耐受性樹突狀細胞抑制炎癥性疾病的機制及進展①

崔博 曾瑜真 陳智鴻（復旦大學附屬中山醫院呼吸科，上海 200032）

樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）是目前所知的功能最強大的抗原遞呈細胞，其通過遞呈抗原激活T細胞，在啟動和形成免疫反應中發揮至關重要的作用［1］。DCs的活化狀態對其啟動的免疫反應具有不同的影響。例如活化的DCs表達高水平的共刺激分子可促進炎癥細胞因子產生，刺激T細胞增殖；未激活或未成熟的DC表達低水平的共刺激分子，產生調節性細胞因子，抑制T細胞增殖，起到免疫抑制作用，因而被稱為耐受型DC（tolerogenic DC，tolDC）［2］。DCs對于維持免疫耐受至關重要，其通過各種機制限制效應T細胞并促進外周調節性T細胞（T regulatory cells，Tregs）分化，包括產生細胞因子（如IL-10、IL-27和TGF-β）、吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）的表達、表面共刺激分子的表達控制等。對自身抗原和周圍環境抗原的免疫耐受缺陷可導致炎癥和自身免疫性疾病的發展。近年來，tolDC被應用于腫瘤、自身免疫病和器官移植的基礎及臨床研究。現將tolDC的表型、誘導因素、產生免疫耐受的機制及臨床應用綜述如下。

1 參與免疫耐受的DC亞型

DCs通過其處理和遞呈抗原的功能參與機體的免疫反應，其在免疫耐受方面亦發揮至關重要的作用。研究表明，參與免疫耐受的DCs大致可分為三類：常規樹突狀細胞（cDC）、漿細胞樣細胞（pDC）和單核細胞衍生樹突狀細胞（moDC）［3］。cDC分為2個亞群，即cDC1亞群和cDC2亞群。cDC1特征性表達CD8α和XCR1，能夠將抗原交叉呈遞至CD8+T細胞，并依賴于IRF8、Batf3和Id2轉錄因子分化。相反，cDC2表達CD11b和CD172a，主要向CD4+T細胞呈遞抗原，主要依賴IRF4分化。因此，cDC1和cDC2表現出不同的細胞表型，在小鼠中主要為CD8α+/CD103+cDC1，CD4+/CD11b+cDC2。二者依賴不同的轉錄因子進行分化，并執行特定的免疫功能［4］。除了T細胞的影響外，cDC還可誘導和擴增自身抗原特異性Treg，參與Treg介導的自身免疫抑制，而這種耐受的產生可能與DC亞群的未成熟狀態密切相關。在這一過程中，cDC1主要誘導Treg的分化，cDC2主要誘導Treg的擴增［5］。moDC通常由炎癥過程中的單核細胞分化而來，其主要表型為HLADR+CD11c+CD14intCD206+CD1c+，其 表 面 的CD1b可能是與其他DC亞群區分的標志之一；誘導單核細胞分化的細胞因子主要有GM-CSF（粒細胞集落刺激因子）、IL-4、TNF等［6］。小鼠體內實驗表明，通過上述細胞因子誘導產生的moDC可有效刺激自身抗原特異性Treg增殖，維持免疫耐受［7］。pDC對于自身免疫耐受至關重要，其在體內可快速大量釋放IFN-I參與免疫應答，同時既往研究表明，pDC在自身免疫性疾病如銀屑病、系統性紅斑狼瘡、系統性硬化癥、Ⅰ型糖尿病等疾病的發病機制方面主要發揮免疫耐受作用，這一效應可能是通過調節IFN-I和CXCL4的水平實現的［8］。

2 誘導或促進tolDC形成的因素和機制

成熟DC表達高水平的Ⅱ類主要組織相容性復合物（MHCⅡ）和共刺激分子，通過誘導幼稚T細胞轉化為T輔助細胞1（Th1）和/或Th17亞細胞來誘導免疫反應，而未成熟DCs含有低水平的MHCⅡ和共刺激分子，通過引導T細胞轉化為Th2和Treg或導致T細胞凋亡來調控免疫應答［9］。LI等［10］研究發現，在沒有炎癥刺激時，DCs仍處于不成熟的狀態，其細胞內含有的大量MHCⅡ陽性溶酶體對MHCⅡ起到降解作用，同時，未成熟DCs產生的外泌體可誘導免疫耐受產生，這可能和外泌體中含有較高水平的MFG-E8及低水平的MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、ICAM-1有關，表明tolDC的產生可能與DC的成熟狀態有關。除了未成熟DCs外，越來越多的證據表明，成熟的DCs也可被誘導為tolDC發揮免疫調節作用。tolDC的產生可能與細胞因子有關，既往研究證明了IL-10、IL-27誘導產生的成熟DCs表現出耐受性［11］。IL-10通過抑制促炎因子IL-12的產生和DCs表面共刺激分子（如CD80、CD86）的表達從而影響后續的T細胞應答；而IL-27則促進了DCs外核苷酸酶CD39表達，CD39通過促進免疫應答環境中細胞外ATP的降解抑制了免疫應答。同時，二者都通過STAT3信號通路發揮免疫抑制功能，表明STAT3信號通路可能對DCs的功能起到負性調控作用。DCs高水平表達的芳香烴受體（AhR）在參與誘導形成tolDC過程中也發揮重要作用。AhR是一種配體激活的轉錄因子，飲食是其配體的主要來源，當AhR與來源于外界環境的配體結合后，能夠有效誘導tolDC產生。目前已知的AhR對DCs的調節機制主要通過與NF-κB、AP-1的相互作用，抑制DCs表面MHCⅡ和共刺激分子的表達，產生耐受表型。MICHALSKI等［12］研究表明，廣泛存在于水果和蔬菜中的AhR配體槲皮素能夠激活DCs表面AhR，并且能夠與CD83的啟動子結合抑制DCs表面CD83的表達產生tolDC。同時tolDC的促炎細胞因子IL-12p70表達水平降低，免疫調節分子Dab2、ILT3、ILT4、ILT5和CD39、CD73表達增多。

3 tolDC誘導免疫耐受的細胞和分子機制

3.1tolDC的遷移DCs具有遷移能力，可到達不同的器官，根據成熟狀態發揮不同功能。tolDC可能通過遷移能力的改變影響免疫應答從而引起耐受。成熟的DCs過度表達CCR7，在趨化因子CCL19和CCL21等的作用下遷移到達淋巴結，并向T細胞遞呈抗原；一些DCs會遷移到其他淋巴器官，如脾臟、胸腺和骨髓［13］。在未成熟狀態下，DCs表達另一些趨化因子受體，如：CCR2、CCR5、CCR6、CXCR4和CXCR3，并被表達趨化因子（如CCL2、CCL5和CCL20）的炎癥組織所吸引，從而導致遷移能力的改變［14］。在MANSILLA等［15］的研究中，將VitD3誘導培養的骨髓來源tolDC靜脈注射給實驗性變態反應性腦脊髓炎小鼠24 h后，這些細胞到達肝臟和脾臟，并持續存在7 d。在淋巴結、胸腺和骨髓中也發現少量細胞。越來越多的研究表明，DCs的遷移能力改變可能導致DCs在組織炎癥部位的異常聚集和活化，促進炎癥發生甚至導致自身免疫性疾病，與遷移相關的趨化因子及其受體可能是炎癥性疾病的潛在治療靶點。

3.2tolDC通過表面受體/配體介導的T細胞抑制通過DCs和T淋巴細胞間的表面分子結合和信號整合實現T細胞無能、低反應性或凋亡、抑制增殖等。例如，在未成熟DCs中表達的誘導性T細胞共刺激配體（ICOS-L）可與T細胞表達的ICOS相互作用，以誘導T細胞再刺激后的低應答［16］。另一種存在于DCs表面的免疫調節分子是PD-L1，PD-L1可與T細胞上的PD-1結合，隨后抑制T細胞抗原受體（TCR）的信號轉導，阻斷下游效應并降低T細胞的殺傷能力［17］。Fas配體是另一種通過誘導細胞凋亡而抑制T細胞應答的接觸依賴性分子［18］。DCs表面的Fas配體通過調控免疫細胞激活、分化、凋亡來實現對免疫應答的調控。

3.3免疫抑制性細胞因子與DCs的關系免疫抑制性細胞因子如IL-10、TGF-β等，與DCs成熟障礙、抑制T細胞增殖及多種免疫調節功能有關。IL-10是一種抗炎細胞因子，可抑制DCs的激活和促炎細胞因子產生。IL-10通過結合酪氨酸激酶IL-10受體激活STAT3，從而抑制NF-κB移位，導致對炎癥刺激的低反應性［19］。IL-10所誘導的tolDC也高分泌IL-10及HLA-G分子，從而誘導產生Ⅰ型Treg，促進和維持外周耐受。IL-27也是一種介導免疫耐受的關鍵細胞因子，在過敏性哮喘小鼠模型中的實驗證明，預防性氣管內注射IL-27可促進Treg和IL-10的產生，抑制原始CD4+T細胞分化為Th2，上調了和遷移能力相關的趨化因子CCL2、CCL3、CCL4的表達，這一效應可能與STAT1磷酸化有關［20］。TGF-β是一種與免疫抑制相關的多效性細胞因子。研究表明，TGF-β可誘導轉錄因子Foxp3表達從而產生Treg［21］。除了上述兩種經典的免疫調節分子外，DIXON等［22］研究表明，地塞米松誘導的tolDC可分泌IL-35，IL-35是IL-12家族的細胞因子，以IL-12p35和Ebi3的異源二聚體形式存在，可誘導Treg產生一個新亞群，即iTR35細胞，從而抑制T細胞活化。

3.4酶在DC免疫耐受中的作用已有研究表明，IDO和色氨酸代謝是抑制T細胞、B細胞的必要因素［23］。IDO通過其酶活性發揮作用，催化色氨酸生成犬尿氨酸，色氨酸的消耗可激活一般性調控阻遏蛋白激酶2（GCN2）和哺乳動物雷帕霉素靶點，從而一方面導致效應細胞的抑制和無能，另一方面提高Treg活性。血紅素加氧酶-1（HO-1）是一種在體內降解血紅素、抑制免疫反應和炎癥的細胞內酶。CHAUVEAU等［24］研究表明，未成熟DCs自發表達HO-1，而成熟的DCs則不表達。鈷原卟啉處理未成熟DCs使HO-1表達上調，抑制了DCs表型成熟和促炎細胞因子的分泌，從而抑制T細胞增殖。

3.5tolDC與Treg的 相 互作用Foxp3+Treg對于維持免疫耐受和預防自身免疫病至關重要，其數量或功能的異常可能會導致自身免疫病的發生，Foxp3+Treg持續存在的必要條件是tolDC提供持續的抗原刺激。ODOBASIC等［25］的研究結果表明，NF-κB抑制劑誘導產生的tolDC通過多種途徑從CD4+Foxp3-細胞中產生Foxp3+Treg，并通過誘導共刺激因子（ICOS）誘導產生IL-10+Treg。同時，也有研究表明，Foxp3+Treg可誘導產生tolDC［26-27］。Foxp3+Treg會 產 生IL-10，TGF-β從 而調 控DCs的 發育。Foxp3+Treg還可通過下調DCs表面CD80/86的表達抑制DCs成熟。總之，tolDC和Treg間可能存在著類似反饋的機制以保證免疫耐受的穩定發生。

3.6tolDC產生作用的分子機制DC的糖酵解途徑也和免疫耐受息息相關，FERREIRA等［28］研究表明，在活性維生素D3（1，25［OH］2D3）誘導產生的tolDC中，與葡萄糖代謝、三羧酸循環和氧化磷酸化直接相關的幾個基因表達上調。tolDC通過PI3K/Akt/mTOR通路控制糖酵解，通過激活該通路，糖酵解增強，同時DCs表面的CD80/86，HLA-DR等分子的表達減少，IL-10/IL-12p70表達增多。降低葡萄糖濃度或阻斷PI3K/Akt/mTOR通路，其耐受表型均不能維持。提示免疫細胞的代謝過程可能影響表面共刺激分子的表達及細胞因子的產生從而誘導耐受。在過敏性疾病中，DCs的耐受性可能與miRNAs有關。在ZHENG等［29］的研究中，采用卵清蛋白處理使DC成熟過程受阻，其miR-23b表達水平升高，表面共刺激分子減少，IL-10產生增加，IL-12產生減少，Treg的分化能力增強。Notch信號通路在DC分化和功能調節中發揮重要作用，Notch蛋白是一類細胞發育中高度保守的跨膜蛋白，可介導T細胞激活。最近的研究表明，miR-146a可通過靶向Notch1信號促進DC的耐受性，導致其成熟過程受阻，產生耐受表型［30］。

4 tolDC的臨床應用前景

DCs最初應用于誘導腫瘤特異性免疫反應的試驗，由于人們認識到DCs不僅誘導而且抑制T細胞反應，因此開始將DCs應用于免疫耐受。tolDC已被用于自身免疫病的治療，如多發性硬化、1型糖尿病、類風濕關節炎［4］。在ZUBIZARRETA等［31］關于多發性硬化和視神經脊髓炎治療的研究中，通過利用表達特殊抗原的tolDC誘導患者產生對自身抗原例如髓鞘衍生肽、水通道蛋白4的耐受取得了一定的療效，在治療期間，患者外周血單核細胞產生的IL-10水平降低，Treg增多。tolDC在臨床上也被用于治療類風濕和炎癥性關節炎。BELL等［32］研究表明，患者在關節鏡下進行含tolDC的鹽水沖洗后，5 d內未出現膝關節耀斑。在接受高劑量tolDC治療的患者中，其癥狀緩解保持穩定。但能夠治療該病的具體劑量并不清楚，低劑量的治療可能會導致疾病惡化。tolDC被認為是治療1型糖尿病的一種有效的免疫療法，NIKOLIC等［33］首次對負載胰島素原肽的tolDC在臨床上治療1型糖尿病的可行性和安全性進行評估，在該Ⅰ期臨床試驗中，選取了9例長期1型糖尿病患者（平均病程超過12年），通過皮內注射方法將tolDC注入患者體內，在隨后6個月的隨訪過程中，所有患者都保持了嚴格的血糖控制，HbA1c值穩定，β細胞功能和總體糖尿病控制保持穩定，同時沒有全身免疫抑制的跡象，沒有出現胰島素過敏，并且不干擾胰島素的治療。但由于臨床研究的局限性，這種新型免疫干預療法仍需要進一步研究。在炎癥性腸病的治療方面，體外產生的自體tolDC能夠誘導免疫耐受，具有一定的臨床應用前景。在JAUREGUI-AMEZAGA等［34］對tolDC治療克羅恩病的安全性和療效性進行的Ⅰ期臨床試驗中，將體外誘導產生的單核細胞來源的tolDC在超聲引導下以腹膜內注射給藥的方式注入克羅恩病患者體內后，患者體內的tolDC表面共刺激分子CD80、CD86表達上調，而CD83分子則與之相反。免疫檢測發現tolDC產生高水平的抗炎細胞因子IL-10，促炎因子IL-12p70和IL-23完全不存在，循環Treg的增加和IFN-γ水平的降低表明免疫抑制狀態至少在細胞水平上被誘導。患者在觀察隨訪的1年內保持無糖皮質激素臨床緩解，同時也未出現任何不良反應，說明tolDC的治療安全有效。tolDC在過敏性疾病中也有較好的應用前景，在SEMITEKOLOU等［35］的研究中，將激活素A誘導產生的Treg過繼轉移至氣道致敏小鼠模型內，影響了IRF4基因的正常表達，導致DCs成熟受阻，攝取抗原能力減弱，增強了DCs的耐受性，改善了小鼠的哮喘表現。

5 小結

具有耐受性表型的DCs是免疫系統的重要組成部分，在健康和疾病中調節免疫應答。然而，目前尚不清楚tolDC是構成一個特定的譜系，還是僅僅反映DC的未成熟狀態。事實上，這些選擇并非相互排斥。可以預期的是，耐受性表型由特定的信號和轉錄程序控制，隨著對tolDC研究的深入，了解其分化所需要的一系列條件，就能避免其使用過程中的風險［2］。目前tolDC在臨床上的應用還非常有限，但就目前的研究來看，其對人體的作用大體上是安全的。對于自身免疫病和炎癥性疾病來說，一旦尋找到誘導穩定tolDC的最佳方法，了解耐受產生的機制及過繼免疫途徑就能為該類疾病開辟全新的治療方法。