黃連治療胃癌的作用機制的網絡藥理學研究▲

吳浩源 梁 媛 梁 健

(1 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院消化內科，廣西南寧市 530001； 2 廣西大學醫學院，廣西南寧市 530004)

胃癌系源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤。全球癌癥數據顯示，近年來胃癌的發病率不斷下降，但其仍是全球第五大常見癌癥，同時死亡人數高居第4位[1-2]。研究表明，胃癌對放化療的敏感性不高，根治性手術切除仍是治愈胃癌的唯一手段，但在手術理念和技術顯著提高的今天，胃癌患者的預后仍未獲得顯著改善，患者的5年生存率僅為8%～34%，局部復發率高達40%～90%，即使接受術后輔助治療，患者的長期生存率也無明顯提高[3]。

網絡藥理學的“多成分-多靶點-多途徑”網絡構建思想與中醫理論的“整體觀”相符合，可較為準確地對中藥的作用機制進行預測和分析，也可對常見的中藥配伍方法進行闡述和論證[4]。黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，能夠治療胃部疾病屬熱證者。有學者發現，左金丸、黃連解毒湯對胃癌有一定的治療作用[5-6]，其主要成分包含黃連。本研究借助網絡藥理學方法，分析黃連治療胃癌的潛在作用靶點及可能的分子機制，為今后胃癌的臨床治療和科學研究提供參考和依據。

1 資料與方法

1.1 黃連的有效化學成分及其作用靶點篩選 以完整拼音的形式在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://tcmspw.com/)檢索黃連，按照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18的標準，篩選出黃連所含的有效化學成分，通過查閱相關文獻及數據庫對有效化合物結構等基本信息逐一核對驗證，確保信息準確無誤。通過TCMSP檢索有效化學成分的作用靶點，匯總去重后，利用UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)將靶點名稱轉換為官方基因名。

1.2 疾病靶點篩選 以“gastric cancer”為關鍵詞，檢索GeneCards數據庫(http://www.genecards.org/)，得到胃癌相關靶點基因。

1.3 相關網絡的構建及分析 通過Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制黃連有效化學成分作用靶點及胃癌相關靶點基因的韋恩圖，所得到的交集基因即為黃連作用于胃癌的靶點。針對黃連的有效化學成分及其作用靶點、黃連作用于胃癌的靶點，通過CytoScape 3.8.2軟件構建黃連有效化學成分-胃癌調控網絡。在STRING數據庫(https://cn.string-db.org/)中，選擇“Multiple proteins”后導入黃連作用于胃癌的靶點，并將蛋白種類參數設置為“人類”，由于圖形過于復雜，將置信度設為>0.9，得到蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡。

1.4 功能與通路富集分析 針對黃連作用于胃癌的靶點，通過Metascape在線平臺(http://www.bio-review.com/metascape/)進行基因本體論(Gene Ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，并通過OmicShare網站(https://www.omicshare.com/)分別繪制氣泡圖。

2 結 果

2.1 黃連的有效化學成分及其作用靶點 通過檢索 TCMSP數據庫得到中藥黃連所含有效化學成分14個(見表1)，作用靶點596個，匯總去重后得到有效化合物作用靶點159個。

表1 黃連的有效化學成分

2.2 疾病靶點及黃連作用于胃癌的靶點基因 通過檢索GeneCards數據庫共篩選出胃癌的靶點基因835個，將其與黃連有效化學成分的159個作用靶點取交集，獲得86個交集靶點(見圖1)，即黃連作用于胃癌的靶點，包括一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)、絲氨酸蛋白酶1(serine protease 1,PRSS1)、前列腺素內過氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase,PTGS)1、PTGS2、視黃醇類Ⅹ受體α(retinoid Ⅹ receptor alpha,RXRA)、雄激素受體(androgen receptor,AR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)等靶點。

圖1 黃連有效化學成分作用靶點與胃癌相關靶點基因的韋恩圖

2.3 黃連有效化學成分-胃癌調控網絡 利用CytoScape 3.8.2軟件構建黃連有效化學成分-胃癌的調控網絡。該網絡共由98個節點、228條邊構成，見圖2。

圖2 黃連有效化學成分-胃癌調控網絡

2.4 PPI網絡 通過STRING構建黃連作用于胃癌的靶點基因的PPI網絡，該網絡由86個蛋白節點和1 422條邊組成，連接的節點越多，表明該蛋白的核心地位越高，見圖3。

圖3 黃連作用于胃癌的靶點基因的PPI網絡

2.5 黃連作用于胃癌的靶點基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果 GO功能富集分析結果顯示，黃連作用于胃癌的靶點基因共涉及105個生物過程，主要為DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合、泛素蛋白連接酶結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、細胞因子活性、激酶調控因子活性、激活轉錄因子結合、細胞核受體的活性、配體激活的轉錄因子活性等。KEGG富集分析結果顯示，黃連作用于胃癌的靶點共涉及140條信號通路，包括白細胞介素(interleukin,IL)-17信號通路、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路、缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)信號通路等。本文僅列出富集程度排前20的生物過程和信號通路，并繪制氣泡圖，見圖4、圖5。

圖4 GO富集分析—生物過程的氣泡圖

圖5 KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

結合網絡藥理學分析結果，我們推測中藥黃連主要通過槲皮素、巴馬汀、表小檗堿、甲基黃連堿等有效化學成分，作用于NOS2、PRSS1、PTGS1、PTGS2、RXRA、AR、ESR1等靶點，從而發揮治療胃癌的作用。槲皮素有清熱解毒、提高免疫力、抗腫瘤的作用。已有研究表明，槲皮素、小檗堿能抑制胃癌細胞的增殖，并促進胃癌細胞的凋亡[7-8]。黃連堿是中藥黃連的特征性成分，具有抗微生物活性及保護胃黏膜、抗癌、改善免疫系統功能的作用。此外，既往研究也表明，相關作用靶點與胃癌及癌前病變都有著緊密的聯系。例如，慢性萎縮性胃炎屬于癌前病變，而調節NOS2的表達能夠治療慢性萎縮性胃炎，阻止癌前病變演變成胃癌[9]。敲低PRSS1的表達后,胃癌MGC803和BGC823細胞的增殖、遷移和侵襲能力降低，PRSS1能通過Janus激酶2/信號轉導及轉錄活化因子3途徑參與胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。AR在胃癌組織中的陽性表達率較高，其參與胃癌的發生和發展，且與腫瘤的大小呈正相關[11]。

我們進一步進行了功能和信號通路富集分析，結果顯示，黃連作用于胃癌的靶點涉及DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合、激酶調控因子活性等生物過程，以及IL-17、TNF、HIF-1等信號通路。幽門螺桿菌被世界衛生組織國際癌癥研究機構列為一級致癌物，其與胃癌的發生密切相關。研究表明，DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合、激酶調控因子活性等生物過程貫穿于胃癌的發生和發展，以及幽門螺桿菌感染的過程中[12-13]。此外，有研究顯示，幽門螺桿菌感染后機體血清中IL-32、IL-1β、TNF-α水平顯著提高[14]，且胃癌患者血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平顯著升高[15]，這提示幽門螺桿菌感染機體后，可能通過IL、TNF等信號通路促進胃癌的發生。還有學者發現，抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/HIF-1α信號通路可治療胃癌前病變，從而預防胃癌的發生[16]。結合上述研究結果，我們推測，黃連的有效化學成分作用于相關靶點后，通過調控上述生物過程、信號通路，從而發揮治療胃癌的作用，或者通過治療癌前病變預防胃癌發生。

綜上所述，黃連可能主要通過槲皮素、巴馬汀、表小檗堿、甲基黃連堿等有效成分作用于相關靶點，調控DNA結合轉錄因子結合、細胞因子受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合、激酶調控因子活性等生物過程，以及IL-17、TNF、HIF-1等信號通路，從而發揮治療胃癌的作用。但本研究僅基于網絡藥理學和生物信息學數據庫資料進行分析，未進行相關基礎實驗及臨床試驗進行驗證，今后將進一步開展相關研究，更深入地闡明黃連治療胃癌的機制。