen Yichen等的研究表明蛋白酶的降解導致鱒魚加工副產物蛋白無法形成凝膠；另一方面，堿溶處理使肌球蛋白更多的疏水基團和巰基暴露，有助于蛋白凝膠的形成。Zhao Xue等研究也發現堿溶ISP蛋白的凝膠硬度和彈性顯著高于酸溶ISP蛋白。HIU處理對酸溶PI凝膠質構特性有顯著改善（＜0.05），可能由于HIU處理減弱了MHC的降解，但HIU處理對堿溶PI凝膠質構特性沒有顯著影響。此外，堿溶PI凝膠質構特性與雞胸肉凝膠沒有較大差異，表明堿溶PI保持了良好的凝膠特性。

表1 不同蛋白樣品所制備凝膠的特性Table 1 Gel properties of PI and control samples

2.4 PI凝膠持水性

凝膠的蒸煮損失率反映了凝膠形成過程中的蛋白親水與疏水特性，而離心損失率則能夠反映凝膠蛋白束縛水的能力和凝膠微觀結構，兩者從不同角度反映凝膠的持水性。如表1所示，堿溶PI凝膠的蒸煮損失率和離心損失率均顯著低于酸溶PI凝膠，與對照凝膠沒有顯著差異。HIU處理顯著降低了酸溶PI凝膠的蒸煮損失率和離心損失率（＜0.05），增強了持水性，但對堿溶PI凝膠影響不顯著。凝膠的持水性主要取決于蛋白網絡的致密性和完整程度及其保持水分的能力，組織均勻的三維網絡具有更強的持水力。凝膠中分子化學鍵種類、肌漿蛋白含量等也會影響凝膠持水性。酸溶PI凝膠的持水性較差，可能是由于MHC的過度降解導致大分子間作用力減弱，無法形成致密的三維網絡結構，HIU處理減弱了MHC降解程度，因而增強了酸溶PI凝膠的持水性。而堿溶PI保持了良好的持水能力，一方面由于其含有大量完整的肌球蛋白；另一方面肌球蛋白構象的展開會引起較多疏水基團和游離巰基暴露，有利于蛋白交聯形成三維網絡結構。

2.5 PI凝膠白度

PI凝膠白度均顯著低于對照凝膠（＜0.05），這是由于雞架中骨髓含有的肌紅蛋白和血紅蛋白等呈色蛋白在制備PI的離心過程中沉淀（對應圖2中泳道7～10底部小分子質量蛋白條帶）。酸溶PI會回收少量呈色蛋白，且酸處理更易引起這類蛋白構象改變，因此酸溶PI凝膠白度較高。Panpipat和Rawdkuen等制備的酸溶PI凝膠均較堿溶PI凝膠具有更高的白度。HIU處理使酸/堿溶PI凝膠白度均顯著提高，這可能是由于HIU能夠引起呈色蛋白構象發生變化，使其顏色變淺、白度增加。

2.6 PI凝膠水分分布

如圖3所示，凝膠樣品中水分弛豫時間（）存在4 類：（0～1 ms）、（1～10 ms）、（80～120 ms）以及（900～1 700 ms），分別對應蛋白大分子表面吸附水（和）、毛細管作用力束縛水（不易流動水，）以及自由水（），以各峰面積所占百分比表示不同狀態水分相對含量，分別記為、、及。由表2可知，5 組樣品均大于95%，表明凝膠中主要為不易流動水。未經HIU處理時，酸溶PI凝膠的、及均顯著大于堿溶PI凝膠（＜0.05），表明后者對水分子具有更強的結合力和束縛力，二者雖無顯著差異，但考慮到酸溶PI凝膠較堿溶PI凝膠具有更大的蒸煮損失率（18.41%和12.34%），可以推測后者不易流動水實際含量要高于前者，表明堿溶PI凝膠具有更強的持水力，Zhao Xue等也得出類似結果。HIU處理使酸溶PI凝膠及均顯著減小（＜0.05），但對堿溶PI凝膠和均無顯著影響，表明HIU處理能夠顯著提高酸溶PI凝膠的持水力，但對堿溶PI凝膠影響不大。對照凝膠和均顯著小于PI凝膠，表明其水分吸附能力優于PI凝膠，但與堿溶PI凝膠差異不顯著，結合凝膠蒸煮損失率和離心損失率，推測PI凝膠的持水機理與對照凝膠可能不同，這可能與蛋白聚集方式不同以及PI含有較多小分子質量蛋白有關。

圖3 凝膠水分分布規律Fig. 3 Distribution of water in gel samples

表2 凝膠樣品中的水分分布及相對含量Table 2 T2 and peak area fractions of four states of water in gel samples

2.7 PI凝膠微觀結構

如圖4所示，未經HIU處理時，酸溶PI凝膠微觀結構與堿溶PI凝膠相比，組織結構明顯粗糙、孔洞大，后者則較為均勻致密，具有明顯的蛋白分子交聯結構，與對照凝膠接近，表明堿溶PI具有良好的凝膠形成能力，其均勻致密的凝膠結構也很好地解釋了其良好的質構（硬度和彈性）和持水性。HIU處理能夠顯著改善酸溶PI凝膠的微觀結構，表明酸溶PI凝膠微觀結構較差主要是由于MHC降解。而HIU處理前后堿溶PI凝膠的微觀結構均較均勻、致密，表明HIU處理對堿溶PI凝膠微觀結構形成沒有顯著影響。對照凝膠微觀結構與Shao Junjie等的研究結果非常接近，而Zhao Xue等發現酸溶PSE雞胸肉蛋白凝膠的微觀結構也較堿溶法提取蛋白凝膠更為粗糙，但具有明顯的蛋白交聯結構，優于本實驗中酸溶PI凝膠微觀結構，可能是由于MHC未發生降解。

圖4 PI凝膠微觀結構的掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Microscopic structure of gels prepared from PIs and chicken breast meat

3 結 論

ISP法能夠高效提取雞架蛋白，所得PI主要組分為肌原纖維蛋白和多種小分子質量蛋白。酸溶條件引起MHC降解并使PI凝膠特性變差，但HIU輔助能夠改善這一現象。堿性PI具有良好的凝膠形成能力，凝膠質構和持水性均與對照凝膠無顯著差異。HIU處理可促進堿溶條件下蛋白溶解，且不影響PI形成凝膠的能力。PI中含有較多呈色蛋白，導致其制備的凝膠白度較對照凝膠低。雞架堿溶PI具有與雞胸肉蛋白相當的凝膠形成能力，對雞架這一大宗低值蛋白資源的增值利用具有重要意義。