樹鼩用于構建自身免疫性疾病動物模型展望①

曾雯 雷玲 趙鋮（廣西醫科大學第一附屬醫院風濕免疫科，南寧 530021）

樹鼩（tupaia belangeri，tree shrew）是一種生活在東南亞、中國華南、西南地區的哺乳綱攀鼩類小型動物，形似松鼠。中國樹鼩基因組數據庫（www.treeshrewdb.org）闡明了樹鼩的基本生物學特性，其高質量的樹鼩基因組解析與人類基因組對比發現，樹鼩有28個基因組是靈長類動物特有的，且這些基因在樹鼩與人類的多種疾病的發病機制中存在高度的一致性［1］。世界衛生組織推薦在動物試驗中選用樹鼩替代靈長類動物進行人類疾病研究［1］。樹鼩的資源開發研究已被納入國家“十一五”“十二五”科技支撐計劃。樹鼩已成功用于病毒性肝炎、流行性感冒、視覺疾病、神經系統疾病、腫瘤等多種疾病的動物模型建立以及研究，但在自身免疫性疾病中少見應用。

基礎研究已建立多種自身免疫疾病動物模型，包括自發型、誘導型和基因工程動物模型。目前多采用嚙齒類動物模型，但其與人類的親源性相差甚遠，在生理學和免疫學上與人類有較大差異，不能復制人類疾病的組織學、免疫學特點的全貌。樹鼩具有與人類更相似的遺傳學、生物學特性，是有巨大開發前景的自身免疫疾病試驗動物。本文就樹鼩的基因、組織學、免疫學、分子生物學研究進展進行綜述，探討樹鼩用于建立自身免疫疾病動物模型的優勢及挑戰。

1 免疫分子

1.1主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）樹鼩MHC的基因序列與人類高度保守，與小鼠相比，MHCⅠ類基因數、系統發育樹更接近［2-3］。樹鼩的一類MHCⅠ基因位于人類白細胞抗原A（human leukocyte antigen，HLA-A）區，與人類基因座具有良好的同源性，樹鼩MHCⅡ類區域包含所有人類Ⅱ類基因同源體，包括經典Ⅱ類基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR，以及非經典Ⅱ類基因HLA-DM、HLA-DO，樹鼩的Ⅲ類區域與人類基因序列高度保守［3］。NKG2D配體家族由MHCⅠ和自然殺傷細胞活化性配體UL16結合蛋白（UL16-binding proteins，ULBPs）組成，小鼠和人類的配體家族組成不同，而 樹 鼩與人類NKG2D配體家族 相 似［4-5］。MHC和HLA參與多種自身免疫疾病的發病機制，其中包括：HLA-DR15、HLADR1分別是Goodpasture病的易感等位基因和保護性等位基因，HLA-DR15和HLA-DR4是多發性硬化的易感等位基因等［6-8］。樹鼩與人類的MHC、HLA基因同源性遠高于小鼠，使用樹鼩建立自身免疫疾病模型，可能更容易得到與人類發病特點更相似的結果。

1.2細胞因子

1.2.1趨化因子自身免疫疾病的趨化因子相關研究日趨增長。樹鼩的趨化因子配體12（chemokine ligand 12，CXCL12）蛋白與人和猴CXCL12氨基酸序列的同源性高達94.4%。樹鼩的趨化性細胞因子受體4（chemokine receptor 4，CXCR4）蛋白與人和猴子的CXCR4蛋白的相似性高達97%，而小鼠和大鼠的CXCR4蛋白與人和猴子的相似性分別為91%和92%。研究發現：重組人CXCL12蛋白在體外直接促進了樹鼩淋巴細胞的遷移［9］。樹鼩和人類之間的CXCL8和CXCR12的結合域高度保守，且人CXCL8蛋白可誘導由樹鼩CXCR12表達的外周血單核細胞遷移，使用變構拮抗劑（瑞帕霉素和SB265610）阻斷人CXCL8和樹鼩CXCR12相互作用后，樹鼩外周血單核細胞遷移顯著降低［10］。樹鼩的多個趨化因子與人類存在跨物種交叉免疫反應，樹鼩趨化因子可能發揮與人類相同或相似的作用。而研究顯示人與小鼠之間CXCL1和CXCL10等多個趨化因子沒有交叉反應，尚未檢索到人與小鼠、大鼠之間趨化因子跨物種交叉免疫反應的報道［11］。

1.2.2銀屑病素蛋白樹鼩與人的基因組中大部分序列高度保守，樹鼩基因組中有28個基因為靈長類動物特征，其中包括銀屑病素蛋白（psoriasin protein）編碼基因，但該基因嚙齒類動物并不具備［3］。在銀屑病患者角化細胞中大量表達，銀屑病素涉及多種細胞內外功能，包括免疫應答、鈣穩態調節、細胞增殖分化及凋亡、細胞趨化、蛋白質磷酸化、調節轉錄因子等，是皮膚屏障的重要組成部分［12-14］。

1.2.3白細胞介素（interleukin，IL）研究顯示樹鼩的多個IL基因、氨基氮與人類的同源性均遠高于小鼠、大鼠，包括IL-21、IL-6、IL-2等［15-17］。

樹鼩的IL-21與人類IL-21核苷酸序列的比對率為83.33%，氨基酸序列的比對率為69.93%。樹鼩IL-21的二級結構、疏水性和表面電荷也與人類IL-21相似。樹鼩IL-21與人類IL-21具有高度的同源性、結構相似性和免疫交叉反應性［16］。IL-21R中和抗體已成為多種自身免疫疾病的潛在治療方法，并在系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者開展ⅠB期臨床試驗［18］；人類和嚙齒動物IL-21的同源性較低（61%～65%），不能產生跨物種交叉免疫反應。目前多采用雜交瘤細胞系方法制造IL-21中和抗體，使用基因工程改造的人源化小鼠生產，但該方法通常面臨人源化小鼠體內IL-21R對靶抗原的親和力降低、抗體濃度低下挑戰，且人源化小鼠成本較高［19］。樹鼩可給IL-21中和抗體的研發和制備提供新的思路。

氨基酸序列分析顯示，人IL-6氨基酸序列與樹鼩的相似度高于大鼠和小鼠，且樹鼩受體蛋白中完全保留了對IL-6受體結合至關重要的殘基；樹鼩25個氨基酸的信號肽和一個IL-6超家族結構域與人IL-6的蛋白特征相符，蛋白質建模提示樹鼩與人的IL-6結構具有高度同源性［17］。抗IL-6R抗體治療克羅恩病、強直性脊柱炎的臨床試驗結果不如小鼠動物試驗效果顯著，可能是與IL-6基因、氨基酸及功能差異相關［20］。

1.3Toll樣受體樹鼩天然免疫識別受體Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）1～9蛋白組成結構與人類TLRs在親緣上很近，高于嚙齒類動物與人的親緣性，尤其是對TLR8的深入研究發現樹鼩TLR8的功能與人相同，能識別人TLR8的配體R848，并受其刺激而上調表達水平［21-22］。而小鼠TLR8無此功能［23］。許多TLR參與多種自身免疫疾病的發病，如TLR8能增加基質金屬蛋白酶抑制劑-1的表達水平，促進系統性硬化（systemic sclerosis，SSc）患者的肺組織纖維化［24］；TLR2（Pro631His）變異的單核苷酸多態性被認為與SSc的彌漫性病變和肺動脈高壓相關［25］。

2 免疫細胞與免疫器官

研究顯示，幼年與成年樹鼩的中性粒細胞和淋巴細胞百分比存在顯著差異，顯示出類似人類發育過程中中性粒細胞和淋巴細胞百分比“二次交叉”，且中性粒細胞百分比及細胞直徑較嚙齒類動物更接近人類［26］。對樹鼩的2 146個肝臟和肌肉組織的蛋白質進行鑒定，結果顯示近一半的蛋白質來自人類數據庫［27］。胸腺、脾和淋巴結等免疫器官的組化形態學研究，均提示樹鼩比嚙齒類動物（小鼠和大鼠）更接近于靈長類動物，為研究樹鼩建立人類相關自身免疫疾病的動物模型提供蛋白質組學、組織學依據［28］。

3 自身免疫疾病的樹鼩模型

迄今為止僅報道了SLE、類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）、和1型糖尿病3種人類自身免疫疾病的樹鼩模型。

3.1SLE模型RUAN等［29］將樹鼩腹腔內注射脂多糖和植脂烷成功建立SLE模型。該模型樹鼩表現為肝、脾、腎、肺、心的多臟器損害，肝臟病理表現為彌漫性肝細胞壞死、粒細胞浸潤、肝細胞大量變性。SLE相關性肝炎的異質性較大，部分文獻提示人類SLE相關肝炎病理為脂肪變性、干細胞大量壞死，與該樹鼩模型肝臟病理相似；且小鼠、大鼠的誘導型SLE模型多表現為單一或少數臟器受累［30-31］。樹鼩的SLE模型可能更能反映人類疾病的組織學特點的全貌。

3.2關節炎-間質性肺病模型GAO等［32］報道將樹鼩皮下注射牛Ⅱ型膠原蛋白建立關節炎-間質性肺病模型，該模型的肺部炎癥過程與小鼠、大鼠動物模型不同，表現為早期顯著的關節病變，較長時間后出現大量炎癥細胞肺部浸潤，該模型為探索RA相關的間質性肺病提供了一個獨特的實驗模型。

3.31型糖尿病在鏈脲佐菌素誘導1型糖尿病樹鼩體內檢測到較高水平的高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），且早期出現轉氨酶的升高，而鏈脲佐菌素誘導的小鼠及大鼠動物模型通常檢測到HDL降低，樹鼩更利于研究1型糖尿病患者HDL升高及糖尿病早期肝損害的機制［33-34］。此外樹鼩具有自發性糖尿病，其癥狀如酮癥、白內障以及胰腺病理學檢查等和人類糖尿病一致［33］。

據報道，每10種動物藥物研發的藥物中只有1種通過了臨床試驗，而臨床藥物實驗中與藥物相關的肝毒性是實驗終止的最常見原因之一。大多經肝臟清除的藥物被細胞色素P450酶（cytochrome P，CYP）代謝［35］。KARL等［36］的研究顯示，敲除小鼠特有NADPH-P450氧化還原酶基因后，注射吉非替尼及阿扎那韋試驗小鼠的藥物代謝更接近于人類。鼠類的P450功能基因與人類差異較大是鼠類與人藥代動力學差異的原因之一，而樹鼩的CYP功能基因比嚙齒動物更接近人類［35］

4 總結與展望

樹鼩兼具靈長目和嚙齒類動物的特點：其器官組織、生化代謝、基因組學與靈長類動物具有高度同源性，具有體型小、腦體比值高、繁殖周期短、生育能力強、易于飼養等優勢；且樹鼩與靈長類動物相比，更易獲取、價格更低廉、操作更方便、倫理審核更簡化。樹鼩獨特的遺傳學、分子生物學、組織學特性，決定了樹鼩在人類自身免疫疾病科學研究中的優勢。迄今使用樹鼩構建的自身免疫疾病動物模型已取得一定成果，相關研究顯示：樹鼩的免疫分子、免疫細胞的基因及氨基酸與人類具有保守性，樹鼩多個免疫分子與人類存在跨物種交叉免疫反應，樹鼩免疫細胞與免疫器官與人類的相近程度更高，以及樹鼩存在與人類更相似的藥物代謝機制。預示著樹鼩在自身免疫疾病研究領域的巨大應用前景。但樹鼩相較其他應用成熟的試驗動物而言，仍面臨許多挑戰，如經驗不足、樹鼩專用的特異性試劑盒正處于開發起步階段等，仍需不同領域的科學工作者協同合作，共同分享，突破瓶頸。