蛋白激酶C-θ在免疫中的研究進展①

孫明珠 趙龍昊 徐揚（遼寧師范大學生命科學學院，七鰓鰻研究中心，大連 116081）

1 PKC-θ簡介

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族是一類依賴磷脂和鈣離子的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。通常，PKC分子中含有4個相對保守區（C1、C2、C3、C4）和5個可變區（V1、V2、V3、V4、V5）。根據PKC分子結構和所需輔助因子的不同可分為：經典的PKC（conventional PKC，cPKC），新型PKC（novel PKC，nPKC）和非典型的PKC（atypical PKC，aPKC）［1-2］。有關PKC家族分子成員及其分類，見表1。

表1 PKC家族分子成員的分類Tab.1 Classification of molecular members of PKC family

PKC-θ是一種不依賴于鈣離子激活的nPKC亞型，最初是在白血病紅細胞中被分離鑒定的［3］。PKC-θ基因定位于人類10號染色體短臂，主要在T細胞、骨骼肌細胞和造血系統中表達。其中，骨骼肌和淋巴器官中表達最高，胸腺和淋巴結中次之，脾臟中較少，骨髓中不表達［4］。PKC-θ蛋白的C1結構域有2個鋅指狀Cys富集區，可以與二酰甘油（diacylglycerol，DAG）結合，C2結構域主要調節PKC-θ與膜之間的相互作用，自身假底物序列（pseudosubstrate sequence，PS）通過抑制催化酶結構域來調節其激酶活性，C3結構域為與ATP結合提供能量，C4結構域具有激酶活性［5］。在PKC-θ中，只有C1b結構域能夠有效結合佛波酯，有研究解釋了PKC-θ的C1a結構域與配體結合力較弱的原因，通過共聚焦實驗觀察發現，PKC-θ中C1a和C1b結構域之間有12個不同的氨基酸殘基對配體的結合力存在著一定差異，C1a結構域中P168殘基和C1b結構域中K240殘基起關鍵作用［6］。研究發現，PKC-θ獨特的V3結構域內富含脯氨酸的基序，對于定位并固定其免疫突觸是必不可少的［7］。PKC-θ的活性是通過自身變構實現的，不同的磷酸化位點對于調節構象進而改變激酶活性的作用不同。例如，Y90是淋巴細胞蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte protein tyrosine kinase，LCK）的結合部位；T219是參與其下游信號通路必需的自磷酸化位點；T538是受磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）調節的磷酸肌醇依賴激酶-1（phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1）的磷酸化位點，參與調節PKC-θ的催化功能；S676/S695是自磷酸化位點，參與調節PKC-θ的激酶活性［1］。PKC-θ的結構示意圖如圖1所示。

圖1 PKC-θ的結構示意圖［1］Fig.1 Structure diagram of PKC-θ［1］

2 PKC-θ在TCR信號通路中的作用

TCR是T細胞表面的受體，可識別抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）表面的主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC），兩者形成復合物后引起下游通路的一系列信號傳遞。結合磷酸酪氨酸的PKC-θ是TCR誘導的T細胞活化、增殖和輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2）分化所必需的，PKC-θ在調節TCR近端信號的正反饋調節回路中起著重要作用［8］。

2.1PKC-θ對轉錄因子的調控作用核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）在TCR中的激活，對T細胞的活化至關重要。SUN等［9］發現，敲除PKC-θ基因小鼠的T細胞在NF-κB活化中表現出功能上的嚴重缺陷，證實了PKC-θ在NF-κB活化中的選擇性作用。KANG等［10］對比分析人源野生型PKC-θ和失活PKC-θ的質譜結果后發現，PKC-θ誘導了PDK-1在Ser-64處的磷酸化，進而促進T細胞活化和TCR誘導的NF-κB激活。

研究發現，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-9）以caspase-3依賴性方式誘導PKC-θ活化和NF-κB活化。此外，在T細胞活化過程中，caspase-8位于caspase-9的上游。因此，TCR會引發一個涉及caspase-8、caspase-9和caspase-3的caspase級 聯 反應，從而啟動PKC-θ依賴性途徑導致NF-κB活化和PKC-θ依 賴性Bcl10（B-cell lymphoma/leukemia 10）磷酸化，進而改變NF-κB活性［11］。SIEGMUND等［12］通過酵母雙雜交篩選和免疫共沉淀實驗證實，冠蛋白1A（coronin 1A，coro1A）作為一種新型的PKC-θ相互作用蛋白，其N端WD40結構域和PKC-θ的類C2結構域相互作用，以此調節對PKC-θ的募集，并激活TCR下游的NF-κB。

激活蛋白1（activating protein-1，AP-1）是存在于細胞內的一種轉錄激活因子，是由c-Fos和c-Jun組成的異二聚體。研究發現，PKC-θ是T細胞中激活AP-1信號通路的重要分子。BAIER等［13］發現，有活性的PKC-θ能激活T細胞中AP-1活性，而在缺乏PKC-θ的原代T細胞中，AP-1表達與活性均受到抑制［8］。LI等［14］的研究表明，PKC-θ通過與Ste20相關的脯氨酸/丙氨酸激酶（Ste20-related proline/alaninerich kinase，SPAK）通路調節AP-1的激活，SPAK是PKC-θ的一種特異性底物，PKC-θ在體外通過磷酸化S311這個主要位點與SPAK直接相互作用。當過表達突變型SPAK或敲除SPAK時，PKC-θ介導的AP-1激活減少。

活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）受Ca2+/鈣調神經磷酸酶（calcineurin，Cn）依賴的信號通路調節，對T細胞的活化、增殖和分化至關重要［15-16］。研究表明，PKC-θ通過刺激Ca2+內流增強NFAT激活［17-19］。燃煤的砷可以引起人群的T細胞免疫抑制，研究表明，PKC-θ介導的Ca2+/NFAT信號通路可能參與了燃煤砷中毒人群的T細胞免疫抑制［20］。有關PKC-θ對轉錄因子的調控作用如圖2所示。

圖2 PKC-θ對轉錄因子的調控［21］Fig.2 Regulation of transcription factors by PKC-θ［21］

2.2PKC-θ對Th細胞分化方向的調控作用輔助型T細胞（T helper cell，Th）漂移是一種免疫抑制現象，在TCR介導下，活化的CD4+T細胞分化為輔助型T細胞1（T helper 1 cell，Th1）和Th2兩個不同的亞群。MAO等［21］發現，嗎啡可以通過PI3K/AKT途徑抑制Th1淋巴細胞的分化并降低Th1/Th2，韓超等［22］進一步發現，當嗎啡濃度在50 ng/ml時，誘導CD4+T細胞向Th2漂移的分化效能最高，在此過程中，PKC-θ磷酸化水平增高，證實了PKC-θ在嗎啡誘導Th2細胞漂移信號通路中所起的關鍵作用。

3 PKC-θ在淋巴細胞中的作用

3.1PKC-θ在T細胞中的作用PKC-θ是介導T細胞在體內和體外活化所需的關鍵分子，可參與調節T細胞免疫反應過程中的多個階段。T細胞的活化是由TCR和共刺激分子啟動的眾多信號通路控制［23］。免疫突觸（immunological synapse，IS）是T細胞與APC表面黏附分子在受體-配體作用下形成的特殊接觸面。在PKC家族中，PKC-θ只有通過T細胞活化時被招募才聚集到免疫突觸上，作用后傳遞T細胞活化的信號［24］。在T細胞和APC相互作用期間，利用數字三維成像分析確定了IS 3個不同的子區域：中央超分子活化簇（central supramolecular activation cluster，cSMAC）、外周SMAC（peripheral supramolecular activation cluster，pSMAC）、遠端SMAC（distal supramolecular activation cluster，dSMAC）。WANG等［25］發現來自TCR/CD28刺激的最初信號傳導誘導DAG在質膜上積累，DAG通過與C1結構域結合將PKC-θ募集至IS。但DAG-C1結構域相互作用本身似乎不足以將PKC-θ選擇性轉運至cSMAC，選擇性PKC-θ募集到cSMAC還需要其他協同效應參與［1］。

另有研究表明，SUMO化修飾（smallubiquitinlike modifier）影響PKC-θ凝聚到免疫突觸的cSMAC上，推測SUMO化修飾對成熟免疫突觸的形成起到關鍵作用［26］。對原代小鼠和人類T細胞的分析表明，PKC-θ的磺酰化對于T細胞的激活至關重要。脫磺酰化作用不影響PKC-θ的催化活性，但是抑制了CD28與PKC-θ和纖維蛋白A的締合，并損害了成熟的免疫突觸的組裝以及PKC-θ和CD28的中央共積累。因此，PKC-θ的SUMO化對于形成成熟的IS和T細胞活化至關重要［27］。

激活誘導的T細胞死亡（activation-induced Tcell death，AICD）是限制激活抗原特異性T細胞擴增和確保清除特異性病原體后免疫反應終止的重要過程，包括TCR誘導Fas配體（fas ligand，Fasl）的表達及其與相應受體Fas的結合，最終導致T細胞凋亡［27］。研究表明，PKC-θ在T細胞凋亡中起著雙重調節作用：一方面通過誘導Fasl表達來促進細胞凋亡，另一方面通過提供一個BAD/p90Rsk依賴的生存信號來起到對細胞的保護作用［28］。

3.2PKC-θ在B細胞中的作用盡管T細胞受體誘導的NF-κB活化關鍵取決于PKC-θ，但尚未闡明nPKC在B細胞刺激中的作用。已有研究發現，在原代小鼠脾臟B細胞中PKC-θ的表達很弱。KRAPPMANN等［29］的測定數據表明，PKC-θ在原代B細胞NF-κB信號傳導中起著關鍵作用。對原代B細胞和T細胞中PKC同工酶表達的分析表明，PKC-θ水平在T細胞中最高。盡管如此，在原代B細胞中也確實觀察到了PKC-θ表達較弱。

BCR參與啟動細胞內鈣的動員，對于激活包括NF-κB和NFAT在內的多種轉錄因子至關重要。ANTONY等［30］的研究表明，BCR采用獨特的依賴性分子機制來調節NF-κB與NFAT的激活。

YAN等［31］研究發現，PKC-θ-/-T細胞介導的和B細胞輔助的同種異體移植排斥依賴于CD28分子。B細胞輔助PKC-θ-/-T細胞通過Ⅱ類MHC分子引發急性同種異體移植排斥反應，PKC-θ在T細胞和B細胞中的雙重控制可為防止同種異體移植排斥提供新的治療方向。

4 PKC-θ與免疫相關疾病的關系

從免疫疾病的角度來看，PKC-θ表達的微調及其在免疫突觸中的定位與免疫缺陷病和自身免疫病等關系密切，PKC-θ已成為人們研究疾病治療的潛在靶點，其活性強弱與疾病發生發展程度也逐漸明晰。

4.1PKC-θ與免疫缺陷病的關系膿毒癥，即由感染可引發全身性炎癥反應綜合征，進一步發展會導致膿毒性休克以及多器官功能不全綜合征。莊 明 峰 等［32］發 現，可 通 過 調 控 血 小 板PKC-θ/Muncl8a信號途徑進一步降低血小板α顆粒的釋放，減輕膿毒癥的損傷。Muncl8a是PKC-θ關鍵的下游信號分子，活化后的PKC-θ可磷酸化Muncl8a的S313來增強其活性，以促進血小板顆粒的釋放［33-34］。

慢性肌肉發炎，是杜氏肌營養不良癥的關鍵特征。研究表明，營養不良壞死前的早期階段是基于T細胞干預的相關時限；PKC-θ作為效應T細胞活化的關鍵調節因子，是抑制營養不良性肌肉中T細胞活性的潛在靶標；缺乏PKC-θ時，浸潤性T細胞的頻率和數量下降，肌肉中先天免疫細胞浸潤的數量和質量也隨之變化［35］。在疾病過程的早期用PKC-θ抑制劑可明顯減少炎癥細胞浸潤的大小，并減少肌肉的損傷。

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的間葉性腫瘤，占胃腸道腫瘤的1%～4%［36］。研究表明，PKC-θ可作為胃腸間質瘤的診斷指標之一［37］。PKC-θ過表達與腫瘤高度惡性、復發/轉移頻率高、患者生存率低等臨床病理參數密切相關，通過研究PKC-θ介導基因過表達，可為胃癌治療提供理論依據［38］。

化療誘導淋巴樣細胞凋亡的早期，血影蛋白發生聚集，而在聚集體的形成中則涉及到PKC-θ或其他凋亡相關蛋白。MICHALCZYK等［39］通過測試在腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TRAIL）誘導的凋亡過程中PKC-θ和Fas相關的死亡域蛋白（FADD）對細胞中血影蛋白聚集的影響，發現了PKC-θ負調控TRAIL誘導和FADD介導的細胞凋亡蛋白聚集過程。

PHETSOUPHANH等［40］發現了PKC-θ在CD4+T細胞和HIV感染中的作用：到達細胞核并再次返回。因此，PKC-θ可能幫助增強HIV-1復制，而HIV-1誘導了受感染CD4+T細胞中PKC-θ的更高活化，從而形成了一個正向反饋環。使用抑制劑rottlerin抑制PKC-θ的活性，發現HIV-1的復制在CD4+T細胞中減少。因此，對PKC-θ的活性進行特異性抑制，可能會有助于控制HIV-1的復制［41］。

4.2PKC-θ與自身免疫病的關系自身免疫性肝炎是由于免疫細胞錯誤地攻擊自己的肝細胞從而導致嚴重的肝損傷。在小鼠中，伴刀豆球蛋白A處理可誘發急性肝炎，導致CD1d陽性自然殺傷（CD1d-positive natural killer，NK）T細胞迅速激活。這些被激活的NKT細胞會產生大量的細胞因子，如IFN-γ、IL-6和TNF-α，介導炎癥反應導致肝損傷。此類細胞因子在PKC-θ-/-小鼠中顯著降低。PKC-θ-/-小鼠外周NKT細胞在胸腺發育早期存在發育缺陷，其頻率和數量明顯減少。由于PKC-θ是激活NKT細胞誘發肝炎所必需的基本分子，因此PKC-θ是預防自身免疫性肝炎的潛在藥物靶點［42］。

在炎癥性自身免疫性疾病中，PKC-θ消融對T細胞功能的體內影響尚未得到徹底檢查。TAN等［43］使用PKC-θ缺陷小鼠來研究PKC-θ在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（一種由T細胞介導的中樞神經系統自身免疫性疾病模型）發展中的潛在參與。免疫的PKC-θ-/-小鼠的脾T淋巴細胞的離體刺激顯示，盡管IL-2水平相當，但Th1細胞因子IFN-γ以及T細胞效應細胞因子IL-17的產量顯著降低。此外，在疾病過程中，與野生型小鼠相比，PKC-θ-/-小鼠中樞神經系統的IL-17表達顯著降低。以上結果強調了PKC-θ在調節自身免疫性疾病的發展中所必需的多種T細胞功能的重要性。

在干燥綜合征中，健康對照組小鼠的腺泡上皮細胞含有兩種傳統的PKC亞型α和β，腺泡和導管上皮細胞也含有非典型的PKC同工型λ，找不到PKC亞型γ、δ、ε和θ。炎癥小鼠含有相同的常規和非典型PKC亞型。結果表明，常規和非典型的PKC同工型都參與唾液上皮細胞生物學變化，并且表達中存在與小鼠品系相關和疾病狀態相關的變化，且在干燥癥群體中未發現干燥綜合征中缺乏的α和β亞型［44］。

T細胞受體（TCR）依賴性調節性T細胞（Treg）活性控制效應T細胞（Teff）的功能，并被炎癥細胞因子TNF-α抑制。完全的Teff激活需要PKC-θ募集到IS。此外，PKC-θ阻斷增強了Treg功能，表明PKC-θ抑制了Treg介導的抑制作用。抑制PKC-θ可保護Treg免受TNF-α的滅活，恢復類風濕關節炎患者缺陷Treg的活性，并增強小鼠免受炎癥結腸炎的保護［45］。

在TCR信號傳導過程中，TCR信號通過誘導GLK與上游適配器的直接相互作用激活了GLK。GLK缺陷的小鼠免疫反應受損，對實驗性自身免疫性腦脊髓炎有抵抗力。與此相一致的是，系統性紅斑狼瘡患者的T細胞中GLK表達明顯增強，PKC-θ活化GLK在T細胞中的過表達發生頻率與疾病的嚴重程度直接相關［46］。

5 PKC-θ與免疫抑制劑

PKC-θ控制T細 胞 的基本過 程 整合了TCR和CD28信號，激活NF-κB、AP-1和NFAT等轉錄因子，這對T細胞的激活和分化至關重要。PKC-θ在體內調節T細胞介導的免疫反應，因此選擇性PKC-θ抑制劑被認為在治療自身免疫和預防同種異體移植排斥方面具有潛在的臨床應用［47］。

免疫抑制劑是一類具有抑制機體免疫功能的生物制劑，可應用于控制器官移植排斥反應和治療自身免疫性疾病方面。目前PKC-θ抑制劑主要來源于人工合成和天然產物。人工合成的PKC-θ抑制劑有很多種，如AS2521780（5-腈基嘧啶類化合物）、2，4-二氨基-5-氟嘧啶衍生物、二氫喹唑啉類化合物、三環吡唑并吡啶類化合物等［48-51］。最新發現的2，6-二氨基-3-氨基甲酰基-5-氰基吡嗪衍生物2表現出中等的PKC-θ抑制活性。優化確定的2，4-二氨基-5-氰基嘧啶衍生物16c表現出有效的PKC-θ抑制活性，并且對其他PKC同工酶表現出良好的選擇性。在體內大鼠異位心臟移植模型中，其衍生物16c延長了移植物的存活［52］。此類抑制劑大多具有較好的選擇性，抑制PKC-θ激酶活性比其他PKC亞型高出幾十倍到幾百倍，在安全性、溶解性、滲透性、穩定性、有效性上占據不同優勢，在提高移植心臟存活率、結腸炎治療、抵抗移植物抗宿主反應等方面體現出良好的應用前景。天然產物來源的PKC-θ抑制劑也有很多種，如4-羥基-3-甲氧基肉桂醛、單紫杉烯、C21甾體化合物等［53-55］。此類抑制劑主要抑制PKC磷酸化以及下游NFAT、NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）通路的激活，對T細胞介導的免疫反應有較好的抑制作用。

6 總結與展望

綜上所述，PKC-θ可在TCR等信號通路中發揮作用，與免疫疾病關系密切。因此，研制與PKC-θ相關的免疫抑制劑來控制器官移植排斥反應和治療自身免疫病，已成為當前治療免疫疾病的主要控制方法和有效手段。PKC-θ在TCR通路及淋巴細胞中的作用機制仍有很多疑問，尚需深入研究PKC-θ的調控機制，探明PKC-θ在不同免疫疾病中的作用。這對于研究免疫疾病的防治，具有重要和深遠的意義。參考文獻：

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