腎氣丸減輕糖尿病ZDF大鼠的腎損傷研究

劉雨夢李姝玉馮 婧車宇娥張曉鳳劉嘉鵬王 謙

(北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院,北京 100029)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease,DKD)是終末期腎病的主要病因之一,可見腎小球系膜基質(zhì)增多,基膜增厚,間質(zhì)纖維化等病變[1]。DKD的發(fā)病機制復雜,研究認為血流動力學改變、促炎因子、氧化應激反應以及遺傳因素等均與其發(fā)生發(fā)展有關(guān)[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的激活是引起DKD的機制之一,通過調(diào)節(jié)細胞ERS,可以改善腎組織病變[3]。

DKD在中醫(yī)學中屬于“消渴”“消腎”“虛勞”“關(guān)格”等范疇,中醫(yī)病機復雜,但其本虛標實各家已經(jīng)達成共識,腎氣丸作為《金匱要略》的代表方劑之一,有填精益髓、滋腎陰補腎陽的功效,對于陰陽兩虛的消渴有較好療效[4]。基于網(wǎng)絡藥理學和現(xiàn)代藥理學研究,腎氣丸成分復雜,相輔相成,存在58個活性靶點和107條信號通路與2型糖尿病直接相關(guān)[5],在這其中腎氣丸可能通過氧化應激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,自噬等通路來發(fā)揮治療作用。在我們以往的研究中也發(fā)現(xiàn)腎氣丸可以保護2型糖尿病小鼠的腎功能,降低GRP78、PERK等因子的表達,減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。因此本研究以糖尿病ZDF大鼠為模型,觀察在其病情進展過程中腎氣丸對其血糖及腎組織的影響并探討其作用機制,是否可能通過調(diào)節(jié)PERK通路緩解ERS,從而減輕糖尿病腎損傷。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性ZDF(fa/fa)大鼠和ZDF(fa/+)大鼠,其中ZDF(fa/fa)大鼠20只,體重400～420 g;ZDF(fa/+)大鼠7只,體重350～370 g;所有大鼠均為12周齡,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2021-0011]。動物飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所動物實驗平臺[SYXK(京)2016-0043],飼養(yǎng)環(huán)境為屏障內(nèi)獨立通風系統(tǒng),室溫23℃～25℃,相對濕度50%～60%,每日光照時間不超過12 h。飼養(yǎng)期間各組大鼠進食飲水不受限制,ZDF(fa/fa)大鼠是經(jīng)5C08優(yōu)質(zhì)嚙齒類飼料誘導4周建立糖尿病模型后改用普通飼料飼養(yǎng),ZDF(fa/+)大鼠一直用普通飼料飼養(yǎng)。5C08優(yōu)質(zhì)嚙齒類飼料進口登記證號:(2017)外飼準字354號,普通飼料由中日友好醫(yī)院臨床研究所動物實驗平臺提供。動物操作及取材在北京中醫(yī)藥大學實驗室進行[SYXK(京)2020-0033]。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學倫理委員會批準(BUCM-4-2021102801-4034),并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

根據(jù)2015年第一版《傷寒論方藥劑量與配伍比例研究》[6]得出實驗所需組方劑量為:熟地黃24 g、山藥12 g、山茱萸12 g、澤瀉9 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g、桂枝3 g、炮附子3 g。生藥購于北京同仁堂股份有限公司。制備腎氣丸水煎液,生藥蒸餾水浸泡2 h后,炮附子先煎30 min,剩余藥物一起煎煮1～1.5 h,待藥液降至室溫后濃縮并用無菌紗布過濾,過濾液分裝并于-20℃凍存。每只大鼠每日給藥量為8.12 g/kg,給藥濃度為0.812 g/mL,約為人用量的6倍。生理鹽水,規(guī)格:500 mL,由山東華魯制藥有限公司提供,批準文號:國藥準字H37022749,產(chǎn)品批號:H17100912。

血糖試紙(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司,批號24697833);改良Masson三色染色液,糖原PAS染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號分別為G1345、G1281);六胺銀染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司,批號DG0090);Magic SYBR Mixture(江蘇康為世紀生物科技股份有限公司,批號29120);mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,批號32220);TRIzol(北京索萊寶科技有限公司,批號16021);抗GRP78抗體(美國Proteintech公司,批號00098232);抗PERK、eIF2α、ATF4抗體(美國Cell Signaling Technology公司,批號分別為10,8,5);辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔II抗(北京柏奧易杰科技有限公司,批號80790602)。

血糖試紙型血糖測量儀(上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)RM2165切片機,光學顯微鏡(德國Leica公司);臺式冷凍離心機(美國Beckman公司);移液槍(0.1～1000 μL)(德國Eppendorf公司);Synergy Ⅱ型酶標儀(美國Bio-Tek公司);ME303E千分之一電子天平(上海梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司);熒光定量PCR儀(CFX96)、Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)、Bio-Rad濕法電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及給藥

實驗組別分為對照組、模型組與腎氣丸組3組。對照組選用7只12周齡ZDF(fa/+)大鼠;模型組與腎氣丸組選用20只同周齡雄性ZDF(fa/fa)大鼠。腎氣丸組每日灌服腎氣丸水煎液(8.12 g/kg),對照組和模型組每日灌服等量生理鹽水。

1.3.2 大鼠一般狀態(tài)的觀察

記錄每日觀察并記錄各組大鼠體重、毛光澤度、飲食飲水量、活動情況及給藥前后狀態(tài)等。

1.3.3 大鼠空腹血糖檢測

用尾尖取血法對12周齡和16周齡的各組大鼠進行空腹血糖檢測。取血前大鼠禁食8 h,不禁水,隨后用羅氏血糖儀及配套試紙檢測。

1.3.4 大鼠尿微量白蛋白檢測

于16周齡取材前收集各組大鼠24 h尿液,將尿液3500 r/min室溫離心10 min,取上清用ELISA試劑盒檢測各組大鼠尿微量白蛋白水平。

1.3.5 腎組織標本收集

各組大鼠飼養(yǎng)至16周齡,禁食8 h,不禁水,打開大鼠腹腔,暴露腎位置,取出完整腎并剝離被膜。一側(cè)腎置于含有預冷生理鹽水的培養(yǎng)皿上,將腎水平切開,切下腎組織浸入4%多聚甲醛中固定,隨后進行腎組織石蠟切片制作。另一側(cè)腎切分為小塊組織保存于-80℃冰箱中,用于后續(xù)Real-time PCR與Western blot檢測。

1.3.6 腎組織形態(tài)學染色

腎組織石蠟切片分別進行PAS、Masson和PAM-HE染色。切片脫蠟:石蠟切片浸泡于二甲苯兩次,各15 min;后依次置于100%、95%、80%、70%乙醇中各浸泡10 min,蒸餾水漂洗2次,各5 min。

PAS染色:切片脫蠟入水,滴加氧化劑,4℃冰箱避光靜置8 min,水洗,滴加Schiff Reagent染液,4℃冰箱避光染色10 min,水洗,滴加蘇木素染液,室溫避光靜置1 min,酸性分化液分化3 s,水洗后70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

Masson染色:切片脫蠟入水,滴染Bouin液10 min,輕緩沖洗至黃色消失,Mayer蘇木素染色液滴染1 min,酸性乙酸分化液分化5 s,麗春紅品紅染色液滴染8 min,滴加磷鉬酸溶液分色10 min,苯胺藍染色液滴染3 min,冰醋酸染液分化至切片無藍色脫出,70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

PAM-HE染色:切片脫蠟入水,滴加氧化劑15 min,鐵明礬染色,水洗,入六胺銀工作液60℃水浴染色25～30 min,沖洗,氯化金調(diào)色1 min,套染HE:蘇木素染色10 min,水洗,1%鹽酸乙醇分色液5 s,水洗,1%氨水返藍數(shù)秒,水洗,伊紅染色2 min,水洗后70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.3.7 Real-time PCR檢測大鼠腎組織中GRP78、PERK、eIF2α、ATF4 mRNA的表達水平

取100 mg凍存腎組織勻漿,加1 mL TRIzol試劑提取總RNA,按照HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix(CW 2020 M)進行逆轉(zhuǎn)錄操作。cDNA合成體系:RNA Template 10 μL,5×HiFiScript RTMaster Mix 4 μL,RNase-Free Water 6 μL。cDNA合成反應條件:37℃孵育15 min,85℃孵育5 s。逆轉(zhuǎn)錄反應結(jié)束測定cDNA濃度和濃度,PCR擴增GRP78、PERK、eIF2α、ATF4片段,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參,PCR反應條件:95℃ 30 s →95℃ 5 s,60℃ 30 s(40 cycles)→ 95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s,50℃ 30 s;記錄圖表中的Ct值結(jié)果,計算得出各個目的基因的表達比率,記錄數(shù)值。引物由上海生工生物工程股份有限公司代為合成,序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequence for Real-time PCR

1.3.8 Western blot檢測大鼠腎組織中GRP78、PERK、eIF2α、ATF4蛋白的表達水平

提取腎組織總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒對各組蛋白量進行測定,濃度測定后用Loading Buffer進行稀釋,最終上樣體積統(tǒng)一為10 μL。SDS-PAGE凝膠電泳,封閉1 h,按照說明書分別加入GRP78一抗(1∶5000),PERK一抗(1∶1000),eIF2α一抗(1∶2000),ATF4一抗(1∶2000),GAPDH一抗(1∶5000),4℃冰箱過夜,洗膜,加入HR標記山羊抗兔二抗(1∶10000),化學發(fā)光(ECL)法顯像曝光。運用Image J軟件分析各目的蛋白條帶灰度值,計算目的蛋白灰度值與內(nèi)參(GAPDH)灰度值的比值,比較各組腎組織中目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(±s)表示,組間均數(shù)根據(jù)數(shù)據(jù)正態(tài)分布與否與方差齊性結(jié)果,選擇單因素方差分析或非參數(shù)檢驗進行比較,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)

飼養(yǎng)過程中,見對照組大鼠體重增長正常,行動活躍,精神狀態(tài)良好,毛發(fā)光亮;模型組大鼠體重增長緩慢,精神萎靡,毛色發(fā)黃缺少光澤,飲水量和尿量均顯著增多而引起墊料潮濕并有較大異味。治療組相較模型組情況有明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠一般狀態(tài)Figure 1 General state of each group rats

2.2 空腹血糖和體重水平

12周齡、16周齡大鼠模型組與腎氣丸組空腹血糖均較對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);16周齡腎氣丸組空腹血糖相較模型組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。16周齡大鼠模型組體重增長緩慢,腎氣丸組較模型組體重增長恢復正常,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組大鼠空腹血糖和體重(±s)Note. Compared with control group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 2 Comparison of fasting blood glucose and weight of each group rats

表2 各組大鼠空腹血糖和體重(±s)Table 2 Fasting blood glucose and weight of each group rats

表2 各組大鼠空腹血糖和體重(±s)Table 2 Fasting blood glucose and weight of each group rats

注:與對照組相比, *P＜0.05;與模型組相比, #P＜0.05。Note. Compared with control group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.

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2.3 各組大鼠24 h尿微量白蛋白檢測結(jié)果

16周齡模型組和腎氣丸組的24 h尿微量白蛋白值均較對照組升高,但腎氣丸組較模型組明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3、圖3。

圖3 各組大鼠24 h尿微量白蛋白(±s,mg/mL)Note. Compared with control group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 3 Comparison of 24 h urinary microalbumin of each group rats

表3 各組大鼠24 h尿微量白蛋白(±s,mg/mL)Table 3 24 hour urinary microalbumin of each group rats

表3 各組大鼠24 h尿微量白蛋白(±s,mg/mL)Table 3 24 hour urinary microalbumin of each group rats

注:與對照組相比, *P＜0.05;與模型組相比, #P ＜0.05.Note. Compared with control group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.

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2.4 腎組織結(jié)構(gòu)觀察

PAS染色可見對照組腎小球結(jié)構(gòu)正常,基膜結(jié)構(gòu)薄而規(guī)則,系膜清晰。模型組腎小球毛細血管擴張,系膜區(qū)不規(guī)則增寬,腎小管上皮細胞胞漿疏松,有明顯糖原沉積;腎氣丸組上述情況均有所改善。Masson染色顯示對照組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常;模型組腎小球毛細血管擴張充血,系膜區(qū)有膠原沉積,腎間質(zhì)纖維化;腎氣丸組上述情況有所改善。PAM-HE染色可見對照組腎小球結(jié)構(gòu)清晰完整,形狀規(guī)則,基膜無增厚。模型組可見系膜區(qū)增寬,系膜基質(zhì)增多,基膜不規(guī)則增厚,部分小球有節(jié)段硬化,腎小管上皮細胞萎縮;腎氣丸組上述情況均有所改善。見圖4。

圖4 各組大鼠腎組織Note. Blue arrows, Glomerular pathological changes. Green arrows, Tubular and interstitial pathological changes.Figure 4 Kidney histopathology of each group rats

2.5 Real-time PCR檢測大鼠腎組織GRP78、PERK、eIF2α、ATF4 mRNA表達水平

結(jié)果顯示各目標基因的引物擴增狀態(tài)良好,引物特異性高,如圖5。

圖5 各目標基因引物擴增曲線Figure 5 Primer amplification curve of each target gene

16周齡模型組GRP78 mRNA表達顯著高于對照組,腎氣丸組顯著低于模型組(P＜0.05)。模型組PERK mRNA表達顯著高于對照組,腎氣丸組顯著低于較模型組明顯降低(P＜0.05)。模型組eIF2α mRNA表達顯著高于對照組,腎氣丸組較模型組明顯降低(P＜0.05)。模型組和腎氣丸組ATF4 mRNA表達無明顯差異(P＞0.05),兩組均顯著高于對照組(P＜0.05),這兩組之間無明顯差異(P＞0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠腎組織ERS相關(guān)因子mRNA表達Note. Compared with control group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 6 mRNA expression of ERS related factors in each group rats’ kidney

2.6 Western blot檢測大鼠腎組織GRP78、PERK、eIF2α和ATF4蛋白表達水平

結(jié)果顯示,16周齡時模型組大鼠腎組織GRP78、PERK、eIF2α和ATF4的蛋白表達均顯著高于對照組,腎氣丸組較模型組則顯著降低(P＜0.05)。見圖7。

圖7 各組大鼠腎組織ERS相關(guān)因子蛋白表達Note. Compared with control group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Figure 7 Protein expression of ERS related factors in each group rats’ kidney

3 討論

糖尿病是嚴重危害人類健康的重要疾病之一,DKD是其最主要的慢性并發(fā)癥之一。目前,在全球范圍,引起終末期腎臟疾病(end-stage renal disease,ESRD)發(fā)生的原因中,DKD占30%～50%;而在我國,引起中老年ESRD發(fā)生的首要病因是DKD[7-9]。DKD不僅對我國廣大居民的身體健康產(chǎn)生著嚴重危害,也為我國的經(jīng)濟發(fā)展帶來了嚴重影響。由此可見,積極尋求DKD新的治療方法和思路尤為重要。

張仲景《金匱要略·消渴小便不利淋病脈證并治篇》載:“男子消渴,小便反多,以飲一斗,小便一斗,腎氣丸主之。” 腎氣丸補腎之虛,溫腎之氣,對于治療本虛標實之消渴具有很好的效果。腎氣丸組方包括熟地黃、山藥、山茱萸、牡丹皮、茯苓、澤瀉、桂枝、炮附子,諸藥合用,共奏溫經(jīng)助陽、滋肝補腎的功效。基于臨床應用的觀察,腎氣丸治療DKD的療效顯著,可以改善患者形寒肢冷、大便泄瀉、腰酸耳鳴等癥狀,改善糖代謝,降低尿蛋白排泄率,延緩腎功能進行性損害[10]。

Zucker糖尿病肥胖大鼠(zucker diabetes fatty,ZDF)是一種新型的自發(fā)性2型糖尿病動物模型,廣泛應用于2型糖尿病及其并發(fā)癥的研究中[11]。我們在實驗中觀察到腎氣丸可以明顯改善糖尿病ZDF大鼠活動遲緩、毛色缺乏光澤、尿量增多等一般狀態(tài),并且降低大鼠空腹血糖水平。通過腎組織PAS、Masson和PAM-HE染色發(fā)現(xiàn)腎氣丸能夠減輕糖尿病ZDF大鼠部分腎小球毛細血管擴張充血狀態(tài),改善其腎小球基膜不規(guī)則增厚、系膜細胞增生等腎小球病變,減少腎間質(zhì)纖維組織增生和腎小管萎縮。

DKD作為糖尿病進展相關(guān)的緩慢進行性疾病,在腎功能改變上,多從微量白蛋白尿開始,隨后出現(xiàn)大量白蛋白尿和腎功能明顯下降,而其在腎活檢所觀察到的形態(tài)變化對于確診DKD有重要價值[9]。我們對16周齡ZDF大鼠24 h尿微量白蛋白檢測發(fā)現(xiàn),模型組尿微量白蛋白水平顯著高于對照組,提示ZDF大鼠出現(xiàn)明顯腎損傷,而灌服腎氣丸四周后,尿微量白蛋白水平明顯降低,結(jié)合我們觀察到腎氣丸對于大鼠體重、空腹血糖水平以及病理損傷都有所改善,可見腎氣丸對于減輕糖尿病ZDF大鼠腎損傷具有一定的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖代謝以及細胞鈣穩(wěn)態(tài)和信號轉(zhuǎn)導中起著關(guān)鍵作用,其功能紊亂和ERS發(fā)生與許多代謝性疾病有關(guān),包括糖尿病[12]。當發(fā)生ERS時,錯誤折疊或未折疊蛋白積聚,誘發(fā)分子伴侶蛋白糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated protein,GRP)78等表達量增高,調(diào)節(jié)蛋白合成來緩解應激狀態(tài)。所以它被用作檢測ERS發(fā)生的標志蛋白,GRP78表達增加即代表ERS發(fā)生[13]。研究表明2型糖尿病小鼠出現(xiàn)GRP78、ATF6等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志蛋白表達的增加,提示ERS可能參與糖尿病發(fā)生發(fā)展,且增強ERS可明顯加重腎組織的病理損害,加速病程進展,而中藥能夠通過緩解ERS發(fā)揮治療作用[14-16]。本課題組先前的實驗也證明2型糖尿病小鼠表現(xiàn)ERS增強,GRP78、PERK和eIF2α等相關(guān)因子表達的增加,中藥或其主要成分可通過下調(diào)相關(guān)因子表達,緩解ERS來發(fā)揮作用[17-18],所以我們進一步檢測了腎氣丸是否可能通過影響ERS的PERK-eIF2α-ATF4通路對糖尿病ZDF大鼠病情進展過程中發(fā)生的腎損傷起到干預作用。

此次實驗結(jié)果顯示模型組ZDF大鼠腎組織GRP78基因及蛋白表達均高于對照組,提示模型組大鼠發(fā)生ERS,而腎氣丸組大鼠腎組織ERS則得到緩解。有實驗表明2型糖尿病導致ERS過強時會引起PERK、ATF4表達增強,中藥可以下調(diào)相關(guān)蛋白表達量,抑制PERK通路[19],這與我們的結(jié)果相符。我們實驗檢測到模型大鼠腎組織PERK、eIF2α、ATF4的基因和蛋白表達均較對照組顯著增加,而腎氣丸組大鼠腎組織PERK、eIF2α、ATF4的蛋白表達水平均出現(xiàn)明顯下降,這表明腎氣丸可能通過抑制PERK-eIF2α-ATF4信號通路緩解糖尿病ZDF大鼠病情進展過程中所發(fā)生的ERS引起的損傷。

綜上所述,我們的實驗表明,腎氣丸可減輕在糖尿病ZDF大鼠出現(xiàn)的腎組織病理損傷,降低24 h尿微量白蛋白水平,在一定程度上保護了腎功能,其機制可能是通過影響ERS所介導的PERK通路。但是,在實驗中,我們僅觀察了腎氣丸影響下的腎組織不同光鏡染色方法下的形態(tài)變化,同時也看到PERK通路下游因子ATF4的基因水平變化不明顯。因此,后續(xù)實驗有必要進一步明確腎氣丸對糖尿病動物腎組織中不同種類細胞及細胞超微結(jié)構(gòu)的影響,明確其對PERK通路相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的影響,為腎氣丸在DKD治療過程中的早期應用提供實驗基礎(chǔ)。