寒地蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮提取方法的優化及含量比較

李福森，張 勇，宋吉玲，高 偉，王戰偉，王雨亞，陳麗娜

(1.長春師范大學中心實驗室，吉林 長春 130032；2.遵義市紅花崗區南關中學，貴州 遵義 563000)

蒲公英是菊科、蒲公英屬Taraxacum草本植物，可食藥兩用，且資源豐富。植株包括根、莖、葉、花和種子[1-2]。據報道，蒲公英屬植物遍及世界各地，數量約2 000多種，我國有70種左右[3]。蒲公英性寒，味苦、甘，對疔瘡腫毒、乳癰、目赤、咽痛、肺癰等癥的治療效果較好[4]。現代藥理學研究表明，其具有抗炎、抗癌、抗高血糖、消腫散結等功效[5-8]。蒲公英中含有多種化學成分，主要包括黃酮類、甙類、萜類、酚類、膽堿等[9]。在其全草中，黃酮類化合物含量豐富，黃酮類具有較好的抗氧化、抑菌、延緩衰老和提高免疫力等作用[10]。

對中草藥中的化學成分進行研究，提取過程較為關鍵，相對于回流、煎煮法等傳統提取方法，更高效便捷的超聲、微波提取等應用也愈加廣泛[11]。其中，超聲提取利用空化、振動攪拌、高速粉碎等作用，使組織破壁、分解，達到細胞中有效成分迅速溶于溶劑的目的[12-13]，在中藥有效成分提取中應用較多[14]。

黃酮類化合物作為蒲公英中含量較高的成分，對其進行深入研究具有一定的現實意義[15]。目前，關于蒲公英中不同部位的總黃酮提取的研究相對較少。本文以蒲公英的葉、生根和熟根為研究對象，通過回流法及超聲法提取蒲公英中有效成分，利用正交實驗優化總黃酮提取的最佳條件，為蒲公英中黃酮類成分的開發利用提供一定的實驗依據。

1 實驗材料及儀器

蒲公英生根、熟根和葉來源于吉林省延邊州安圖縣新合恒源蒲公英生產專業合作社(7月份采摘)；蘆丁標準品購自Sigma 公司，純度大于99%；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑，購自北京精細化學品有限公司。

FA1204A電子分析天平(德國賽多利斯公司)；DU800紫外分光光度計(美國 Beckman 公司)；KH-250DB 數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)；ZUOT-SYG4數顯恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司)；FW-100高速萬能粉碎機(北京中興偉業儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

精密稱取蒲公英樣品粉末(葉、生根或熟根)約1 g(準確至0.001 g)，加入適量乙醇溶液，進行超聲或回流提取，過濾，濾液減壓回收， 95%的乙醇定容至 10 mL，得到不同的蒲公英總黃酮提取物，放入 4℃冰箱保存，待測。

2.2 總黃酮含量測定

以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定蒲公英中總黃酮含量，分別移取0.5 mg/mL蘆丁標準液 0，0.02，0.04，0.06，0.08 和 0.10 mL 于 6支離心管中，依次加入 5% NaNO260 μL、無水乙醇400 μL，混勻后放置 5 min。繼續加入60 μL 10% 的Al(NO3)3，混勻，放置 5 min。加入 1 mol/L NaOH，混勻，放置10 min。在波長510 nm下測吸光度A，平行3次。以蘆丁的質量濃度(mg/mL)為橫坐標， 吸光度為縱坐標繪制標準曲線。總黃酮含量為提取物中總黃酮在粗提物中的質量百分比。

2.3 正交實驗設計

2.3.1 超聲提取法正交實驗

參考單因素實驗結果，選擇料液比、乙醇體積分數、占空比、超聲功率和超聲時間5個考察因素，每個因素選取4個水平進行正交實驗，因素與水平編碼如表1所示。采用正交實驗優化超聲法提取寒地蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮的實驗條件。

表1 超聲提取法正交實驗因素與水平編碼表

2.3.2 回流提取法正交實驗

參考單因素實驗結果，選擇料液比、乙醇體積分數、回流時間、回流次數和回流溫度5個考察因素，在每個因素選取4個水平進行正交實驗，因素與水平編碼如表2所示。采用正交實驗優化回流法提取寒地蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮的實驗條件。

表2 回流提取法正交實驗因素與水平編碼表

3 實驗結果與分析

3.1 標準曲線繪制

以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，方程為y=2.818 9x+0.212 9，回歸系數r為0.998 1。在0.024～0.071 μg/mL范圍內，質量濃度與吸光度呈現良好線性關系。

3.2 優化超聲法提取蒲公英中總黃酮條件

分別采用正交實驗優化蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮提取的條件，以蒲公英熟根的正交實驗結果進行說明和分析。直觀分析法見表3，比較5個因素的R值，表明料液比是最主要影響因素，其他因素的影響程度依次為占空比、超聲時間、超聲功率和乙醇體積分數，蒲公英熟根中總黃酮提取的最優方案是A2B2C4D4E3，既料液比為1∶20 g/mL、乙醇體積分數為70%、占空比為 100%、超聲功率為100 W、超聲時間為40 min。方差分析結果表明(表4)，去掉最大誤差項B后做方差分析，在其余4個因素中，只有A的P值小于0.05，其影響達顯著水平。根據F值可知，影響蒲公英熟根中總黃酮得率因素的主次順序為A、C、E、D，與直觀分析結果一致。

表3 正交實驗結果及直觀分析

表4 方差分析結果

根據正交實驗結果，蒲公英葉中的總黃酮提取最優方案是A2B1C3D4E1，既料液比為1∶20 g/mL、乙醇體積分數為60%、占空比為80%、超聲功率為100 W、超聲時間為25 min，有利于蒲公英葉中總黃酮的提取。蒲公英生根中的黃酮提取的最優方案是A1B3C1D1E1，既料液比為1∶10 g/mL、乙醇體積分數為80%、占空比為40%、超聲功率為40 W、超聲時間為25 min。

3.3 優化回流法提取蒲公英中總黃酮條件

采用正交實驗優化回流法對蒲公英葉、生根和熟根中總黃酮的提取條件，以蒲公英葉中總黃酮提取的正交實驗結果進行說明和分析。根據表5的數據，通過直觀分析比較5個因素的極差R值，發現料液比是影響蒲公英葉中總黃酮提取效果的最重要因素，其他因素的影響程度依次為乙醇體積分數、回流溫度、回流時間和回流次數。通過正交實驗確定最佳提取方案是A4B4G1H2I4，既在料液比為1∶40 g/mL、乙醇體積分數為90%、時間為30 min、提取為2 次、回流溫度為90℃時，有利于蒲公英葉中總黃酮得率提高。通過方差分析(表6)可知，去掉最大誤差項H(回流次數)，其余4種因素中只有A(料液比)的P值小于0.01，說明其影響極顯著。從各因素的F值可得出，影響蒲公英葉中總黃酮得率因素的主次順序為A、B、I、G，與直觀分析結果一致。

表5 正交實驗結果及直觀分析

表6 方差分析結果

根據正交實驗結果，蒲公英生根中的總黃酮提取的最優方案A4B2G3H2I4，即在料液比1∶40 g/mL、回流時間60 min、乙醇體積分數70%、回流溫度90℃，提取2 次，有利于蒲公英生根中總黃酮的提取。而蒲公英熟根中總黃酮提取的最佳方案為A2B3G3H4I1，在料液比為1∶20 g/mL、乙醇體積分數為80%、回流溫度為60℃、提取4次，每次回流60 min，在熟根中所提取的總黃酮含量較高。

3.4 超聲和回流提取方法對蒲公英不同提取物中總黃酮含量影響

根據上述優化后的提取條件，分別采用超聲提取法和回流提取法對蒲公英生葉、生根和熟根中總黃酮進行提取，平行3次，結果如表7所示。

表7 不同提取方法對蒲公英中總黃酮含量影響

結果表明，回流法更有利于蒲公英葉中總黃酮提取，而超聲法提取蒲公英生根和熟根中總黃酮含量更高。導致這種情況的原因可能由于葉與根的細胞結構不同，提高溫度更有利于葉中黃酮類化合物的提取，而超聲提取能夠增強溶劑對于根細胞的穿透力，通過對物料細微局部進行撞擊，促使植物組織破壁、分解，從而使細胞中的化學成分能夠迅速進入溶劑相中，因此，超聲提取的蒲公英生根和熟根中總黃酮含量遠高于回流提取物。結果表明，超聲法提取蒲公英中黃酮類化合物是一種迅速、高效的方法，更有利于蒲公英中黃酮資源的工業生產以及合理利用。

通過對比蒲公英葉、生根中總黃酮含量發現，生根中的總黃酮含量與葉差距較大。特別是超聲提取物，生根中的總黃酮含量是蒲公英葉中含量的三倍。而生根回流提取物中的總黃酮含量相對于超聲提取物有所減少，但仍高于葉，兩者含量相差較小。對比蒲公英的熟根和生根提取物中總黃酮含量發現，生根中的總黃酮含量略高于熟根，原因可能是在生根炒制的過程中，由于溫度較高，造成了黃酮類化合物的損失。

4 結語

本文以蒲公英提取物中總黃酮含量為指標，分別優化超聲、回流提取長白山寒地蒲公英葉、生根和熟根實驗條件，根據優化后的條件分別對不同的蒲公英部位進行提取，比較不同提取方法以及不同部位提取物中總黃酮含量的差異。結果表明，蒲公英生根中總黃酮含量最高，其次是熟根，葉中總黃酮含量相對最低；相對于回流提取，超聲提取更有利于蒲公英中總黃酮提取率的提高，特別是對于蒲公英生根和熟根中總黃酮的提取效果較好，且超聲提取具有省時高效、節能環保等優點。本研究為蒲公英的深加工和綜合利用提供了探索及參考。