牡蠣蛋白酶解物對小鼠慢性酒精性肝損傷的保護作用

蔡雯雯，葛小東，李 娜，龔世禹，劉 斌，陳福泉，曾 峰,*

（1.閩臺特色海洋食品加工及營養健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；2.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；3.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021）

牡蠣是一種常見的海洋無脊椎動物，盛產于我國沿海地區，如福建、廣東、廣西、海南、山東等。牡蠣在中國傳統醫藥學中有著重要的地位，具有滋陰潛陽、鎮靜斂汗、固精止帶、化痰軟堅的功效，與其他中草藥搭配熬制服用，可以治療眩暈、自汗、盜汗等疾病，且效果顯著。牡蠣肉與牡蠣殼均可入藥，藥用價值廣泛，且牡蠣肉可食用，味道鮮美可口、營養豐富。此外，牡蠣提取物、酶解物及活性肽等活性成分還具有保肝、抗氧化、抗疲勞、抗衰老、降血糖、降血脂等多種生物活性。

肝臟在人體的新陳代謝中起著重要的作用。肝臟疾病主要是由病毒、過度飲酒和有毒化學物質等引起。反復損傷性炎癥可導致肝炎、肝纖維化、肝硬化，甚至能使機體因肝衰竭而死亡。酒精性肝病中最嚴重的一種是酒精性肝炎，死亡率在20%～40%左右，多達75%的患者在確診為嚴重酒精性肝炎后90 d內死亡。過量飲酒導致的酒精性肝病成為當今日益嚴重的公共衛生問題。全世界每年約有330萬 人死于過度飲酒，約占總死亡人數的5.9%，過度飲酒可引起許多代謝性疾病。正常情況下，酒精通過胃和小腸吸收，然后通過血液進入肝臟。在肝臟中，乙醇通過乙醇脫氫酶被氧化成乙醛，乙醛經乙醛脫氫酶代謝成乙酸，經尿液排出體外。大量或長期飲用酒精飲料會使肝臟的解毒能力過載，導致酒精和乙醛的代謝物在血液和肝臟中積累，肝臟中過量的乙醛和乙醇的氧化代謝物會激活微粒體細胞色素P450系統，從而增加細胞色素P4502E1（CYP2E1）的活性，產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）。因此，氧化損傷被認為是飲酒的主要危害之一，也是慢性酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）發病機制中的關鍵靶點。目前，針對牡蠣酶解物對慢性ALD的保護作用鮮有報道。

本實驗構建ALD小鼠模型，通過不同劑量的牡蠣酶解物干預慢性ALD小鼠，探究牡蠣酶解物對慢性ALD小鼠的血液和肝臟生化指標的影響，分析肝臟組織形態、關鍵基因mRNA轉錄水平上的變化，基于16S rRNA高通量測序技術研究牡蠣酶解物對慢性ALD小鼠腸道菌群的影響，探究其保肝作用機制，以期為海洋生物資源的深加工及營養功能性食品的研究與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級（SPF）雄性KM小鼠購自福州吳氏實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（京）2014-0004。

牡蠣 福州市金山大潤發超市；中性蛋白酶北京索萊寶公司；RNA提取試劑盒、PrimeScipt反轉錄試劑盒、基因組去除試劑、熒光定量試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；Phusion Flash高保真聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混液、GeneJET凝膠回收試劑盒、Ion Plus片段文庫試劑盒 美國賽默飛世爾科技有限公司；谷丙轉氨酶（alaninetransaminase，ALT）試劑盒、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒、總蛋白定量測定試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

XPR105DR電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SpectraMax iD3酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；SMZ18光學顯微鏡 北京普瑞賽司有限公司；A2481 PCR儀 上海智巖科學儀器有限公司；ABI7300熒光定量PCR儀、UltiMate 300分析型液相色譜-質譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣酶解物的制備

將牡蠣洗凈，磨成肉糜狀，分別用95%（體積分數，下同）乙醇溶液、55%乙醇溶液和水提取得到濾液I、濾液II和濾液III，經濃縮和冷凍干燥，分別得到牡蠣95%乙醇提取物（OY95）、牡蠣55%乙醇提取物（OY55）和牡蠣水提取物（OYWE）。取水提剩余物殘渣，加入10 倍體積的去離子水，用1 400 U/g中性蛋白酶酶解（pH 7、4 h）得到濾液IV，經濃縮和凍干后得牡蠣酶解物（OYEH）。OY95、OY55、OYWE、OYEH的干質量得率按公式（1）計算。

1.3.2 牡蠣酶解物的多肽質譜分析

稱取1 mg牡蠣酶解物，溶于1 mL 0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），將牡蠣酶解物溶液樣品轉移至對應的10 kDa超濾管中，于4 ℃離心（12 000×、10 min），上清液真空冷凍干燥。稱取1 mg干燥樣品重新溶于20 μL PBS，進行質譜分析。

人體胃腸道微生態受到出生方式、喂養習慣、飲食、藥物、應激、地域、年齡等多種因素的影響[1]。胃腸道微生態參與機體的物質代謝、炎癥信號通路轉導、調控適應性免疫、維持腸道的完整性、保護機體免受致病菌損傷[2-4]。微生態的失衡與人體胃腸道疾病、糖尿病、肥胖、代謝綜合征、自身免疫性疾病及腫瘤等相關，尤其是在人體胃腸道等多種疾病中觸發了重要的病理進程。而胃腸道微生態與胰腺疾病的研究也引起了學者們的關注。

一級質譜分離的樣品經離心干燥后，重新溶解于甲醇（色譜級）中進行液相色譜-質譜聯用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）分析。將3 μL溶解后的樣品上樣到nanoViper C預柱（3 μm，100 ?），然后保持流速300 nL/min，沖洗脫鹽5 min，采用Easy nLC 1000納升液相色譜系統，樣品脫鹽后再經分析柱分離，分析柱是C反相色譜柱，流動相A為0.1%（體積分數，下同）甲酸-水，B為2%乙腈-水，洗脫條件：0～7 min，5%～20%A；7～9 min，20%～32% B；9～20 min，32%～55%A。采用PEAKS Studio 8.5軟件進行數據加工處理和檢索分析。

1.3.3 動物分組與慢性酒精性肝損傷實驗

實驗小鼠經過1 周適應性喂養期后，將其隨機分為4 組，分別為正常組、模型組、牡蠣酶解物低劑量組（OYEL組）和牡蠣酶解物高劑量組（OYEH組），每組10 只。連續灌胃給予牡蠣酶解物4 周，每周記錄小鼠體質量，每天上午9時牡蠣酶解物實驗組小鼠分別灌胃給予0.25 mL高劑量（80 mg/（kg·d））和低劑量（40 mg/（kg·d））牡蠣酶解物（溶于無菌蒸餾水中），正常組、模型組灌胃給予等體積生理鹽水。下午4時給予正常組小鼠灌胃5 mL/kg生理鹽水，給予模型組、OYEL、OYEH組小鼠5 mL/kg體積分數50%乙醇溶液。末次灌胃后，各組小鼠隔夜禁食16 h后眼眶取血，頸椎脫臼處死小鼠。

1.3.4 血清與肝臟生化指標的測定

取小鼠肝臟稱質量，按公式（2）計算肝臟指數。

用離心管收集小鼠血液，室溫靜置1 h后3 000×離心10 min，取上清液按試劑盒說明測定ALT、AST含量和TBA濃度。

將9 倍體積的生理鹽水加入肝組織中，將肝組織在冰水浴中勻漿。將制備的勻漿在4 ℃條件下2 500×離心10 min，取上清液，根據試劑盒說明書測定肝臟TG、MDA、GSH含量。

1.3.5 肝組織形態學分析

取肝組織迅速置于質量分數4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋。經常規脫蠟、脫水后進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，通過40×顯微鏡拍照觀察肝組織形態。

1.3.6 肝臟基因的mRNA轉錄水平分析

從肝組織中提取總RNA，并逆轉錄成cDNA。采用實時熒光定量PCR（quantitative PCR， qPCR）測定、、mRNA轉錄水平。小鼠基因引物序列如表1所示。PCR條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變形25 s，60 ℃退火30 s，40 個循環。通過Rotor-gene Q軟件進行數據分析，通過2法計算每個基因的相對轉錄水平。

表1 TLR4、NF-κB、TNF-α和β-actin的引物序列Table 1 Primer sequences used for amplication of TLR4, NF-κB,TNF-α and β-actin

1.3.7 小鼠腸道內容物16S rRNA基因高通量測序

1.3.7.1 樣品的預處理

分別取正常組、模型組、OYEL組、OYEH組各6 只小鼠的盲腸腸道內容物2 g，加入1×PBS，反復清洗，離心（3 000×、10 min）后獲得沉淀物。

1.3.7.2 基因組DNA的提取

使用十六烷基三甲基溴化銨法對各組的DNA進行提取，引物對應區域為16S V3～V4區。

1.3.7.3 牡蠣酶解物對小鼠腸道菌群影響的分析

基于R語言，繪制影響酒精性肝損傷的生化指標與屬水平上的腸道菌群的關聯熱圖，使用Cytoscape 3.6.1軟件繪制相關性網絡圖。

1.4 數據處理與分析

使用DPS 6.50數據處理軟件和Excel軟件對數據進行統計分析。使用單因素方差分析統計分析差異顯著性，采用GraphPad 7.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 牡蠣不同極性提取物及酶解物的干質量得率

牡蠣4 種提取物的干質量得率如圖1所示，牡蠣提取物的干質量得率依次為OY95（27.13%）＞OYEH（25.16%）＞OYWE（19.7%）＞OY55（9.29%）。牡蠣提取物的總得率為81.28%。

圖1 牡蠣不同提取物的干質量得率Fig. 1 Dry mass yields of different extracts from oyster meat

2.2 牡蠣酶解物的多肽組成及序列

表2列出了牡蠣酶解物中主要多肽的序列。OYEH主要有20 個多肽序列。肽的豐度從高到低（前5）依次為GHPGLPGDAGPEGPRGNPG、IDLGAVN、EHPVL、GPAGPIGPR、MFLGPQ。豐度為前5的肽的一級質譜圖和二級質譜圖如圖2所示。

表2 HPLC-MS鑒定OYEH的肽譜Table 2 Peptide profile of OYEH identified by high performance liquid chromatography-mass spectrometry

圖2 前5 種高豐度肽的一級質譜圖與二級質譜圖Fig. 2 Primary and secondary mass spectra of the first five highabundance peptides

2.3 牡蠣酶解物對小鼠體質量變化及狀態的影響

從圖3可以看出，在飼養第1周，各組間小鼠體質量差異不顯著，2～4 周正常組的體質量顯著高于其他組（＜0.05），在第2周后，OYEH組的體質量高于OYEL組與模型組。

通過4 周的動物實驗，觀察并記錄了小鼠的外觀、行為。結果發現正常組毛發光亮緊湊，行動靈活自如。模型組毛發暗淡無光、雜亂無章，且精神狀態渙散，有嗜睡現象。OYEL與OYEH組的情況較模型組有所改善。

圖3 牡蠣酶解物對小鼠體質量的影響Fig. 3 Effect of enzymatic hydrolysate from oyster on body mass of mice

2.4 牡蠣酶解物對小鼠血清生化指標的影響

肝組織膽固醇代謝的最終產物是TBA，通過測定小鼠血清TBA含量水平可間接反映肝臟受損傷的程度。如圖4A、B所示，OYEH組的ALT、AST活力都顯著低于模型組（＜0.05）。從圖4C可以看出，模型組的TBA濃度極顯著高于正常組（＜0.01），OYEL組與模型組相比沒有顯著差異，而OYEH組與模型組相比差異顯著（＜0.05），表明OYEH顯著降低ALD小鼠血清中TBA濃度。

圖4 牡蠣酶解物對小鼠血清ALT（A）、AST（B）活力和TBA濃度（C）的影響Fig. 4 Effect of oyster enzymatic hydrolysate on serum ALT (A) and AST (B) activity and TBA concentration (C) in mice

2.5 牡蠣酶解物對小鼠肝臟生化指標、肝組織形態的影響

從圖5A可以看出，模型組的肝臟指數極顯著高于正常組（＜0.01），OYEL與OYEH組的肝臟指數顯著低于模型組（＜0.01、＜0.05）。從圖5B可以看出，模型組的TG含量極顯著高于正常組（＜0.01），OYEL與OYEH組的TG含量都顯著低于模型組（＜0.05、＜0.01）。從圖5C中可以看出，模型組的GSH含量極顯著低于正常組（＜0.01），OYEL組和OYEH組的GSH含量極顯著高于模型組（＜0.01）。從圖5D可以看出，模型組的MDA含量顯著高于正常組（＜0.05），OYEL與OYEH組的MDA含量顯著低于模型組（＜0.05）。

圖5 牡蠣酶解物對小鼠肝臟指數（A）和TG（B）、GSH（C）、MDA（D）含量的影響Fig. 5 Effect of oyster enzymatic hydrolysate on liver index (A), and TG (B), GSH (C) and MDA (D) contents in mice

從圖6A可以看出，正常組的肝細胞較完整，無細胞破裂、自溶或壞死的現象，分布均勻，肝細胞呈規則的球狀。圖6B中，肝小葉周圍的細胞消融嚴重，且肝小葉中有溶血的情況，細胞分裂嚴重；細胞形狀不規則，出現皺縮，大小不均一。肝細胞之間的邊緣模糊，有脂肪空泡。由圖6C、D可以看出，OYEL與OYEH干預后，相對于模型組，細胞的溶血情況有改善，其中OYEH組呈現出最接近正常組小鼠肝臟組織狀態。

圖6 牡蠣酶解物對ALD小鼠肝臟形態的影響Fig. 6 Effect of enzymatic hydrolysate from oyster on liver morphology in mice with chronic alcoholic liver injury

2.6 牡蠣酶解物對小鼠肝臟相關基因mRNA轉錄水平的影響

牡蠣酶解物對慢性ALD小鼠肝臟中、和在mRNA轉錄水平上的影響如圖7所示。與正常組相比，模型組小鼠肝臟、和mRNA的轉錄水平都顯著升高（＜0.05）。與模型組相比，OYEL組與OYEH組3 個基因的轉錄水平都顯著下調（＜0.05、＜0.01）。表明牡蠣酶解物能降低小鼠體內炎癥因子的mRNA轉錄水平。

圖7 牡蠣酶解物對小鼠肝臟TLR4（A）、NF-κB（B）和TNF-α（C）基因轉錄水平的影響Fig. 7 Effect of oyster enzymatic hydrolysate on transcription levels of TLR4 (A), NF-κB (B) and TNF-α (C) genes in liver of mice

2.7 小鼠腸道菌群多樣性及其與生化指標的關聯性分析結果

2.7.1 小鼠腸道菌群物種相對豐度分析結果

用OYEH飲食干預小鼠4 周后，測定正常組、模型組、OYEL組和OYEH組小鼠腸道菌群的相對豐度，如圖8所示，各實驗組在門水平上的主要優勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其余菌門相對豐度較低。與正常組相比，模型組的Firmicutes相對豐度極顯著降低（＜0.01），Bacteroidetes的相對豐度極顯著升高（＜0.01），模型組Firmicutes/Bacteroidetes的比值降低。與模型組相比，OYEL組與OYEH組中Firmicutes相對豐度顯著升高（＜0.05），OYEH組中Bacteroidetes相對豐度極顯著降低（＜0.01）。表明在門水平上，牡蠣酶解物對慢性ALD小鼠腸道菌群的物種豐度影響顯著。

圖8 小鼠腸道菌群門水平上的物種相對豐度Fig. 8 Relative abundance of intestinal microflora at phylum level in mice

根據腸道菌群測序結果，選擇正常組和牡蠣酶解物干預組屬水平上豐度前3的物種，由圖9可知，在屬水平上的優勢菌屬主要有、和。與模型組比較，牡蠣酶解物干預組3 種菌屬的相對豐度均呈上升趨勢，推測這3 種菌屬具有益生作用。

圖9 小鼠腸道菌群屬水平上的優勢菌相對豐度Fig. 9 Relative abundance of dominant intestinal microflora at the genus level in mice

2.7.2 小鼠腸道菌群豐度與ALD生化指標水平的關聯性分析結果

在屬水平上選擇豐度在前30的物種，基于Spearman相關檢驗指數分析，研究屬水平下小鼠腸道菌群豐度與影響ALD生化指標水平之間的統計學相關性，如圖10所示，在各組中富集的、豐度與肝臟指數、血清ALT活力和AST活力、MDA含量、TG含量、、和基因的轉錄水平呈正相關（＞0），與體質量呈負相關（＜0），豐度與AST活力、MDA含量呈負相關（＜0）。使用Spearman相關檢驗||＞0.35，繪制腸道菌群豐度與影響ALD生化指標之間的可視化網絡圖，如圖11所示，、、基因轉錄水平、MDA含量與豐度呈正相關（＞0）。

圖10 腸道菌群豐度與影響ALD生化指標水平之間的統計學Spearman相關性Fig. 10 Statistical Spearman’s correlations between intestinal microbiota abundance and parameter affecting alcoholic liver disease

圖11 腸道菌群豐度與影響ALD生化指標之間的可視化網絡圖Fig. 11 Visual network between intestinal flora and parameters influencing chronic alcoholic liver injury

3 討 論

牡蠣中含有豐富的生物活性物質，以牡蠣為原料，對其中活性成分依次進行提取和制備，通過動物實驗研究牡蠣酶解物對ALD的保護作用，并結合腸道菌群分析其保肝的作用機制。肝臟是酒精代謝的主要器官，機體攝入的酒精過多會導致不同程度的肝損傷。ALD的發病機制與乙醇及其代謝物對肝臟的毒性、氧化應激、脂質過氧化、炎性細胞因子、免疫、機體穩態失調以及環境和個體因素有關。目前，常用血清中ALT、AST活力作為判斷肝損傷程度的指標，在正常機體內，血清中ALT、AST含量不高，但當肝功能異常或者肝細胞結構破壞時，ALT、AST就會由破損處釋放進入血液，導致血液中兩者的含量升高，肝中含量降低。在本研究中，模型組的ALT、AST活力顯著高于正常組（＜0.01、＜0.05），經牡蠣酶解物干預后，血液中的ALT、AST活力顯著低于模型組（＜0.01、＜0.05），減輕了肝損傷程度。此外，體質量和臟器指數是反映機體健康與否的重要指標，酒精的攝入使小鼠體質量與肝臟指數發生變化。機體攝入過量酒精易造成脂肪酸代謝紊亂，積累大量TG，酒精到達肝組織后，能導致肝細胞膜上的脂質過氧化產物MDA含量升高，在本研究中，用OYEH干預可明顯降低血清中TG和MDA含量，這表明OYEH可明顯改善脂肪酸代謝紊亂和肝細胞脂肪變性。過量的酒精攝入使肝細胞中的抗氧化酶GSH活性降低，破壞機體氧化平衡，進而導致肝組織受損引起炎癥反應，本研究中的肝臟組織形態分析結果表明，相較于模型組，OYEH的干預顯著改善了肝細胞溶血情況，說明牡蠣酶解物能緩解小鼠酒精性肝損傷。Zhao Xiaoyan等通過給予青蒿素治療嚴重ALD小鼠，其中模型組小鼠肝細胞中度壞死并出現炎性浸潤現象，而青蒿素高劑量組小鼠肝細胞只有輕度壞死和炎性浸潤，結果表明青蒿素可預防ALD。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、Toll樣受體4（toll-like recepror 4，TLR4）、核轉錄因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是引起酒精性肝損傷的3 種重要炎癥因子，酒精的攝入會誘導炎癥因子的表達，在本研究中，與模型組比較，OYEL組與OYEH組的、、的mRNA轉錄水平均顯著下調（＜0.05），進一步說明牡蠣對ALD有保護作用。

基于16S rRNA高通量測序技術研究牡蠣酶解物對ALD小鼠腸道菌群的影響。研究發現，在酒精作用下，Firmicutes豐度減少，變形菌門豐度增加，本研究中，與模型組對比，牡蠣酶解物干預使Firmicutes豐度增加。在屬水平上，OYEH干預使、和的豐度增加。研究證實，能減輕小鼠結腸炎癥狀，本研究中牡蠣酶解物干預ALD小鼠后，豐度增加，推測具有益生作用進而發揮抗炎效應。攝入酒精導致的豐度降低，屬于益生菌的一種，對維持腸道菌群穩態起著至關重要的作用。研究表明，酒精性肝病會使腸道菌群穩態發生變化，菌群穩態發生改變會激活某些通路，促進炎性因子如TLR4的產生。本研究中，豐度與、、基因的表達水平呈正相關，Wu Minna等研究表明豐度與甘露糖凝集素缺陷小鼠中的S24-7呈顯著正相關，但是的具體功能仍不清楚，的豐度與體質量呈反比關系。Luo Xinming等研究狼瘡小鼠的腸道菌群，發現豐度隨著疾病的嚴重程度顯著增加，推測與某些免疫疾病的發生有很大關系。此外，Miranda-Ribera等發現是促炎菌株，本研究結果也證實了這一點。Du Haiyang等研究黃連解毒湯對小鼠腸道菌群的影響，結果表明服黃連解毒湯能降低豐度，證實了屬于有害菌。由此可知，牡蠣酶解物能夠通過維持菌群結構的穩態，預防ALD引起的腸道菌群結構失衡。

綜上所述，牡蠣酶解物能夠抑制ALD小鼠肝臟內脂質過氧化，提高肝臟內抗氧化酶活力，減輕小鼠肝臟細胞的損傷程度，并可以提高小鼠益生腸道菌群豐度，表明其對ALD具有保護作用。