基于SDF-1/CXCR4軸觀察濟(jì)生腎氣湯對肝硬化大鼠BMSCs歸巢的影響

周曉玲王月明吳 騰陳 峭余靜芳李 燦李澤鵬陸世銀張 悅覃鳳傳沈新輝

(1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院(柳州市壯醫(yī)醫(yī)院),廣西 柳州 545001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),南寧 530200)

肝硬化是由各種損傷因素導(dǎo)致的以肝細(xì)胞損傷壞死、膠原沉積、竇周纖維化及纖維間隔增寬等為主要病理性改變的疾病[1]。對于失代償期的肝硬化,目前最有效的治療手段為肝移植,但臨床上受到多種因素的限制[2]。而間充質(zhì)干細(xì)胞移植具有可及性強(qiáng)、安全性高、單次治療費(fèi)用較低等優(yōu)勢,有望成為缺乏肝移植條件時(shí)的替代治療之一[3]。但干細(xì)胞移植后的遷徙方向、能否存活等問題亟待解決[4]。目前的研究中多通過促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理干細(xì)胞、聯(lián)合使用粒細(xì)胞集落刺激因子等方式,提高干細(xì)胞歸巢效率,從而增強(qiáng)療效,但這些方式的安全性與有效性未得到臨床驗(yàn)證。

SDF-1/CXCR4軸在干細(xì)胞動(dòng)員、歸巢中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5],既往課題組應(yīng)用中藥聯(lián)合骨骼間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植治療肝硬化,發(fā)現(xiàn)經(jīng)典補(bǔ)腎方濟(jì)生腎氣湯可增加BMSCs向肝歸巢,促進(jìn)干細(xì)胞分化為功能肝細(xì)胞,加速肝再生,恢復(fù)肝功能[6],但濟(jì)生腎氣湯對干細(xì)胞歸巢的影響及具體作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究旨在探究濟(jì)生腎氣湯對移植BMSCs遷徙、定植及增殖的影響,并初步研究其與SDF-1/CXCR4軸的關(guān)聯(lián),為提高干細(xì)胞移植對肝硬化的治療效率提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD雄性大鼠,體重220～250 g,50只,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(湘)2019-0004],飼養(yǎng)溫度(25±2)℃,相對濕度50%～60%,予12 h光照,自由飲食;無菌手術(shù)在廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SYXK(桂)2019-0001]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核(DW20190105-034),實(shí)驗(yàn)涉及動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

濟(jì)生腎氣湯顆粒(熟地黃40 g、山茱萸20 g、山藥20 g、澤瀉15 g、茯苓15 g、丹皮15 g、肉桂5 g、附子5 g、車前子10 g、牛膝10 g)由培力(南寧)藥業(yè)有限公司提供,蒸餾水稀釋至8.75 g/2 mL,4℃保存?zhèn)溆?胎牛血清(批號:2335473CP)、DMEM培養(yǎng)基(批號:8121342)購于Gibco公司;CXCR4兔單克隆抗體(批號:GR3231217-19)購于abcam公司;SDF-1兔單克隆抗體(批號3503 S)購于CST公司;抗CD44抗體(批號:746123)購于BD公司;CD34鼠單克隆抗體(批號:9471PABX191031032420-PE)、抗CD105抗體(批號:532059040320-PE)購于Novus公司;ELISA試劑盒(批號:202102)購于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司;PKH67常規(guī)細(xì)胞膜標(biāo)記試劑盒(批號:DCM210707)購于北京富百科生物技術(shù)有限公司;DAPI溶液(批號:20210420)、Mayer1蘇木精染 料(批 號:20210419)、伊 紅 染 液(批 號:20200927)購于索萊寶有限公司。

低溫高速離心機(jī)購自美國Beckman coulter公司;全自動(dòng)生化分析儀購自日本Olympus公司;流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;熒光顯微鏡購自美國Thermo Fisher Scientific公司;酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與干預(yù)方法

40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為正常組、模型組、BMSCs移植組(BMSCs組)、BMSCs移植聯(lián)合濟(jì)生腎氣湯組(聯(lián)合組),每組10只。采用40%四氯化碳橄欖油溶液(四氯化碳溶液與橄欖油比例為4∶6)以0.2 mL/100 g劑量腹腔注射,每周3次,同時(shí)予高脂飼料(普通飼料顆粒90%,豬油8%,膽固醇2%)喂養(yǎng),共誘導(dǎo)8周建立肝硬化大鼠模型。與正常組比較,模型組大鼠血清ALT、AST及GGT水平顯著升高,且肝組織病理學(xué)觀察到假小葉生成及炎癥細(xì)胞浸潤等提示造模成功。造模后,BMSCs組采用熒光標(biāo)記的BMSCs懸浮液經(jīng)鼠尾靜脈注入大鼠體內(nèi),每周1次,連續(xù)注射4周;聯(lián)合組在此基礎(chǔ)上,根據(jù)“體表面積折算的等效劑量比率表”給予中藥混懸液8.75 g/(kg·d)灌胃,每日1次,連續(xù)4周;正常組與模型組不予干預(yù)。

1.3.2 BMSCs提取、培養(yǎng)及鑒定

取4周齡SD大鼠,處死后置于75%乙醇中浸泡10 min,超凈工作臺(tái)上分離股骨與脛骨,PBS液沖洗骨髓腔,收集沖洗液,常溫下1500 r/min離心10 min,棄去上清液,以含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液重懸制備成單細(xì)胞懸浮液,接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,72 h后首次換液,之后每2 d換液1次,3～4 d按1∶2進(jìn)行傳代。

第3代BMSCs生長融合達(dá)90%時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化,1000 r/min離心5 min并以PBS洗滌2遍,洗滌完后加入PBS重懸細(xì)胞。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)過濾后的細(xì)胞數(shù)量,每管取106個(gè)細(xì)胞重新懸于200 μL PBS中,加入CD34、CD44、CD105抗體,進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.3.3 BMSCs熒光標(biāo)記、移植、追蹤

0.25%胰蛋白酶消化并收集生長狀態(tài)良好的第3代BMSCs。稀釋適量PKH67染色工作液用于重懸細(xì)胞,重懸后濃度約每毫升106個(gè)。4℃孵育30 min,加入胎牛血清終止反應(yīng),離心后去除上清,沉淀用PBS洗滌2遍后加入完全培養(yǎng)液重懸,轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中,24 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

將熒光標(biāo)記的第3代BMSCs用生理鹽水稀釋配置成細(xì)胞懸浮液1.5 mL(約含細(xì)胞數(shù)量2×106個(gè))經(jīng)大鼠尾靜脈緩慢注入體內(nèi),每周1次,從第9周起,連續(xù)注射4周,至12周末取肝組織制作冰凍切片。DAPI染液常溫下復(fù)染10 min,流水沖去染液,加入抗熒光淬滅劑封片,置于熒光顯微鏡下觀察歸巢情況。

1.3.4 肝功能檢測

肝功能檢測禁食24 h,不禁水,將大鼠麻醉后,取腹主動(dòng)脈血,靜置30 min后離心分離血清,全自動(dòng)生化儀檢測ALT、AST、ALB、γ-GGT及TBIL等指標(biāo)。

1.3.5 HE染色

取大鼠肝組織,4%多聚甲醛固定、脫水、透明、石蠟包埋切片,進(jìn)行HE染色,置于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài),參照《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南(2019年版)》[7]對肝組織炎癥活動(dòng)度及纖維化分期進(jìn)行評分。

1.3.6 ELISA實(shí)驗(yàn)

取大鼠腹主動(dòng)脈血,離心,分離血清用于ELISA檢測GCSF、EPO、HGF及SCF,檢測過程依照ELISA試劑盒說明進(jìn)行,經(jīng)自動(dòng)計(jì)數(shù)程序得出濃度。

1.3.7 免疫組化分析實(shí)驗(yàn)

大鼠肝組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟處理后,高壓抗原修復(fù),依次滴加過氧化物酶阻斷液37℃封閉、10%非免疫血清37℃孵育、加入一抗工作液4℃過夜,生物素標(biāo)記二抗工作液37℃孵育及鏈酶親和素-生物素-辣根過氧化物酶工作液37℃孵育,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水透明,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照,用Image pro plus軟件計(jì)算IOD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩樣本均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn);多個(gè)樣本間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs表面抗原鑒定

流式細(xì)胞儀檢測全骨髓貼壁法培養(yǎng)的第3代BMSCs表面抗原CD34(-),CD44(+),CD105(+),見圖1。以上檢測結(jié)果證明提取的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。

圖1 細(xì)胞表面抗原檢測結(jié)果Figure 1 Cell surface antigen results

2.2 BMSCs的形態(tài)特征

鏡下見第三代細(xì)胞生長旺盛,形態(tài)均一,呈現(xiàn)旋渦樣結(jié)構(gòu)排列。見圖2。

圖2 倒置顯微鏡下觀察BMSCs形態(tài)特征Figure 2 Morphological characteristic of BMSCs under the inverted microscope

2.3 各組大鼠肝功能情況

與正常組比較,其余各組大鼠血清ALT、AST、γ-GGT及TBIL水平均增高,血清ALB水平下降;與模型組比較,BMSCs組與聯(lián)合組大鼠ALT、AST、γ-GGT及TBIL不同程度下降,ALB不同程度升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與BMSCs組比較,聯(lián)合組大鼠血清ALT、AST、γ-GGT、TBIL水平降低,ALB水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清ALT、AST、ALB、γ-GGT及TBIL比較Note. Compared with normal group, *P＜0.05. Compared with model group, ▲P＜0.05. Compared with BMSCs group, △P＜0.05.Figure 3 Comparison of ALT, AST, ALB, γ-GGT and TBIL in serum of rats

2.4 大鼠肝組織病理學(xué)觀察

正常組大鼠肝小葉的結(jié)構(gòu)、形態(tài)正常,無明顯的炎癥及纖維化病理表現(xiàn)。模型組大鼠肝索排列紊亂,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,中央靜脈偏離或消失,部分組織呈炎性細(xì)胞浸潤像,纖維結(jié)締組織增生,形成許多大小不等的假小葉且假小葉結(jié)構(gòu)紊亂。BMSCs組大鼠肝組織纖維化程度減輕,仍可見炎癥細(xì)胞浸潤。聯(lián)合組肝小葉結(jié)構(gòu)修復(fù),假小葉的數(shù)量有明顯的減少,肝索排列的整齊度改善,見少量的炎性細(xì)胞浸潤。見圖4。

圖4 各組大鼠肝組織病理學(xué)情況Figure 4 Liver pathology of rats in each group

肝病理學(xué)評分:與正常組比較,模型組大鼠肝組織炎癥及纖維化情況明顯;與模型組比較,BMSCs組、聯(lián)合組炎癥活動(dòng)度及纖維化情況均有不同程度改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),與BMSCs組比較,聯(lián)合中組改善情況明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肝組織炎癥活動(dòng)度及纖維化分期評分(n=10)Table 1 Liver inflammatory degree and fibrosis staging scores of rats

2.5 熒光顯微鏡觀察BMSCs 標(biāo)記及歸巢情況

熒光顯微鏡下見BMSCs呈長梭形、三角形,胞膜發(fā)綠色熒光,細(xì)胞標(biāo)記率為99.5%。陰性對照組僅見肝組織細(xì)胞著色的DAPI藍(lán)色熒光。BMSCs組與聯(lián)合組切片上可見組織細(xì)胞非特異著色的DAPI呈藍(lán)色熒光,及散在分布點(diǎn)狀綠色熒光。其中聯(lián)合組較BMSCs移植組同倍數(shù)視野下綠色熒光光點(diǎn)增多。見圖5。

圖5 BMSCs移植后在肝中的分布情況Figure 5 Distribution of BMSCs in liver after transplantation

2.6 血清GCSF、EPO、HGF及SCF表達(dá)情況

比較各組間大鼠血清GCSF、EPO、HGF、SCF,與正常組比較,模型組表達(dá)下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組大鼠比較,BMSCs組及聯(lián)合組均有上調(diào)(P＜0.05);與BMSCs組比較,聯(lián)合組血清GCSF、EPO、HGF、SCF表達(dá)水平更高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠血清GCSF、EPO、HGF及SCF表達(dá)情況比較Note. Compared with normal group, *P＜0.05. Compared with model group, ▲P＜0.05. Compared with BMSCs group, △P＜0.05.Figure 6 Comparison of GCSF, EPO, HGF and SCF expressions in serum of rats in each group

2.7 SDF-1、CXCR4蛋白在肝組織中定位表達(dá)

SDF-1蛋白在肝組織中陽性表達(dá)為細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒狀染色;CXCR4蛋白在肝中陽性表達(dá)為胞漿或者漿膜呈棕黃色顆粒狀染色。見圖7、圖8。

圖7 各組大鼠肝組織SDF-1表達(dá)Figure 7 Comparison of SDF-1 expression in liver of rats in each group

圖8 各組大鼠肝組織CXCR4表達(dá)Figure 8 Comparison of CXCR4 expression in liver of rats in each group

平均光密度值分析結(jié)果:與正常組比較,模型組肝SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)均有所下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較,BMSCs組與聯(lián)合組SDF-1、CXCR4蛋白均有所上調(diào),聯(lián)合組表達(dá)高于BMSCs組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肝組織SDF-1、CXCR4蛋白表達(dá)情況比較Table 2 Comparison of SDF-1 and CXCR4 protein expression in liver of rats in each group

3 討論

肝硬化是常見的臨床綜合征,流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),全球范圍內(nèi)肝硬化患者高達(dá)1.12億[8],每年4%～12%患者進(jìn)展為失代償期肝硬化[9],5年內(nèi)死亡率可升高至88%[10]。對于對癥支持治療無法改善的失代償期肝硬化、肝衰竭,肝移植是目前最有效的治療方式但存在許多限制臨床應(yīng)用的問題如:供體緊缺、器官分配、免疫排斥等。間充質(zhì)干細(xì)胞移植作為可及性較強(qiáng)的移植治療方法,可重復(fù)、單次費(fèi)用低、安全性高,被視為肝移植的有效替代手段,但如何促進(jìn)干細(xì)胞歸巢的問題亟待解決[11]。有學(xué)者提出中藥具有促進(jìn)干細(xì)胞歸巢的作用,如鱉甲煎丸、軟肝化纖方等中藥組方促進(jìn)干細(xì)胞向肝遷徙定植的作用已得到證實(shí)[12-13]。

中醫(yī)并無“肝硬化”病名,但在肝硬化治療領(lǐng)域有一定的文獻(xiàn)記錄,從“臌脹”、“黃疸”、“脅痛”等疾病的診療中可見一斑。中醫(yī)在肝病的治療中格外重視肝腎關(guān)系,如藏象理論中的“腎藏精”學(xué)說認(rèn)為,腎精聚而為髓,精髓化生血液充養(yǎng)肝,以供其維持生理功能,而腎精虧虛則是慢性肝病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,因此中醫(yī)在慢性肝病的治療強(qiáng)調(diào)“補(bǔ)益腎精”[14]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多分化潛能的細(xì)胞,可分化為各種功能細(xì)胞和組織器官,符合中醫(yī)理論中“腎精”和“髓”的范疇[15]。干細(xì)胞移植通過外源性增加干細(xì)胞來源治療肝硬化的方式,與中醫(yī)“補(bǔ)腎生髓生肝”理論吻合。本次研究運(yùn)用的濟(jì)生腎氣湯,源自《濟(jì)生方》,此方補(bǔ)瀉兼施,水火既濟(jì),諸藥合用共同達(dá)到補(bǔ)腎益髓,溫化輸布精氣的功效。臨床應(yīng)用中,濟(jì)生腎氣湯治療肝硬化已取得了明顯療效[16-17],并且在實(shí)驗(yàn)研究也有一定研究成果[18-19]。本次實(shí)驗(yàn)聯(lián)合濟(jì)生腎氣湯與BMSCs移植,發(fā)現(xiàn)模型大鼠肝功能指標(biāo)下降,病理檢查見肝硬化改善明顯,肝組織炎癥及纖維化評分顯著下降,說明BMSCs移植聯(lián)合濟(jì)生腎氣湯確有治療肝硬化療效;在肝組織冰凍切片中觀察到聯(lián)合組的干細(xì)胞數(shù)量多于BMSCs移植組,初步驗(yàn)證了濟(jì)生腎氣湯可促進(jìn)BMSCs遷移至肝內(nèi)定植和存活。

BMSCs移植的療效取決于歸巢與長期定植的能力,但BMSCs從骨髓向靶組織遷徙受到微環(huán)境中的多種因素復(fù)合影響。SDF-1/CXCR4軸是調(diào)節(jié)干細(xì)胞遷徙所需內(nèi)外環(huán)境的關(guān)鍵環(huán)節(jié),SDF-1是高度表達(dá)于炎癥損傷的組織或器官中的一種炎癥趨化因子,CXCR4是其特異性受體[20]。肝組織炎癥損傷形成了SDF-1α濃度梯度,CXCR4陽性的干細(xì)胞沿著此濃度梯度由外周血向損傷肝組織遷徙則為干細(xì)胞歸巢過程[21]。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞因子GCSF、EPO參與調(diào)控SDF-1/CXCR4軸活性[22-23],進(jìn)而誘導(dǎo)SCF、HGF等因子的表達(dá),促進(jìn)干細(xì)胞生長、遷徙并向肝細(xì)胞分化[24-25]。本次研究檢測了各組大鼠血清中GCSF、EPO、SCF及HGF的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMSCs移植聯(lián)合濟(jì)生腎氣湯組大鼠血清水平較模型組明顯升高,說明濟(jì)生腎氣湯具有調(diào)控干細(xì)胞增殖、遷徙相關(guān)因子,激活SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)BMSCs歸巢的潛能。再而通過檢測各組大鼠肝中干細(xì)胞歸巢相關(guān)蛋白SDF-1、CXCR4的表達(dá)及定位,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合濟(jì)生腎氣湯干預(yù)后可顯著提高肝內(nèi)兩種蛋白的表達(dá)量,說明其在BMSCs在植入體內(nèi)向損失部位遷徙并定植的過程中,對SDF-1/CXCR4軸起了調(diào)節(jié)作用。因此我們推測濟(jì)生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植治療肝硬化的機(jī)制為,濟(jì)生腎氣湯通過促進(jìn)植入的BMSCs在肝中定植并增殖,以及與其他細(xì)胞發(fā)生融合或直接分化為肝細(xì)胞以代替修復(fù)損失的肝組織,增強(qiáng)肝再生能力,恢復(fù)肝細(xì)胞功能。

綜上所述,本研究再次驗(yàn)證了SDF-1/CXCR4信號生物軸與干細(xì)胞遷徙并定植密切相關(guān),證明了濟(jì)生腎氣湯可以促進(jìn)GCSF、EPO、SCF、HGF等干細(xì)胞動(dòng)員因子分泌,激活SDF-1/CXCR4軸,提高受損肝組織募集干細(xì)胞的水平,修復(fù)受損肝,從而在肝硬化大鼠治療中發(fā)揮作用。