叢枝菌根真菌對鹽堿脅迫下杜梨幼苗生長和生理特性的影響

龔遠博，胡吉懷，胡丁猛，許景偉，王延平*

(1 山東農業大學 林學院，山東泰安 270018；2 山東省林業科學研究院，濟南 250014)

鹽堿脅迫是農林業生產面臨的最嚴重的環境問題之一。中國鹽堿土壤面積達9. 9 × 107hm2，是世界上鹽堿土分布面積最大的三個地區之一[1]。當前，國家對鹽堿地綜合利用高度重視，通過實施生物技術手段提升植物對鹽堿的適應性和耐受能力，已成為鹽堿地綜合開發利用中經濟且有效的技術措施[2]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza fungi, AMF)是陸地生態系統中分布最廣的一類共生真菌[3]，廣泛分布于各種土壤生境之中[4]。AMF沒有嚴格的宿主專一性，可以與約80%陸生植物的根系形成互惠共生體[5-6]，其能夠從宿主植物中獲取碳源，并通過龐大的根外菌絲網絡，幫助植物從土壤中吸收營養元素，增加滲透調節物質的積累，減少宿主對鹽份的攝入，改善離子平衡，進而提高植物的耐鹽能力并促進植物生長[7-9]。因此，通過接種AMF來提高植物的耐鹽能力成為鹽堿地綜合治理領域的研究熱點。

杜梨(PyrusbetulifoliaBunge)，隸屬于薔薇科(Rosaceae)梨屬(PyrusL.)，地理分布范圍廣泛。在經濟林栽培中，杜梨常作為梨栽培品種的砧木[10]；另其全株可入藥[11]，木材致密光滑[12]，也具有很高的開發利用價值。此外，杜梨還具有一定程度的耐干旱瘠薄、耐澇、耐鹽堿能力，在困難立地綜合治理中也發揮著特殊作用[13]。進一步提高杜梨對鹽堿脅迫的耐受性，能夠使其在鹽堿地綜合治理中發揮更大的經濟與生態價值。

當前，關于單鹽[14]和單堿[15]脅迫下梨屬植物的生長特征已有不少研究，然而自然界中的鹽堿成分組成復雜，混合鹽堿脅迫是黃河三角洲土壤逆境的重要特征。另外，杜梨菌根化后的光合生理特征研究較少，尚不能很好地揭示接種AMF對杜梨耐鹽堿能力提升的生理生態機制。鑒于此，本試驗以杜梨實生苗作為試驗材料，根據濱海鹽堿地鹽堿組成設置鹽堿脅迫處理[16]，通過分析菌根化杜梨幼苗的生長、生理與光合作用等指標，明確接種AMF提升杜梨耐鹽堿能力的生理機制，為進一步提升杜梨對鹽堿環境的適應性以及苗木菌根化技術研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試杜梨種子來源于山東省臨沂市河東區。2021年4月中旬，將經催芽處理的種子播種于滅菌基質中。待幼苗長出4片真葉，選取生長勢基本一致的幼苗移栽至口徑9.5 cm、深8.5 cm花盆中，花盆內預先填裝140 g消毒基質(經過121 ℃高溫濕熱滅菌2 h，草炭土、珍珠巖、蛭石按照體積比5∶1∶3混合)，每盆1株，并將盆栽幼苗置于遮雨棚中進行培養。本研究在黃河三角洲杜梨人工林土壤叢枝菌根真菌類群及分布特征分析的基礎上，確定將根際土壤豐度較高的根內根孢囊霉(Rhizophagusintraradices，Ri)作為試驗菌種，相關菌株(BGC BJ09)從北京市農林科學院植物營養與資源研究所購買。

1.2 試驗設計

試驗設置叢枝菌根真菌和鹽堿脅迫2個因素。接菌因素包括接菌(AM)和不接菌(NAM)2種處理。杜梨苗移栽入盆的同時進行接種，AM組每盆施加10 g菌劑(約300個孢子)在根系周圍，與根系直接接觸。NAM組施加滅活的10 g菌劑，其余操作相同。各處理之間進行相同的管理方式，待緩苗45 d后，同時進行混合鹽堿脅迫。鹽堿組成按照前人測定的濱海鹽堿地鹽分含量換算得到(NaCl∶NaSO4∶NaHCO3摩爾比為26∶65∶9)[16]，鹽堿脅迫因素設置6個水平處理(0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 g·kg-1)，各鹽堿溶液pH范圍均處于8～8.7。其中，0 g·kg-1為對照組，1.5 g·kg-1為低鹽堿組，3.0 g·kg-1和4.5 g·kg-1中鹽堿組，6.0 g·kg-1和7.5 g·kg-1為高鹽堿組。

本試驗共設置接種、鹽堿處理組合12(2×6)個，每個處理組合10個重復(盆)，共120盆。為了使鹽分能夠在營養缽中均勻分布，在施加混合鹽堿前3 d停止澆水。將所需鹽分溶解于100 mL自來水，均勻澆灌到基質中進行飽和灌溉，將漏到托盤中的水再倒回各自營養缽。為了避免鹽的沖擊效應，混合鹽堿按照每天3 g·kg-1梯度遞增，達到預期各濃度為止。之后每2 d澆水100 mL。鹽堿脅迫處理的幼苗連續培養30 d后進行菌根侵染率、光合作用及其余各項生長和生理指標的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 菌根侵染率鹽堿脅迫30 d后，將每個處理中10株植物全部取出，每株植物隨機選取5條細根，每細根剪成1.0 cm長的根段，并按處理濃度將所有根段混合，隨機選取100個根段作為樣本，重復3次。采用曲利苯藍染色法[17]測定根段侵染情況，在顯微鏡下觀察菌根真菌的侵入點、菌絲形態、叢枝及泡囊分布等，并計算菌根侵染率。菌根侵染率=叢枝菌根真菌侵染的根段長度/測定根段的總長度×100%。

1.3.2 幼苗株高和生物量用卷尺分別測定杜梨幼苗在鹽堿脅迫之初和脅迫30 d后的株高，并計算苗高生長量(脅迫終苗高-脅迫初苗高)。待脅迫結束后收獲植株，并將植株分為地上部和地下部，帶回實驗室后先在烘箱中用105 ℃殺青30 min，隨后用80 ℃烘至恒重，稱量杜梨地上部和地下部的生物量。

1.3.3 葉片生理生化指標每盆采集杜梨葉片4片，所有處理均采集相同位置的葉片，并將同一處理的葉片混合后分成5份作為待測樣品。采用95%乙醇浸提法測定光合色素含量、茚三酮顯色法測定游離的脯氨酸(Pro)含量、硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)的含量、考馬斯亮藍G-250比色法測定可溶性蛋白(SP)含量、蒽酮比色法測定可溶性糖(SS)含量、NBT比色法測定超氧化物歧化酶(SOD)的活性、愈創木酚比色法測定過氧化物酶(POD)的活性、相對電導率法測定質膜透性(MRP)。具體方法參考文獻[18]。

1.3.4 葉片光合氣體交換參數和葉綠素熒光參數鹽堿脅迫30 d后，每個處理隨機選取5盆植株進行相關光合參數的活體測定。首先，于上午9:00-11:00，均選取植株第4片功能葉，使用LI-6800便攜式光合儀(LI-COR Inc, USA)在飽和光強1 200 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1、流速500 mL·min-1，葉室溫度為28 ℃條件下測定葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和胞間二氧化碳(Ci)等光合參數，每個處理重復測5次。此外，在同一處理中選取第5片功能葉，使用FMS-2型脈沖調制式葉綠素熒光儀，在光適應下測定最小熒光(Fo′)、最大熒光(Fm′)、可變熒光(Fv′)和穩態熒光(F′)，在經過30 min的暗適應后測定最大熒光(Fm)、初始熒光(Fo)和可變熒光(Fv)，然后計算實際光化學效率(ΦPSⅡ)、最大光化學效率(Fv/ Fm)、光化學猝滅系數(qp)和非光化學猝滅系數(NPQ)等熒光參數。具體測定方法參考Neil等[19]。

1.4 數據分析

所有圖表數據表示為平均值±標準差。通過 Excel 2016對數據進行處理，SPSS 22進行單因素和雙因素方差分析(Duncan)，Origin 9.0進行統計圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫對根內根孢囊霉侵染杜梨根系的影響

圖1顯示，叢枝菌根真菌根內根孢囊霉(Ri)對杜梨根系的侵染明顯呈現泡囊、根內菌絲和根外菌絲結構。從表1可知，當鹽堿濃度為0(對照)時，接種根內根孢囊霉的杜梨幼苗根系侵染率為83.69%；在鹽堿濃度小于等于 4.5 g·kg-1時，Ri 的根系侵染率處于79.35%～83.69%之間，但各鹽堿脅迫處理間及其與對照處理間的差異均不顯著；當鹽堿濃度大于4.5 g·kg-1后，Ri 的根系侵染率開始顯著下降，6.0 g·kg-1和7.5 g·kg-1鹽堿脅迫處理的根系侵染率分別下降至47.98%和32.97%。可見，根內根孢囊霉對杜梨根系的侵染能力在中低濃度鹽堿脅迫下無顯著變化，而在高濃度鹽堿脅迫下顯著下降。

2.2 鹽堿脅迫下根內根孢囊霉對杜梨生長的影響

圖2顯示，隨著鹽堿脅迫程度的增加，接種Ri(AM)和不接種Ri(NAM)處理杜梨苗高(A)和地上、地下生物量(B)均呈現逐漸下降的趨勢；在相同鹽堿脅迫條件下，AM處理的苗高和生物量均不同程度地高于相應的NAM處理。其中，在鹽堿濃度分別為0、1.5、3.0、6.0、7.5 g·kg-1時，接種Ri均顯著或極顯著提高了杜梨的苗高，尤其是在7.5 g·kg-1處理下苗高顯著增加77.6%；除了3.0和4.5 g·kg-1濃度處理外，接種AMF也均顯著或極顯著提高了杜梨地上部與地下部分生物量。上述結果說明，接種Ri有利于提升杜梨幼苗對鹽堿環境中的適應性，促進植株生長。

2.3 鹽堿脅迫下接種根內根孢囊霉對杜梨葉片光合色素含量的影響

從圖3可知，在不同的鹽堿脅迫處理中，接種Ri均能夠顯著提高杜梨葉片葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量(圖3,A、B、D)。比如，相較于NAM組，AM組杜梨葉片的葉綠素a含量在0～7.5 g·kg-1鹽堿脅迫下分別顯著提高了9.1%、25.6%、36.7%、8.1%、22.3%和46.0%等。同時，AM組杜梨葉片的類胡蘿卜素含量僅在3.0 和7.5 g·kg-1鹽堿脅迫下比NAM組顯著提高，增幅分別為36%和17.4%(圖3，C)。因此，接種Ri有利于鹽堿脅迫下杜梨葉片光合色素的合成，從而有利于光合作用進行和生物量積累。

2.4 鹽堿脅迫下接種根內根孢囊霉對杜梨葉片光合氣體交換參數的影響

如圖4所示，與NAM組相比，AM組杜梨葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)均不同程度提高，而其胞間二氧化碳濃度(Ci)在0～3.0 g·kg-1鹽堿脅迫時降低，在4.5～7.5 g·kg-1鹽堿脅迫時升高，且升降幅度大多達到顯著水平。首先，AM組的葉片Pn均比NAM組顯著增加，只是在不同濃度鹽堿脅迫下的漲幅不同，其中在鹽堿濃度為3.0 和7.5 g·kg-1時的增幅最大，均超過30%(圖4，A)。其次，隨著鹽堿脅迫程度的增加，杜梨幼苗葉片Tr呈現先升高后降低的趨勢，但AM組在3.0～7.5 g·kg-1鹽堿脅迫比相應NAM組顯著提高了5.7%～264.3%(圖4，B)。再次，接種AMF對杜梨葉片Gs產生的效應因鹽堿濃度的不同而異，在未進行鹽堿脅迫時顯著低于NAM組，在1.5 g·kg-1時與NAM組無顯著差異，在較高濃度鹽堿脅迫(>3 g·kg-1)時極顯著高于NAM組(圖4，C)。此外，接種AMF對杜梨葉片Ci的調節作用受到鹽堿濃度的影響，AM組的Ci在鹽堿濃度小于3 g·kg-1時均不同程度低于NAM，在鹽堿濃度大于4.5 g·kg-1時均高于NAM組，其在濃度為6.0和7.5 g·kg-1時增幅達到極顯著水平(圖4，D)。上述結果說明，接種Ri有利于在鹽堿脅迫環境中提升杜梨幼苗葉片的光合效率。

2.5 鹽堿脅迫下接種根內根孢囊霉對杜梨葉片葉綠素熒光參數的影響

在鹽堿脅迫條件下，AM組杜梨的實際光化學效率均不同程度地高于NAM組，但增幅僅在鹽堿濃度為1.5 g·kg-1和6 g·kg-1時達到顯著水平，增幅分別為19.5%和28.2%(圖5，A)。AM組的最大光化學效率僅在鹽堿濃度為7.5 g·kg-1時產生顯著影響，比NAM組顯著提高了11.3%(圖5，B)。AM組的光化學猝滅系數也均不同程度地高于相應NAM組，但僅在鹽堿濃度為6.0和7.5 g·kg-1時與NAM組差異顯著(圖5，C)。AM組的杜梨的非光化學猝滅系數僅4.5 g·kg-1時稍高于NAM組，在其余濃度下均不同程度地低于相應NAM組，并且在鹽堿濃度為1.5、3.0和7.5 g·kg-1時差異達到顯著或者極顯著水平(圖5，D)。可見，在鹽堿脅迫條件下，接種Ri可通過抑制杜梨幼苗熱耗散來增加其光化學效率。

2.6 鹽堿脅迫下接種根內根孢囊霉對杜梨葉片抗氧化酶活性及膜系統的影響

圖6，A、B顯示，杜梨葉片細胞膜透性(相對電導率)和丙二醛的含量隨著鹽脅迫濃度的增加呈現逐漸上升的趨勢，但AM組在各濃度鹽堿脅迫下均比NAM組極顯著降低，其細胞膜透性降幅在40%～59%之間并始終保持在較低水平，其MDA含量降幅在17%～55%之間。同時，圖6，C、D顯示，杜梨葉片超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的活性隨著鹽脅迫濃度的增加基本呈現先上升后下降的趨勢，但AM組均不同程度地高于NAM組，且在大多數濃度下差異達到顯著水平，尤其在高鹽堿濃度脅迫(6 g·kg-1和7.5 g·kg-1)下增幅均超過40%。由此可以看出，接種Ri能夠顯著增強鹽堿脅迫下杜梨葉片抗氧化酶活性，有效降低細胞膜的過氧化損傷程度，提高植植株對鹽堿脅迫的耐受能力。

2.7 鹽堿脅迫下接種根內根孢囊霉對杜梨葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

圖7顯示，隨著鹽堿脅迫濃度的增加，AM組杜梨葉片的可溶性糖和可溶性蛋白含量呈現先升后降的變化趨勢，并分別在4.5和3.0 g·kg-1濃度下達到最大值，且與相應NAM組相比均顯著提高，其可溶性糖含量增幅在16%～77%之間(圖7，A)，其可溶性蛋白含量增幅在24%～87%之間(圖7，B)?？梢姡臃NRi顯著提高了鹽堿脅迫下杜梨葉片的滲透調解能力。

3 討 論

3.1 鹽堿脅迫下根內根孢囊霉對杜梨根系侵染率及生長的影響

菌根侵染率能夠直觀反映出菌根的形成和真菌與植物之間親和力的高低[20]。本試驗結果表明，根內根孢囊霉能夠很好地侵染進杜梨根系，與杜梨根系形成共生體；在鹽堿脅迫濃度小于4.5 g·kg-1時，鹽堿脅迫對根內根孢囊霉的侵染影響較小，侵染率為79%以上，但濃度高于4.5 g·kg-1后，侵染率顯著下降。然而前人有關AMF對杜梨的侵染率范圍僅在17.9%～30.7%[15]，這可能是由于摩西管柄囊霉雖然能夠與杜梨形成共生體，但是親和力相對較差，并且其試驗僅使用了單一堿性鹽(Na2CO3)，并不能較好反映自然情況。而本試驗選取的根內根孢囊霉是在自然環境杜梨人工林根際土壤中獲得的，這可能使得根內根孢囊霉與杜梨根系具有較好的親和能力。前人有關不同AMF侵染杜梨的試驗表明[14]，摩西球囊霉、根內球囊霉、地表球囊霉均能較好地與杜梨根系親和，然而該試驗針對杜梨的鹽處理僅為單一中性鹽(NaCl)，且該杜梨在鹽濃度為0.5%時便開始死亡，這與本試驗結果相差較大，這可能是由于其試驗中的杜梨對于鹽分含量較敏感，本身耐鹽能力相對較差，并且有學者發現杜梨存在能夠在0.8% NaCl下仍然有60%以上存活率的家系[13]。本試驗發現根內根孢囊霉能夠較好地適應中低鹽堿環境，但如果土壤鹽堿含量過高，則可能會抑制AMF的活性，抑制AMF孢子的萌發與減少孢子數量，減少叢枝與泡囊的數量，抑制芽管的伸長和菌絲分枝，降低菌根的侵染范圍，抑制形成菌根[21-22]。本研究中當杜梨根系與AMF形成良好的共生體后，菌根促進了杜梨的生長，顯著增加了杜梨苗高生長量和生物量的積累，這在櫸樹[23]、美洲黑楊[24]等植物中均有體現。這可能是由于AMF與植株形成共生系統后，數量龐大的菌絲系統極大地擴展了根系的吸收范圍，有利于植物根系從土壤中吸收水分和營養物質[25]，從而能夠促進植物的生長和生物量的積累，增強植物對鹽脅迫的抵抗能力。

3.2 根內根孢囊霉對鹽堿脅迫下杜梨光合生理特性的影響

葉綠素是植物進行光合作用的光敏催化劑，是高等植物進行光合作用時最重要的色素，其含量是反映植物光合強度的重要指標[26]。本研究發現，接種根內根孢囊霉顯著增加了杜梨葉片葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量，但對類胡蘿卜素含量的影響較小。光合作用的限制因素主要分為氣孔和非氣孔兩個限制因素。當Pn下降的時候，Ci與Gs同時下降，這就說明限制植物光合作用的因素主要為氣孔因素；相反，當Pn下降，但Ci上升，這說明影響植物光合能力的因素主要是葉肉細胞的光合活性下降等非氣孔因素[27]。本試驗在中低鹽堿脅迫程度(1.5 g·kg-1和3.0 g·kg-1)下，杜梨葉片Pn下降，但Ci增加，這說明此時限制光合能力的主要是非氣孔因素；然而在中高鹽堿脅迫程度下(4.5、6.0、7.5 g·kg-1)，杜梨葉片Pn下降的同時，Gs與Ci均下降，這說明此時限制杜梨光合能力的主要是由于氣孔因素。因此，杜梨遭受鹽堿脅迫后光合速率的下降既有氣孔因素也有非氣孔因素，可能是氣孔限制和非氣孔限制共同作用的結果[28]。并且，接種根內根孢囊霉能夠顯著增加葉綠素含量，緩解鹽堿脅迫對于葉綠體的損傷，從而緩解杜梨光合作用下降中的非氣孔因素，同時能夠促進葉片中氣孔的開度，來緩解光合作用下降中的氣孔因素。此外，本試驗還發現，接種AMF能夠顯著提高在不同程度的鹽堿脅迫下杜梨葉片的實際光化學效率，在高鹽堿環境中顯著提高其最大光化學效率和光化學猝滅系數，并在除4.5 g·kg-1濃度之外的鹽堿脅迫下不同程度降低了非光化學猝滅系數。這可能是接種AMF能夠有效提高光化學量子效率和增強電子傳遞的能力，能夠將葉片吸收的光能更多的利用在光合作用中，從而提高杜梨葉片對光能的利用效率，緩解鹽堿脅迫對于杜梨葉片光合作用的抑制作用，該作用在其他植物中也有報道[29]，這均說明菌根能夠增加宿主植物對光能的捕獲和光化學效率[30]。

3.3 根內根孢囊霉對鹽脅迫下杜梨葉片抗逆生理指標的影響

鹽堿脅迫能夠導致細胞膜受損，使細胞胞液外滲，從而使相對電導率增加，因此電導率能夠反映出細胞膜的受損程度[29]。鹽脅迫會導致植物體內活性氧積累，使細胞內膜脂過氧化程度提高，生成的MDA含量增加，因此MDA含量能夠反映出細胞膜脂的過氧化程度[31]。本研究發現，在鹽堿脅迫條件下，接種AMF能夠顯著降低杜梨葉片MDA含量和相對電導率，這說明接種AMF能夠減輕鹽脅迫下細胞膜受損程度，緩解鹽堿脅迫對細胞膜系統的毒害作用，增強植物抗逆性。同時，POD和SOD是植物細胞內主要的抗氧化酶，能夠清除細胞內多余的活性氧，維持細胞的穩態。本研究發現，鹽堿脅迫下接種AMF能夠顯著增強杜梨葉片POD和SOD活性，并在前人的相關研究中也有類似結果[14]，這說明接種AMF能夠有效增強杜梨葉片的抗氧化酶系統活性，從而緩解鹽堿脅迫的傷害作用，提高植物抗逆性。另外，植物體內的可溶性蛋白多數是代謝有關的酶類，能夠反映出植物總代謝水平，能夠維持細胞內的滲透勢，促進細胞的持水能力。可溶性糖是植物耐鹽堿過程中重要的調節物質，能夠為有機物的合成提供能量，保持細胞膜的穩定，保護酶類[15]。本試驗表明，接種AMF能夠顯著提高杜梨葉片的可溶性蛋白和可溶性糖含量，促進杜梨的代謝，維持細胞的滲透平衡，增強杜梨抵御鹽堿脅迫的能力。

4 結 論

鹽堿脅迫對于杜梨的生長具有不利影響，接種根內根孢囊霉能夠通過增加杜梨葉片中的光合色素含量來緩解鹽堿脅迫下非氣孔因素對于光合的抑制作用，同時能夠通過促進葉片氣孔的開度來緩解鹽堿脅迫下氣孔因素對光合的抑制作用；并能夠通過促進光能的吸收利用效率來促進杜梨的光合作用，從而促進杜梨的生長與生物量的累積；接種根內根孢囊霉能夠通過提高杜梨葉片中的滲透物質含量來緩解細胞膜的損傷，減輕鹽堿的滲透脅迫，同時還能通過提高抗氧化酶的活性緩解鹽堿脅迫誘導的細胞過氧化的損害，從而提高杜梨對鹽堿脅迫的耐受能力。因此，菌根化杜梨在鹽堿地綜合治理中具有較好的應用前景。