基于nNOS/CAPON相互作用探討參枝苓口服液對擬散發性AD小鼠海馬突觸的影響

田梅靜高晨艷鄭明翠和雁南王蓬文

(北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部和北京市重點實驗室,北京 100700)

年齡相關的阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者95%為散發性AD(sporadic AD,SAD),目前尚無切實有效的干預藥物[1],基于AD特征性病理改變的核心發病假說仍然是β-淀粉樣蛋白(Amyloid beta,Aβ)級聯假說,但與Aβ生成和降解相關的藥物開發以及針對Aβ單克隆抗體的臨床試驗結果并不樂觀[2]。因此,有必要對Aβ毒性信號傳遞的下游進行探索。Aβ過度激活突觸后膜上的N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDARs),導致Ca2+內流增多,引起神經元過度興奮損傷突觸。NMDARs被激活時,神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)與神經元型一氧化氮合酶羧基末端PDZ配體(carboxy-terminal PDZ ligand of neuronal nitric oxide synthase,CAPON)形成復合物傳遞NO信號,影響細胞外信號調控激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)/環磷腺苷反應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)信號途徑,損傷突觸,進而影響小鼠的學習記憶能力[3]。因此阻斷nNOS與CAPON的相互作用可能為AD的治療策略提供新的途徑。

參枝苓口服液是治療AD的中藥復方新藥(批準文號:國藥準字Z20120010),臨床可有效改善患者的輕度認知損害與精神行為癥狀,在控制AD早期癥狀上表現出明顯的優勢[4-5]。課題組前期發現參枝苓口服液可以改善AD小鼠髓鞘損傷,增加突觸前膜α7-nAchR和突觸后膜mGluR5兩種功能蛋白的表達,發揮早期神經保護作用[6-7],進一步研究發現,參枝苓口服液可以減少Aβ沉積,改善AD模型小鼠的學習記憶能力,但是否是通過影響Aβ毒性信號下游nNOS與CAPON的相互作用尚不清楚。因此本實驗采用隔日雙側側腦室注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法制備擬SAD模型小鼠,探究參枝苓口服液對擬SAD模型小鼠海馬nNOS與CAPON相互作用及其下游ERK/CREB通路的影響,為參枝苓口服液的臨床應用提供更多的實驗數據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性3月齡SPF級C57BL/6J小鼠72只,體重22～25 g,由北京華阜康實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2019-0008],飼養于北京中醫藥大學東直門醫院屏障環境動物室[SYXK(京)2020-0013],溫度為(22±2)℃,濕度為(45±5)%,自由飲水與攝食。本實驗已通過北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物倫理委員會批準(倫理號:19-46),實驗遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

參枝苓口服液(山東沃華藥業,國藥準字Z20120010);鹽酸多奈哌齊(衛材(中國)藥業有限公司,批號140635)。

STZ(美國Sigma公司,S0130);鼠單抗β-actin、兔單抗nNOS、CAPON(英國Abcam公司,ab8826,ab76067、ab190686);兔單抗ERK、p-ERK、CREB、p-CREB(美國CST公司,#4370、#4695、#9197、#9198);Protein A/G PLUS-Agarose(美國Santa公司,sc-2003);Rabbit IgG(H+L)(北京博奧森生物技術有限公司,bs-0295P);5×蛋白上樣緩沖液、脫脂奶粉、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10×電轉液、1×PBS緩沖液(pH 7.2～7.4)、20×TBST、SDS(北京索萊寶科技有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司,C05-02001);超敏ECL化學發光試劑盒(新賽美生物科技有限公司,P10100);兔免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司,KIT-9707);DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司,ZLI-9018)。

Morris水迷宮實驗儀器(上海移數信息科技有限公司);Mini-PROTEAN3電泳儀(美國BIORAD公司);JEM-2100F型透射電鏡(日本日立電子公司);4℃低溫高速離心機(美國 Thermo公司);CB-128C酶標儀(奧地利);EG1150H石蠟包埋機、RM2235石蠟切片機(德國Leica);Tanon-4600全自動化學發光圖像分析系統。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組、模型制備及給藥

72只C57BL/6J雄性小鼠隨機分為對照組12只、造模組60只。造模組第1天及第3天雙側側腦室注射用人工腦脊液配制的,濃度為3 mg/kg的STZ,制作擬SAD小鼠模型,對照組同等條件注射人工腦脊液。在前囟后0.8 mm、矢狀縫旁開1.5 mm處用牙科鉆打開顱骨,暴露出硬腦膜,微量注射器垂直進針2 mm,緩緩注入5 μL液體,注射時間5 min,注射完畢后用無菌線縫合切口[8-9]。將造模組的小鼠隨機分為模型組、多奈哌齊組和參枝苓高、中、低劑量組。

以成人臨床劑量的10倍為中劑量組,參枝苓高、中、低劑量組分別按照50 g/(kg·d)、25 g/(kg·d)、12.5 g/(kg·d)的劑量灌胃,多奈哌齊組按0.92 mg/(kg·d)的劑量灌胃給藥。對照組和模型組均給予0.5% CMC灌胃給藥,給藥體積為0.1 mL/10 g,每日晨8時給藥,連續給藥3個月。

1.3.2 Morris水迷宮檢測各組小鼠的空間學習記憶能力

圓形水池被分為四個象限,平臺位于第3象限。實驗共進行6 d,前2 d為訓練時間,每天訓練3次,每次120 s。從1、2、4象限的邊緣中央將動物面向池壁放入水中,記錄小鼠找到站臺的游泳時間。如果動物在120 s內未找到平臺,則將其引至平臺停留10 s,逃避潛伏期記為120 s。第3～5天重復如上操作進行測試,但不再對未找到站臺的小鼠進行引導。第6天撤除平臺,選擇第1象限將動物放人水中,動物在水中游泳120 s,測量120 s內小鼠穿越目標平臺次數。

1.3.3 透射電鏡觀察各組小鼠海馬CA1區突觸數量

行為學實驗結束后,每組3只小鼠三溴乙醇(350 mg/kg)腹腔麻醉后進行灌注固定,完成后用剪刀斷頭,取出小鼠完整腦組織后剝離出海馬,用手術刀片切取海馬CA1區,置于裝有2.5%戊二醛溶液的EP管中,4℃靜置2 h以充分固定。之后用0.1 mol/L PBS緩沖液每隔15 min沖洗1次,重復3次后將標本放在裝有0.1 mol/L PBS緩沖液的EP管中,立即將標本送至北京陸軍總醫院八一腦科醫院電鏡室進一步制作超薄切片。在×1500倍數的視野下隨機取3個神經氈計算突觸數量的平均值。

1.3.4 免疫共沉淀檢測nNOS與CAPON的相互作用

每組3只小鼠處死后取新鮮海馬磨碎,PBS洗滌,4℃ 12000 r/min離心3 min,棄上清,重復2次。樣本中加入1 mL IP裂解液冰上裂解30 min,4℃12000 r/min離心10 min小心吸取上清于新1.5 mL離心管中,即為提取好的蛋白,于提取好的蛋白中取100 μL于新的1.5 mL離心管中加入適量蛋白上樣緩沖液(5×)煮沸變性10 min作為Input樣本,-20℃保存待用;另取500 μL蛋白加入10 μL一抗(兔單抗nNOS);再另取200 μL蛋白加入Rabbit IgG 4℃旋轉預敷育2 h,預敷育結束后樣本中加入40 μL Protein A/G PLUS-Agarose,4℃旋轉敷育過夜。第2天4℃ 3000 r/min離心5 min,小心棄掉上清,加入1 mL IP裂解液清洗磁珠,4℃ 3000 r/min離心5 min,重復3次,盡量吸盡上清,沉淀中加入100 μL 蛋白上樣緩沖液(1×)煮沸變性10 min作為IP樣本,-20℃保存待用。

1.3.5 免疫組化檢測ERK與CREB的陽性表達細胞數

每組3只小鼠麻醉后用4%的多聚甲醛進行灌注固定取材。將固定的腦組織進行冠狀面取材、脫水、石蠟包埋。隨后對海馬組織進行連續地冠狀切片,切片厚度約為4 μm。然后進行烤片(56℃ 60 min)、二甲苯脫蠟、復水、枸櫞酸緩沖液修復抗原、阻斷內源性過氧化物酶、滴加正常山羊血清封閉、滴加1∶500的一抗4℃過夜、滴加二抗、DAB顯色、脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下(×20)觀察,海馬CA1區選取3個視野,用Motic 6.0 軟件系統拍攝圖片,并用ImagePro Plus軟件計算目的蛋白陽性表達細胞數的平均值。

1.3.6 Western blot檢 測ERK、p-ERK、CREB、p-CREB的表達

每組3只小鼠處死后立即置于冰板上迅速剝離出小鼠的海馬,放入凍存管中置于液氮罐中儲存備用。檢測時,將海馬從液氮罐中取出轉移至EP管中,加入高效RIPA組織裂解液,使用超聲勻漿儀將組織勻漿之后進行離心,取上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒說明,配制工作液和蛋白標準品,對海馬組織進行蛋白濃度測定。按照制膠上樣后電泳(60 V 1 h,90 V 40 min,120 V 20 min),使用PVDF膜進行轉膜(200 mA 90 min),5%脫脂牛奶封閉、加入1∶1000的一抗過夜、加二抗、加發光液、曝光的順序進行操作。用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度值分析,各組目標蛋白分別與內參β-actin(1∶10000)進行比較,計算其百分數,得出結果。

1.4 統計學方法

使用統計軟件SPSS 20.0進行統計分析,實驗結果用平均數±標準差(±s)表示,若數據滿足正態分布且方差齊,則采用單因素方差分析(ANOVA)進行多組間數據的統計分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗;若不符合正態分布或方差不齊則采用非參數檢驗。以P＜0.05為有統計學差異,P＜0.01為有顯著統計學差異。

2 結果

2.1 參枝苓口服液對各組小鼠空間學習記憶能力的影響

2.1.1 各組小鼠的逃避潛伏期

Morris水迷宮顯示,隨著訓練天數增加,從第1～5天各組小鼠的逃避潛伏期均縮短。與對照組相比,從第1～5天,模型組小鼠的逃避潛伏期顯著增加(P＜0.01)。與模型組相比,第4天和第5天,參枝苓高劑量組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05),多奈哌齊組和參枝苓中、低劑量組小鼠的逃避潛伏期顯著縮短(P＜0.01)。見表1。

表1 各組小鼠的逃避潛伏期(±s,n=12)Table 1 Escape latency of mice in each group

表1 各組小鼠的逃避潛伏期(±s,n=12)Table 1 Escape latency of mice in each group

注:與對照組比較, **P＜0.01;與模型組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the control group, **P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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2.1.2 各組小鼠撤臺后穿越平臺的次數

第6天撤臺后,與對照組相比,模型組小鼠穿越平臺的次數顯著減少(P＜0.01)。與模型組相比,多奈哌齊組和參枝苓中、低劑量組小鼠穿越平臺的次數顯著增加(P＜0.01),參枝苓高劑量組小鼠穿越平臺的次數明顯增加(P＜0.05)。見表2。

表2 撤臺后各組小鼠穿越平臺次數 (±s,n=12)Table 2 Number of crossing platform in each group

表2 撤臺后各組小鼠穿越平臺次數 (±s,n=12)Table 2 Number of crossing platform in each group

注:與對照組比較, **P＜0.01;與模型組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the control group, **P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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2.2 參枝苓口服液對各組小鼠海馬CA1區突觸數量的影響

在×1500視野下,與對照組相比,模型組小鼠海馬CA1區神經氈突觸數量顯著減少(P＜0.01);與模型組相比,多奈哌齊組和參枝苓高、中、低劑量組小鼠海馬CA1區突觸數量均顯著增加(P＜0.01)。見圖1、表3。

圖1 各組小鼠海馬CA1區神經氈的超微結構Note. A, Control group. B, Model group. C, Donepezil group. D, SZL-H group. E, SZL-M group. F, SZL-L group. →, Synapses (the caterpillar-like black postsynaptic membrane density in the nerve felt is the site of the synapse).Figure 1 Ultrastructure of nerve felt in the hippocampal CA1 region of mice in each group

表3 各組小鼠海馬CA1區突觸數量(±s,n=3)Table 3 Number of synapses in the hippocampal CA1 region of mice in each group表4 各組小鼠海馬nNOS與CAPON的相互作用(±s,n=3)Table4 Interaction between nNOS and CAPON in hippocampus of mice in each group

表3 各組小鼠海馬CA1區突觸數量(±s,n=3)Table 3 Number of synapses in the hippocampal CA1 region of mice in each group表4 各組小鼠海馬nNOS與CAPON的相互作用(±s,n=3)Table4 Interaction between nNOS and CAPON in hippocampus of mice in each group

注:與對照組比較, **P＜0.01;與模型組比較, ##P＜0.01。Note. Compared with the control group, **P＜0.01. Compared with the model group, ##P＜0.01.

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2.3 參枝苓口服液對各組小鼠海馬nNOS與CAPON相互作用的影響

免疫共沉淀結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠nNOS與CAPON的相互作用顯著增加(P＜0.01);與模型組相比,各干預組小鼠nNOS與CAPON的相互作用均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。見圖2、表4。

圖2 各組小鼠海馬nNOS與CAPON的相互作用Note. A, Control group. B, Model group. C, Donepezil group. D,SZL-H group. E, SZL-M group. F, SZL-L group.Figure 2 Co-immunoprecipitation of nNOS and CAPON in hippocampus of mice in each group

2.4 參枝苓口服液對各組小鼠海馬CA1區ERK、CREB陽性表達細胞數的影響

免疫組化染色結果顯示,ERK、CREB蛋白免疫反應陽性表達產物多分布在胞質,為棕黃色顆粒。各組小鼠海馬CA1區ERK的陽性表達細胞數沒有差異。見圖3a、表5。而與對照組相比,模型組小鼠CREB陽性表達細胞數顯著減少(P＜0.01);與模型組相比,參枝苓高、中劑量組小鼠CREB陽性表達細胞數均顯著增多(P＜0.01),多奈哌齊組和參枝苓低劑量組小鼠CREB陽性表達細胞數明顯增多(P＜0.05)。見圖3b、表5。

表5 各組小鼠海馬CA1區ERK和CREB陽性表達細胞數(±s,n=3)Table 5 Positive cells of ERK and CREB in the hippocampal CA1 region of mice in each group

表5 各組小鼠海馬CA1區ERK和CREB陽性表達細胞數(±s,n=3)Table 5 Positive cells of ERK and CREB in the hippocampal CA1 region of mice in each group

注:與對照組比較, **P＜0.01;與模型組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the control group, **P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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圖3 各組小鼠海馬CA1區ERK和CREB免疫組化染色Note. a, Distribution and positive expression of ERK in the hippocampal CA1 region of mice in each group. b, Distribution and positive expression of CREB in the hippocampal CA1 region of mice in each group. A, Control group. B, Model group. C, Donepezil group. D, SZL-H group. E, SZL-M group. F, SZL-L group.Figure 3 Immunohistochemical staining of ERK and CREB in hippocampal CA1 region of mice in each group

2.5 參枝苓口服液對各組小鼠海馬ERK、p-ERK蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,各組小鼠海馬ERK的表達趨勢與免疫組化染色一致,各組小鼠無差異。但與對照組相比,模型組小鼠p-ERK表達顯著降低(P＜0.01),p-ERK/ERK水平顯著降低(P＜0.01);與模型組相比,多奈哌齊組與參枝苓各干預組小鼠p-ERK表達均顯著增加(P＜0.01),p-ERK/ERK水平也顯著增加(P＜0.01)。見圖4、表6。

表6 各組小鼠海馬ERK和p-ERK蛋白表達(±s,n=3)Table 6 Protein expression of ERK and p-ERK in hippocampus of mice in each group

表6 各組小鼠海馬ERK和p-ERK蛋白表達(±s,n=3)Table 6 Protein expression of ERK and p-ERK in hippocampus of mice in each group

注:與對照組比較, **P＜0.01;與模型組比較, ##P＜0.01。Note. Compared with the control group, **P＜0.01. Compared with the model group, ##P＜0.01.

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圖4 各組小鼠海馬ERK、p-ERK蛋白表達Note. A, Control group. B, Model group. C, Donepezil group. D,SZL-H group. E, SZL-M group. F, SZL-L group.Figure 4 Band of ERK and p-ERK protein expression in hippocampus of mice in each group

2.6 參枝苓口服液對各組小鼠海馬CREB、p-CREB蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,各組小鼠海馬CREB的表達趨勢與免疫組化染色大體一致,與對照組相比,模型組小鼠CREB的表達顯著下降(P＜0.01);與模型組相比,參枝苓高、低劑量組小鼠CREB的表達明顯增加(P＜0.05),多奈哌齊組和參枝苓中劑量組小鼠CREB的表達顯著增加(P＜0.01)。并且與對照組相比,模型組小鼠p-CREB的表達顯著降低(P＜0.01),p-CREB/CREB水 平 顯 著 降 低(P＜0.01);與模型組相比,多奈哌齊組與參枝苓各干預組小鼠p-CREB的表達均顯著增加(P＜0.01),p-CREB/CREB水平也均顯著增加(P＜0.01)。見圖5、表7。

圖5 各組小鼠海馬CREB、p-CREB蛋白表達Note. A, Control group. B, Model group. C, Donepezil group. D,SZL-H group. E, SZL-M group. F, SZL-L group.Figure 5 Band of CREB and p-CREB protein expression in hippocampus of mice in each group

表7 各組小鼠海馬CREB和p-CREB蛋白表達(±s,n=3)Table 7 Protein expression of CREB and p-CREB in hippocampus of mice in each group

表7 各組小鼠海馬CREB和p-CREB蛋白表達(±s,n=3)Table 7 Protein expression of CREB and p-CREB in hippocampus of mice in each group

注:與對照組比較, **P＜0.01;與模型組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the control group, **P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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注:與對照組比較, **P＜0.01;與模型組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the control group, **P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

3 討論

STZ是一種氨基葡萄糖亞硝基脲化合物,向嚙齒類動物側腦室注射亞糖尿病劑量的STZ會損傷大腦中的胰島素受體,形成腦內胰島素抵抗狀態,引起糖原合成酶激酶的改變,造成腦葡萄糖代謝低下、氧化應激、膽堿能缺陷、神經炎癥等與人類SAD相似的病理生理改變,但動物外周血糖水平在此過程中并無改變,故在國內外被廣泛應用于SAD的實驗研究[10-12]。課題組前期實驗也證明,雙側側腦室注射STZ 3個月后,小鼠出現學習記憶能力下降以及Aβ沉積、tau蛋白的磷酸化增加、突觸傳遞障礙與功能紊亂等AD病理改變[13-14],因此本次實驗選用STZ誘導的SAD 動物模型。

AD是一種中樞神經系統退行性疾病,在中醫中歸屬于“癡呆”范疇,AD病位在腦,與心、肝、脾、腎等臟腑有關,其中與心的關系最為密切。《素問·靈蘭秘典論》云:“心者,君主之官,神明出焉”,心主宰著人的意識與思維活動[15]。若心氣不足,無力推動血液在脈中運行,營養物質不能隨血液到達腦部,大腦失于濡養,則會出現一系列精神活動的改變。若心血不足,心神失去活動的物質基礎,也會導致心主神志的功能下降。參枝苓口服液以“心主神明”立方,君藥黨參補益元氣,增智安神;臣藥桂枝、干姜溫通血脈;佐藥遠志、茯苓、菖蒲開竅化痰,龍骨、牡蠣固澀寧神,使藥白芍、甘草養血和營,全方共奏補益心氣,益智化痰之功。本研究中用參枝苓口服液治療STZ誘導的擬SAD小鼠3個月后,參枝苓各干預組小鼠的逃避潛伏期均明顯減少,撤臺后穿越平臺的次數明顯增加,說明參枝苓口服液可以提高擬SAD模型小鼠的學習記憶能力。

CAPON是nNOS的一個接頭蛋白,間接結合到NMDARs,是許多神經系統疾病的危險因素,如精神分裂癥、自閉癥、雙相情感障礙、創傷后應激障礙和抑郁癥[16-17]。CAPON還可以調節樹突形態、樹突模式和樹突棘的發育,原位雜交技術發現CAPON與nNOS在空間上有共定位現象[18]。當NMDARs被Aβ激活時,CAPON與nNOS形成一個復合物傳遞NO信號給Dexras1,S-亞硝基化激活的Dexras1會抑制其下游ERK的磷酸化,進而影響CREB的活化[19]。研究發現,在APP/PS1雙轉基因小鼠海馬中nNOS與CAPON的相互作用增加,用Aβ1-42孵育原代神經元24 h后,nNOS與CAPON的相互作用也顯著增加[3]。本研究免疫共沉淀結果表明,與對照組比,模型組小鼠nNOS與CAPON的相互作用顯著增加,經過3個月的藥物干預,參枝苓不同劑量組nNOS與CAPON的相互作用均有不同程度的減少。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)級聯反應是將胞外信號從細胞表面傳導到細胞內部的重要信號系統,在細胞增殖、分化、存活和凋亡過程中發揮著重要作用[20]。ERK是MAPK信號的重要組成部分,ERK1和ERK2是ERK的兩種亞型,p-ERK 激活下游CREB的表達,轉錄因子CREB在認知中起著至關重要的作用,是學習和記憶的關鍵分子,CREB介導的基因表達是長期記憶和突觸可塑性所必需的[21]。研究報道,CREB介導的基因表達在AD患者的大腦中明顯受損[22]。本研究發現,與對照組相比,模型組小鼠ERK的表達無明顯變化,但p-ERK、CREB、p-CREB的表達顯著降低,p-ERK/ERK、p-CREB/CREB水平顯著降低,海馬CA1區突觸數量顯著減少,經過3個月的治療,參枝苓不同劑量組p-ERK、CREB、p-CREB的表達均明顯增加,p-ERK/ERK、p-CREB/CREB水平顯著增加,海馬CA1區突觸數量均顯著增加。

綜上所述,參枝苓口服液改善擬SAD小鼠的學習記憶能力可能與減少nNOS與CAPON的相互作用,增加p-ERK、CREB、p-CREB的表達以及p-ERK/ERK、p-CREB/CREB水平,進而增加突觸數量有關,但由于中藥復方多成分多靶點的治療作用,因此參枝苓口服液治療AD的更多潛在機制還需進一步探討。