南極磷蝦油、魚油與花生四烯酸油對骨質疏松癥小鼠脂質代謝的影響

白曉琳，薄鈺瑩，丁 寧，王慶慧，韓立華，王靜鳳,*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.青島墨爾文中學，山東 青島 266106）

骨質疏松是一種常見的骨代謝失衡疾病，表現為骨質流失、骨微結構損傷和骨髓脂肪增多等。臨床數據表明，骨質疏松和機體的脂質代謝紊亂密切相關。在絕經后婦女中，骨密度與總膽固醇、低密度脂蛋白水平呈顯著負相關；且大量研究表明，骨質減少的患者骨髓脂肪含量高于健康人群。骨髓是唯一的脂肪細胞和骨細胞直接相互作用的組織，骨髓脂肪組織位于骨髓腔內，在健康成人體內占總脂肪比例超過10%，在衰老及骨質疏松、糖尿病等許多疾病中具有重要作用。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和花生四烯酸對于機體脂質代謝具有重要作用。研究表明補充DHA、EPA后，高脂飲食小鼠白色和棕色脂肪組織中的脂質積累量降低。二十碳五烯酸磷脂酰膽堿（eicosapentaenoic acid-phosphatidylcholine，EPA-PC）和二十碳五烯酸磷脂酰絲氨酸（eicosapentaenoic acidphosphatidyl serine，EPA-PS）可抑制肝臟脂肪酸合成，通過增強肝臟脂肪酸β氧化改善脂質代謝紊亂。轉錄組學研究結果顯示，適量補充花生四烯酸可降低肝臟脂肪積累，其調節脂質積累效應具有劑量依賴性。不同分子形式的DHA、EPA對脂質代謝的影響不同，常見形式包括乙酯型和甘油三酯型，而關于磷脂型DHA、EPA的研究相對較少，且大多數研究聚焦于DHA、EPA及花生四烯酸單獨的多不飽和脂肪酸對于脂質代謝的影響，對于骨質疏松癥脂質代謝的研究也鮮見系統報道。

因此，本研究采用市面上最常見的-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）補充劑，富含乙酯型DHA和EPA的魚油（fish oil，FO），與富含磷脂型DHA和EPA的南極磷蝦油（Antarctic krill oil，AKO）作對比；并通過最具代表性的-6 PUFA花生四烯酸油（arachidonic acid oil，AAO）作為對照，探究兩種不同分子形式的DHA、EPA與花生四烯酸對骨質疏松脂質代謝的影響，旨在為骨質疏松癥患者飲食提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康雌性C57BL/6J小鼠，8 周齡，體質量（18.0±2.0）g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2015-0001。動物飼養環境溫度為（23±1）℃，相對濕度為40%～50%，12 h/12 h明暗交替，實驗期間自由飲食飲水。

AKO（磷脂質量分數為60.38%，脂肪酸組成中EPA相對含量為26.32%、DHA相對含量為16.64%，比例約為3∶2，EPA與DHA總相對含量為42.96%）由中國海洋大學食品科學與工程學院食品科學與人類健康實驗室提供；FO（總脂肪酸質量分數為99.15%，其中，EPA相對含量為49.29%、DHA相對含量為32.53%，比例約為3∶2，EPA與DHA總相對含量為81.82%）購自陜西森朗生物化工有限公司；AAO（基于生物合成技術獲得的一種-6多不飽和脂肪酸油劑；花生四烯酸質量分數為46.21%）購自武漢嘉必優生物工程有限公司。

總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒 上海生工生物工程公司；M-MLV逆轉錄酶 日本TaKaRa公司；熒光染料 瑞士羅氏公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

GK99-UNIGAMMA X-RAY PLUS雙能X射線骨密度儀意大利I’CAN公司；YLS-16A小動物骨骼強度測定儀濟南益延科技發展有限公司；BH-2型顯微鏡 日本Olympus公司；RM-2016型石蠟切片機 徠卡儀器（上海）有限公司；GL-20M型高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器公司；Ultra Trurrax T18 basic 型高速勻漿機德國IKA公司；Model680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；LightCycler480s實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 動物建模與實驗設計

50 只8 周齡健康雌性C57BL/6J小鼠適應性喂養一周后，隨機選取10 只小鼠不進行去卵巢手術，但進行開腹腔與縫合的假手術，以其作為假手術組（Sham），另外40 只進行雙側去卵巢手術以建立骨質疏松癥模型。術后3 d，將建模成功的小鼠分為模型對照組（OVX）、南極磷蝦油組（AKO，150 mg/kg）、魚油組（FO，80 mg/kg）、花生四烯酸油組（AAO，140 mg/kg）。假手術組和模型對照組灌胃生理鹽水，其余各組按照南極磷蝦油和魚油中DHA、EPA總含量相等且與花生四烯酸含量相等的原則，灌胃相應劑量的受試物，灌胃體積為10 mL/kg。受試物干預12 周，末次給藥，禁食不禁水，稱體質量，小鼠摘眼球取血后處死，收集血清離心取上清用于后續TC、TG濃度測定。迅速剝離左右股骨置于10%中性甲醛溶液中固定，用于骨強度（骨密度、生物力學性能）測定及骨組織形態學觀察。剝離腹腔白色脂肪稱質量，體脂比按下式計算。取肝臟稱總質量并取部分肝臟于10%中性甲醛溶液中固定，將剩余肝臟包錫箔紙，放入液氮，于-20 ℃保存，用于后續TC、TG濃度測定。

1.3.2 骨密度測定

使用雙能X射線骨密度儀在小動物模式（電流150 mA、電壓76 kV）下進行股骨骨密度測定。

1.3.3 生物力學性能測定

使用YLS-16A小動物骨骼強度測定儀測定股骨骨折斷力。

1.3.4 骨組織形態學觀察

股骨于10%中性甲醛溶液固定24 h，并于10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣液中脫鈣2 周后，進行石蠟切片（厚度7 μm）。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后于顯微鏡下觀察并拍照。并利用Image J軟件對相應參數進行分析，具體包括骨小梁厚度、骨小梁分離度和脂肪細胞數目。

1.3.5 肝臟組織形態學觀察

肝臟于10%中性甲醛溶液固定，流水沖洗12 h，利用梯度乙醇脫水后，石蠟包埋切片（厚度6 μm），進行HE染色，置于顯微鏡下觀察各組組織形態。

1.3.6 血清及肝臟中TC、TG水平的測定

按照試劑盒說明書要求，測定小鼠血清及肝臟中TC和TG的水平。

1.3.7 肝臟脂質合成關鍵基因相對表達量測定

按照總RNA抽提試劑盒說明書提取肝臟組織mRNA，利用實時熒光定量PCR儀測定小鼠肝臟中脂質合成相關基因、、、的mRNA相對表達量。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，擴增45 個循環。以作為內參基因。目的基因引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of target genes

1.4 數據處理與分析

所有數據均以平均值±標準差表示，使用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）法進行組間差異比較，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 AKO、FO和AAO對OVX模型小鼠體質量和白色脂肪質量的影響

如圖1所示，與Sham組相比，OVX組小鼠體質量增加量極顯著升高（＜0.01），且腹腔白色脂肪質量與體脂比也極顯著升高（＜0.01）。與OVX組相比，經AKO與FO干預后，小鼠體質量增加量極顯著降低，白色脂肪組織質量及體脂比極顯著降低；而灌胃AAO組小鼠體質量增加量升高了18.74%，白色脂肪質量及體脂比均未發生明顯變化。結果表明兩種-3 PUFA均能顯著抑制去卵巢骨質疏松小鼠體內脂肪累積，改善絕經后肥胖，AKO效果優于FO；而-6 PUFA AAO無此作用。

圖1 AKO、FO和AAO對OVX小鼠體質量增加量（A）、白色脂肪質量（B）及體脂比（C）的影響Fig. 1 Effects of AKO, FO and AAO on body mass gain (A), white adipose tissue mass (B) and body fat percentage (C) in OVX mice

2.2 AKO、FO和AAO對OVX模型小鼠骨強度的影響

骨密度是衡量骨骼強度的一個黃金指標，與骨強度呈正相關。Byrne等利用骨密度評判骨質疏松癥患者骨折預后的情況。如圖2A所示，相比于Sham組，OVX組小鼠骨密度顯著降低（＜0.05）。與OVX組相比，經AKO與FO干預后，小鼠骨密度均不同程度地升高，AKO組升高了7.14%（＜0.01），FO組升高了2.78%（＜0.05）；AAO灌胃后小鼠骨密度則極顯著下降（＜0.01）。同時圖2B顯示，與OVX組相比，經AKO與FO干預后，小鼠骨骼的生物力學性能得到不同程度的改善，骨折斷力增加，說明抵抗骨折斷的能力增強，而AAO干預則呈現相反的效果。結果表明，兩種-3 PUFA均可提高去卵巢小鼠骨強度及生物力學性能，且AKO效果優于FO；而-6 PUFA AAO則降低OVX小鼠骨密度與骨骼生物力學性能。

圖2 AKO、FO和AAO對OVX小鼠骨密度（A）與骨折斷力（B）的影響Fig. 2 Effects of AKO, FO and AAO on bone mineral density (A) and fracture (B) in OVX mice

2.3 AKO、FO和AAO對OVX模型小鼠骨組織形態學的影響

骨組織形態學能夠直觀地反映骨微結構與骨髓腔脂肪細胞數目的情況。如圖3、4所示，OVX組出現了嚴重的骨微結構破壞，提示骨質疏松癥的發生；經AKO干預后，OVX小鼠骨小梁顯著變厚，連續性變好；而AAO干預會進一步破壞OVX小鼠骨微結構。經去卵巢手術后，相比于Sham組，OVX組脂肪細胞數目極顯著增加（＜0.01）。與OVX組相比，AKO與FO干預后脂肪細胞數目極顯著減少，而AAO干預后脂肪細胞數目更多，嚴重破壞了骨微結構。結果表明，兩種-3 PUFA均可改善骨質疏松導致的骨微結構損傷，并減少骨髓腔中的脂肪積累，且AKO干預效果優于FO；而-6 PUFA AAO則會增加骨髓腔中的脂肪細胞數目，加劇脂質代謝紊亂。

圖3 AKO、FO和AAO對OVX小鼠骨組織形態的影響（×200）Fig. 3 Effects of AKO, FO and AAO on bone morphology in OVX mice (× 200)

圖4 AKO、FO和AAO對OVX小鼠脂肪細胞數量（A）、骨小梁厚度（B）及骨小梁分離度（C）的影響Fig. 4 Effects of AKO, FO and AAO on adipocyte number (A),trabecular thickness (B) and trabecular separation (C) in OVX mice

2.4 AKO、FO和AAO對OVX模型小鼠肝臟的影響

不同組別的肝體比（肝臟質量/體質量）無明顯差異（圖5A），然而，肝臟組織學結果顯示，與Sham組相比，OVX組小鼠肝臟細胞胞質中出現明顯的白色脂滴空泡（圖5B）；經AKO與FO干預后，肝臟細胞排列整齊、界限分明，脂滴在細胞質中消失，無明顯的脂肪變性，且AKO組肝臟細胞形態更接近Sham組；而經AAO干預后，小鼠肝臟細胞排列散亂，細胞中脂滴空泡增加，肝臟脂質積累。表明兩種-3 PUFA可改善骨質疏松導致的肝臟脂質積累，且AKO干預效果優于FO；而-6 PUFA AAO則進一步加劇脂質代謝紊亂，促進肝臟脂質積累。

圖5 AKO、FO和AAO對OVX小鼠肝體比（A）、肝臟組織形態學（B）的影響（×200）Fig. 5 Effects of AKO, FO and AAO on hepatosomatic index (A) and hepatic histomorphology (B) in OVX mice (× 200)

2.5 AKO、FO和AAO對OVX模型小鼠血清及肝臟脂質水平的影響

血清及肝臟中TC、TG的濃度是反映機體脂質水平的重要指標。如圖6A所示，相比于Sham組，OVX組血清中TC、TG濃度均顯著升高。與OVX組相比，經AKO或FO灌胃后，AKO組血清TC、TG濃度分別顯著下降了9.77%（＜0.01）和11.54%（＜0.05），FO組血清中TC、TG濃度未發生顯著變化；經AAO干預后，血清中TC、TG濃度分別升高了18.55%（＜0.01）和15.14%（＜0.05）。由圖6B可知，與OVX組相比，經AKO與FO干預后，肝臟TC、TG含量也較OVX組下降，而AAO干預后則呈升高的趨勢。提示兩種-3 PUFA均能抑制OVX小鼠血脂及肝臟脂質水平的升高，且AKO效果更為顯著；而-6 PUFA AAO則促進脂質水平的上升。

圖6 AKO、FO和AAO對OVX小鼠血清（A）及肝臟（B）中TC、TG水平的影響Fig. 6 Effects of AKO, FO and AAO on TC and TG levels in the serum (A) and liver (B) of OVX mice

2.6 AKO、FO和AAO對OVX模型肝臟脂質合成關鍵基因的影響

由圖7可知，與Sham組相比，OVX組小鼠肝臟中、、和的mRNA表達水平極顯著升高，表明去卵巢小鼠肝臟中脂質合成增加；與OVX組相比，經AKO及FO干預后，小鼠肝臟中脂質合成關鍵基因表達水平顯著或極顯著下降，其中AKO效果整體上更佳；而灌胃AAO后，上述基因表達水平均不同程度提高，與OVX組相比，、、和的mRNA表達水平分別升高了31.85%、21.12%、40.71%、18.35%。表明兩種-3 PUFA均有抑制脂質合成的作用，且AKO效果優于FO；而-6 PUFA AAO則加速了脂質在肝臟中的合成。

圖7 AKO、FO和AAO對OVX小鼠肝臟中脂質合成關鍵基因mRNA表達水平的影響Fig. 7 Effects of AKO, FO and AAO on the mRNA expression of lipid synthesis-related genes in OVX mice

3 討 論

本實驗采用雙側去卵巢手術建立絕經后骨質疏松模型，比較了AKO、FO和AAO 3 種PUFA油脂對骨質疏松模型小鼠脂質水平的影響，提示3 PUFA能夠改善骨質疏松引起的脂質積累，且磷脂型PUFA優于乙酯型PUFA，即AKO效果優于FO；而-6 PUFA AAO則進一步加劇了骨質疏松小鼠體內的脂質代謝紊亂。

絕經后骨質疏松癥是最為常見的一種骨質疏松癥，誘發原因是體內雌激素水平降低。絕經后骨質疏松患者常伴有肥胖與白色脂肪組織的過度積累，骨骼強度下降的同時伴隨著骨髓腔脂肪細胞數量增多，成骨細胞數量減少；增加的脂肪組織又會通過釋放炎癥因子來影響骨代謝。本研究中，相比于正常小鼠，OVX小鼠體質量明顯上升，腹腔脂肪組織增多，骨髓腔中脂肪細胞數目是Sham組的2 倍多。Cho等通過全基因組關聯研究證明了骨質疏松與肥胖之間密切的聯系。類似地，采用雙側卵巢切除建立骨質疏松小鼠模型，通過脂質組學分析發現，小鼠股骨骨質疏松癥的發生與脂質的許多變化有關，包括脂酰、甘油、甘油磷脂、鞘脂和固醇，表明骨質疏松癥確實誘發了脂代謝紊亂。因此，骨質疏松與脂質代謝密不可分，骨質疏松的發生導致體內脂質代謝紊亂，研究骨質疏松模型中脂質代謝問題具有重要意義。

南極磷蝦油含有豐富的磷脂型-3 PUFA，如磷脂型EPA和磷脂型DHA，有助于改善軟骨結構，抑制軟骨細胞肥大分化及關節軟骨異常凋亡。相比于高脂飼料喂養的小鼠，添加AKO喂養的小鼠血脂異常得到改善，并能夠顯著降低血清低密度脂蛋白膽固醇含量，從而改善肥胖。本實驗中，AKO的攝入明顯改善了去卵巢導致的骨質疏松，進一步減少了肝臟、血清中的脂質積累。乙酯型FO能夠通過激活軟骨細胞自噬進程來抑制骨性關節炎小鼠的軟骨退變進程。同時，研究發現超重和肥胖成人補充乙酯型-3 PUFA，可改善其血脂異常和胰島素抵抗，并改變脂蛋白的脂肪酸組成。本研究使用乙酯型FO緩解了骨質疏松小鼠骨強度的降低；同時這種乙酯型PUFA油脂減少了骨髓腔中脂肪細胞的數目，改善了OVX小鼠的血脂異常。分子形式的不同可能影響DHA和EPA在體內的吸收和代謝。磷脂形式可使血液中的DHA與EPA維持在較高濃度，而乙酯型的生物利用率低且消化吸收困難。不同分子形式的DHA、EPA的結構特點可能決定了它們不同的生理功能。

綜上所述，攝入-3 PUFA能夠改善絕經后骨質疏松癥導致的脂質積累，并且磷脂型DHA、EPA效果優于乙酯型DHA、EPA；而-6 PUFA的攝入會加劇脂質代謝紊亂，提升骨質疏松患者疾病加重的風險。