莖瘤芥甬榨2號小孢子發育時期與花器官形態的相關性分析

王 潔 孟秋峰 周潔萍 任錫亮 高天一 安學君

（1 寧波市農業科學研究院，浙江寧波 315040；2 浙江省余姚市小曹娥鎮人民政府，浙江余姚 315475）

莖瘤芥（var.Tsen et Lee）是起源于我國的十字花科蕓薹屬芥菜種作物，俗名榨菜，富含人體所需的多種營養物質，加工后可作為下飯菜及休閑小菜食用，深受廣大消費者歡迎。莖瘤芥在我國長江中下游地區和四川等地廣泛種植，地方特色優勢明顯，推動其產業持續穩定發展，對提高冬閑田和冬季勞動力利用率，推行低碳農業，促進農業增效、農民增收和農業經濟發展具有重大意義。

目前，我國莖瘤芥育種以雜交育種為主，采用傳統多代自交純化的方法獲得純合自交系一般需要6～8 代，甚至更長的時間，費時、費工、費力。游離小孢子培養技術是近年來發展較為成熟的單倍體育種技術，可以簡化自交系的純合過程，縮短育種年限，提高育種效率（石江鵬 等，2017）。大量研究表明，選材是游離小孢子培養能否成功的決定性因素（申娟 等，2008）。沈進娟等（2012）研究表明，處在單核靠邊期和雙核初期的莖瘤芥小孢子成胚率較高。通過細胞學及顯微鏡觀察等方式確定小孢子的發育時期較為精確，但是操作繁瑣、耗時耗力。前人在葉用芥菜、菜薹（菜心）、普通白菜（小白菜）等十字花科作物上的研究表明，小孢子的不同發育時期與花器官外部形態存在顯著相關性（吳康云 等，2012；龐強強 等，2019；楊延紅 等，2020）。但關于莖瘤芥小孢子發育時期與花器官外部形態的相關性研究未見報道。本試驗選擇長江中下游地區廣泛種植的甬榨2 號為試材，通過對其小孢子不同發育時期的花器官外部形態及相關指標進行觀察、測定，研究莖瘤芥小孢子不同發育時期與花器官外部形態的相關性，以期簡化田間取材方法，快速精準取材，為莖瘤芥游離小孢子培養在育種上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試莖瘤芥品種為寧波市農業科學研究院選育的甬榨2 號，2020 年10 月上旬播種育苗，11 月上旬定植在寧波市農業科學研究院高新農業試驗園區，小區面積5 m，3 次重復，株距20 cm，行距25 cm，每小區種植150 株，常規田間管理。2021 年5 月，于植株盛花期選擇晴天的上午進行取材。

1.2 花蕾形態觀察及相關指標測定

參照楊延紅等（2020）的方法，每小區隨機選取新鮮花序3 個，觀察不同發育時期花蕾的大小、飽滿程度、顏色等。在解剖鏡下用鑷子和解剖針去除花萼，小心剝開花瓣，取出花藥，觀察記錄花瓣和花藥顏色；使用游標卡尺測量花蕾、花瓣、花藥的縱徑和橫徑。

1.3 小孢子細胞核觀察

利用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染料對小孢子細胞核進行染色，在正置熒光顯微鏡（DMLB，Leica，Germany）下觀察拍照。

1.4 花藥半薄切片觀察

參照王潔（2015）的方法進行包埋處理及切片，使用1%亞甲基蘭染色后在正置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 小孢子超微結構觀察

參照王潔（2015）的方法進行超薄切片處理，使用醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液和檸檬酸鉛溶液各染色15 min，干燥后于Hitachi ModelH-7650型透射電鏡下觀察拍照。

1.6 數據處理

采用Excel 軟件對試驗數據進行統計、分析，利用SPSS 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 甬榨2 號小孢子不同發育時期的細胞學及超微結構特征

通過對不同發育時期莖瘤芥甬榨2 號小孢子的形態進行觀察，并結合半薄切片以及超微結構觀察發現（圖1～3、表1），小孢子母細胞時期，細胞表面被一層厚厚的胼胝質包裹，有1 個細胞核，細胞形狀不規則，細胞質內有豐富的細胞器和小液泡，內部分化程度較低；四分體時期，小孢子的外部為四裂狀，由4 個細胞組成聯合體，外面被一層胼胝質包裹，經染色后可以看到4 個細胞核同時出現在同一個聯合體里，小孢子內有較多的片層膜結構，如多聚核糖體，線粒體體積較小；隨后，四分體外面的胼胝質壁水解，體積較小的單個小孢子被釋放出來，逐漸發育成圓形或近圓形，細胞質內含有許多小液泡和質體，質體體積較小，花粉外壁開始發育并逐漸變厚，此時細胞內只有1 個細胞核，細胞核較大且位于細胞中央，即單核早中期；隨著發育進程的推進，細胞體積不斷增大，形狀呈圓形，細胞內的小液泡逐漸融合，形成大液泡，萌發溝逐漸形成，細胞質濃厚，有豐富的細胞器，線粒體體積較大，細胞核靠近細胞的邊緣，因此稱為單核靠邊期，也稱單核后期；之后，單核小孢子進行第1次有絲分裂，由于是不均等分裂，因此形成1 個體積較大、靠近液泡的營養核和1 個體積較小、貼近細胞壁的生殖核，花粉內壁形成，質體較多，即雙核時期；最后，生殖核分裂為2 個精子，此時小孢子細胞內可看到3 個核，即1 個營養核和2 個精核，細胞質內有淀粉粒和脂滴分布，電子密度較高，花粉外壁形成電子密度較高的3 層結構，最外層為覆蓋層，中間為基粒棒層，底部為基足層，為三核時期。

圖1 甬榨2 號小孢子不同發育時期細胞核染色觀察結果

圖2 甬榨2 號小孢子不同發育時期花藥半薄切片觀察結果

圖3 甬榨2 號小孢子不同發育時期超微結構觀察結果

表1 甬榨2 號小孢子不同發育時期的細胞學形態特征

2.2 甬榨2 號小孢子不同發育時期與花器官形態特征的相關性

對莖瘤芥甬榨2 號小孢子不同發育時期的花器官外部形態進行觀察發現（圖4、表2），小孢子母細胞時期，花蕾很小，花萼完全包裹著花藥，花萼和花瓣顏色均為淺綠色，花藥綠色；四分體時期，花蕾較小，花萼仍然完全包裹著花藥，花萼和花瓣顏色均為綠色，花藥淡黃綠色；單核早中期，花蕾稍大，完全閉合，花萼包被著花藥，花萼綠色，花瓣和花藥均呈現黃綠色；單核后期，花蕾逐漸膨大，仍完全閉合，花萼包被著花藥，花萼綠色，花瓣淡黃色，花藥黃綠色；雙核時期，花蕾明顯膨大，花萼未張開，顏色為綠色，花藥比花瓣短，顏色為黃綠色，花瓣淡黃色；三核時期，花蕾表現為細長、蓬松的形態，花萼未張開，顏色為黃綠色，花瓣明顯長于花藥，未露出萼片或部分露出，花瓣和花藥顏色均為黃色，花萼黃綠色。由此可以通過觀察花蕾的外觀形態，花藥和花瓣的顏色，以及花瓣、花藥長度等，快速將處于單核后期和雙核時期的花蕾區分開來。

圖4 甬榨2 號小孢子不同發育時期的花蕾形態變化

表2 甬榨2 號小孢子不同發育時期的花器官外部形態特征

甬榨2 號小孢子不同發育時期的花器官形態指標測定結果見表3。進一步計算8 個指標的平均值，進行差異顯著性分析。結果表明（表4），甬榨2號的花蕾縱徑、花蕾橫徑、花藥縱徑、花藥橫徑、花瓣縱徑均隨著小孢子發育進程的推進呈現逐漸增長的趨勢，其中花蕾縱徑和花蕾橫徑在各個發育時期均表現出顯著性差異，可以根據這2 個指標實現小孢子發育時期的快速甄別。例如，小孢子單核后期的花蕾縱徑范圍在3.50～3.79 mm 之間，橫徑在1.92～2.21 mm 之間。此外，單核后期的花藥縱徑與其他發育時期也存在顯著性差異，亦可以依據該指標將單核后期的小孢子與其他時期進行區分。

表3 甬榨2 號小孢子不同發育時期的花器官外部形態指標

表4 差異顯著性分析結果

3 討論與結論

植物小孢子的發生經歷了小孢子母細胞時期、四分體時期、單個釋放的小孢子時期，單個釋放的小孢子時期又經歷了單核早期、單核中期、單核后期（也稱單核靠邊期）、雙核時期及成熟時期（McCormick，1993）。大部分植物成熟時期的花粉為二核花粉，即成熟的花粉粒中含有1 個較小的生殖核和1 個較大的營養核。少數植物，如十字花科作物，隨著雙核花粉的不斷發育，生殖細胞還要再進行一次有絲分裂，隨即形成含有2 個生殖核和1 個營養核的三核細胞。本試驗中，通過DAPI 染色發現莖瘤芥甬榨2 號的成熟花粉粒中含有3 個細胞核，屬于三核花粉，這與蘿卜、普通白菜（小白菜）等十字花科作物上的研究結果一致（李丹 等，2008；楊延紅 等，2020）。

游離小孢子培養受多種因素的影響，選擇合適生長時期的材料是小孢子能否誘導成功的決定性因素。研究表明，大多數作物處在單核時期的小孢子在適宜培養條件下容易被誘導發育成胚（龐強強 等，2019）。沈進娟等（2012）研究發現，莖瘤芥單核后期和雙核初期的小孢子成胚率較高。通過細胞學觀察可以確定小孢子的發育時期，但在實際操作中因工作量巨大，一般不會對每個小孢子的發育時期進行檢測。前人研究表明，小孢子發育時期與花器官的外部形態之間存在一定的相關性（李丹等，2008；龐強強 等，2019；楊延紅 等，2020）。本試驗通過觀察甬榨2 號小孢子不同發育時期花蕾、花藥等花器官形態特征發現，處在單核后期和雙核時期的花蕾飽滿，花瓣淡黃色，花藥黃綠色，與其他幾個時期相比特征明顯，能夠很容易將二者與其他時期區分開來；而雙核時期的花瓣長于花藥，又可快速將這二者區分開。由于單核后期和雙核時期的花蕾還處于閉合狀態，實際操作中可用鑷子小心將花萼和花瓣撥開，以便觀察。進一步對甬榨2 號小孢子不同發育時期的花蕾縱徑、橫徑、縱橫比，花藥縱徑、橫徑、縱橫比，花瓣縱徑及瓣藥比等8 項指標進行統計學分析，花蕾縱徑和花蕾橫徑在各個發育時期均存在顯著性差異，可以作為該品種區分小孢子不同發育時期的花器官形態指標。除此之外，單核后期的花藥縱徑與其他發育時期也存在顯著性差異，亦可以依據該指標將單核后期的小孢子與其他時期進行區分。但是就實際操作的可行性而言，進行小孢子培養時建議采用直接測量花蕾縱徑實現田間的精準取材既經濟快捷又方便準確，可以大幅提高小孢子培養的效率。這與甘藍類、白菜類等十字花科作物開展小孢子培養時一般以花蕾長度作為參照確定小孢子培養時期的結論一致。然而，本試驗中處在單核后期的花蕾縱徑范圍為3.50～3.79 mm，與沈進娟等（2012）、楊明貴等（2015）在其他莖瘤芥品種上得到的數值均存在一定差異，這可能是由于芥菜類蔬菜類型豐富，不同品種之間花蕾長度差異較大。今后應對不同生態類型、不同地區的大量多樣化莖瘤芥品種進行測定分析，最終確定田間快速、精準取材的標準。