玉朗傘查爾酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠NF-κB信號通路的影響

梁杏梅劉喜華#黃建春陳春霞陳兆霓黃仁彬*

(1.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院,藥學系, 南寧 530023;2.廣西醫(yī)科大學,藥學院, 南寧 530021;3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院,科研部, 南寧 530021)

缺血性心臟病的本質(zhì)是冠狀動脈血流供應(yīng)與心肌需求之間的失衡,是一種以缺血性損傷為主要特征的疾病,臨床上以胸悶痹痛、心悸氣短為主要癥狀,更有甚者會發(fā)展為心肌梗死[1]。缺血的心肌組織會伴隨有心功能降低、心肌細胞缺氧、心肌代謝過程紊亂、有害物質(zhì)聚集、誘發(fā)炎癥反應(yīng)并使得炎癥因子過度釋放等病理生理現(xiàn)象,因此,迅速恢復(fù)血液灌注是心肌缺血的基礎(chǔ)防治措施[2]。但不少研究證實了立即恢復(fù)正常供血,則缺血狀態(tài)得以扭轉(zhuǎn)但心肌功能及組織結(jié)構(gòu)已被嚴重破壞,更有甚者出現(xiàn)細胞凋亡和壞死,這種適得其反的現(xiàn)象即稱為心肌缺血再灌注損傷[3]。

當前,國內(nèi)外針對MI/RI進行干預(yù)的方法主要有缺血預(yù)適應(yīng)、藥物預(yù)適應(yīng)、藥物后處理、抵抗自由基損傷、減輕鈣超載、減輕炎癥反應(yīng)等。其中藥物干預(yù)通常選用抗血小板聚集、改善心肌細胞能量代謝、阻斷鈣離子通道的制劑等,雖產(chǎn)生一定作用,但其存在的針對性弱、療效低下、耐受性差等不足也使得其應(yīng)用受到了限制。另外,對于減輕炎癥反應(yīng)和減少炎癥因子釋放這條干預(yù)途徑的研究也不在少數(shù),尤其是對炎癥通路NIK/IκK/IκB/NF-κB的研究也取得了不少進展[4],眾多研究顯示了對該通路進行適當干預(yù)之后,能抑制下游核因子NF-κB的活性表達,使得炎性反應(yīng)得以改善、炎癥因子的過度釋放得以緩解,最終阻斷了心肌炎癥所介導(dǎo)的后續(xù)損傷,達到保護MI/RI的治療效果。

玉郎傘(YLS,Millettiapulchra(Benth.)Kurz var.Laxior(Dunn)Z.Wei(Papilionaceae))原植物經(jīng)考證為蝶形花科植物疏葉崖豆的塊根,主產(chǎn)地為廣西、福建、云南等,也是廣西民間常用的壯藥,在《廣西中藥材標準》《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準(第一卷)》中有收載,常用于保護心腦血管、預(yù)防老年癡呆、調(diào)節(jié)血糖水平及保肝護肝等[5]。本研究小組從玉朗傘總黃酮中分離出了玉朗傘查爾酮單體成分(YLSC,17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮),見圖1。在前期研究中,本小組發(fā)現(xiàn)YLSC在減輕心肌缺血、抑制氧自由基生成、減少心肌細胞凋亡、阻斷心肌細胞鈣離子通道、減輕鈣超載、保護離體心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷等方面具有顯著的保護作用[6-8],但YLSC對MI/RI保護的相關(guān)機制尚未明了,因此,本研究將對此進行探究,明確YLSC的保護機制是否與炎癥通路NIK/IκK/IκB/NF-κB有關(guān),實驗結(jié)果可為YLSC防治MI/RI找尋新的作用靶點和治療方案,具有較強的現(xiàn)實意義和應(yīng)用前景。

圖1 17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮的化學結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of 17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofura chalcone

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠60只,體重(265±15)g,雌雄各半,由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供[SCXK桂2020-0003],動物飼養(yǎng)在廣西醫(yī)科大學實驗動物中心[SYXK桂2020-0004],室溫控制在21℃～22℃,相對濕度控制在40%～70%,循環(huán)光照,飲水飲食自由取用。本研究通過廣西醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會的審批(201808009),按實驗動物使用的“3R”原則給予人道主義關(guān)懷,切實遵循和保障實驗動物倫理。

1.2 主要試劑與儀器

1.3 實驗方法

1.3.1 MI/RI模型的制備

SD大鼠隨機分為6組(n=10):假手術(shù)組(sham group,給予蒸餾水2 mL/kg)、模型組(model group,給予蒸餾水2 mL/kg)、陽性對照組(PDTC group,給予PDTC 30 mg/kg)、YLSCH組(5.00 mg/kg)、YLSCM組(2.50 mg/kg)、YLSCL組(1.25 mg/kg)。各組大鼠經(jīng)鼠尾靜脈連續(xù)給與相應(yīng)藥物7 d,每天1次,于末次給藥后除假手術(shù)組外均制備MI/RI模型,即結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支30 min后,再灌注60 min。

各組大鼠以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(1.5 mL/kg),取仰臥位固定。氣管倒T型切開后,連接到動物呼吸機(相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下,respiratory rate:60～70 times/min,tidal volume:50 mL/kg,inspiration and expiration ratio:1∶2)。左側(cè)胸腔消毒后逐層打開,擴張第3與第4肋間隙,在淚囊掀開器的助力下讓心臟充分暴露于視野中,切開心包輕輕擠壓胸廓使心臟擠出,可見冠脈左前降支起始部位藏于左心耳下緣與肺動脈圓錐左緣間,用6/0無損傷縫合線繞過平冠脈左前降支起始部位下緣約2 mm處(進針深度約1 mm,寬度約1～2 mm),連同空心硅膠管一并結(jié)扎。假手術(shù)組大鼠僅做穿線處理,不予結(jié)扎。待心肌缺血30 min后可將空心硅膠管剪開,即可解除結(jié)扎并恢復(fù)灌流狀態(tài),繼續(xù)觀察1 h。

1.3.2 心肌梗死面積的測定

再灌注1 h后,各組大鼠由左心室導(dǎo)管逆行注入1.5 mL伊文思藍(濃度為5%),在心肌正常組織被充分染色后,剪下心臟平行于左心室長軸制作厚度為1～2 mm的薄片[9]。將心室薄片放入1% TTC磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中水浴15 min,由于受損心肌的細胞膜損傷導(dǎo)致細胞中的脫氫酶釋放漏出而丟失,故梗死心肌組織不被染色。心室薄片的染色結(jié)果使用Image J圖像分析軟件進行分析統(tǒng)計。白色即未被染色的部分為梗死心肌,染成藍色的部分為殘存的正常心肌組織,染成紅色的部分為缺血心肌組織。紅色的缺血組織與白色的梗死組織一并稱為缺血區(qū)(area at risk,AAR),其中白色的梗死組織又稱為梗死區(qū)(area of necrosis,AN)。計算公式:缺血范圍=AAR/心室橫截面積,梗死范圍=AN/AAR。

1.3.3 血清中CK、CK-MB及 Hyp水平的測定

再灌注60 min后,各組大鼠腹主動脈真空采血約5 mL,靜置2 h后行高速冷凍離心(參數(shù)設(shè)置為:轉(zhuǎn)速4000 r/min,離心時長10 min,離心溫度4℃),取上層血清于-20℃環(huán)境下凍存。按說明書標準操作步驟分別測定血清CK、CK-MB及 Hyp水平。

1.3.4 免疫組化法測定NIK/IκK/IκB/NF-κB通路蛋白

水處理綜合實驗是上海理工大學環(huán)境工程專業(yè)本科課程,是獲得學士學位的必修課。其先修課程是環(huán)境工程原理和水污染控制工程。課程每學年開設(shè)一次,安排在第5個短學期。在2014年下半學期之前,水處理綜合實驗基本采用演示性(“傳統(tǒng)”)實驗,即提供實驗理論和程序的講義給學生;實驗小組進行實驗,每人根據(jù)每次實驗的結(jié)果,單獨寫一份實驗報告并提交。整個學期至少進行5次實驗。傳統(tǒng)實驗主要集中在水污染控制工程為基礎(chǔ)的各處理單元(例如,混凝/絮凝、沉淀、吸附、氧化、生物處理)。通常第一次課安排的是實驗室安全討論課,而且在學期內(nèi)有專業(yè)認識實習,安排兩次污水處理廠的現(xiàn)場考察。

再灌注結(jié)束后,取各組大鼠缺血心肌組織制作切片,切片經(jīng)二甲苯、無水乙醇、水進行梯度脫蠟,行抗原修復(fù)、3%過氧化氫甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性、PBS沖洗、血清封閉、添加抗體等操作進行封片。電子顯微鏡下觀察切片,被染成棕黃色至深褐色的細胞核與細胞漿即為陽性蛋白。每只動物取3張切片,每張切片隨機選取5個視野,對陽性著色區(qū)域進行觀察分析,切片經(jīng)Leica Qwin圖象分析軟件對大鼠心肌組織切片中NIK、IκK、IκB以及NF-κB的蛋白陽性表達情況進行半定量統(tǒng)計,結(jié)果以灰度值表示,數(shù)值范圍在0～255之間,灰度值越低,則蛋白的陽性表達越高[10]。

1.3.5 Western blot法 測 定NIK/IκK/IκB/NF-κB通路蛋白

再灌注結(jié)束后,取各組大鼠約80 mg缺血心肌組織加入蛋白裂解液,制作組織勻漿并測定蛋白含量。蛋白經(jīng)過上樣、電泳、分離、PVDF(聚偏氟乙烯,Polyvinylidene Fluoride)膜轉(zhuǎn)移后,將PVDF膜依次轉(zhuǎn)入一抗(NIK、IκK、IκB、NF-κB)工作液及二抗工作液中進行孵育。將PVDF膜放入顯色液中顯色,觀察顯色反應(yīng)過程,行漂洗、拍照,用Image J軟件分析各條帶的蛋白表達,相關(guān)數(shù)值用光密度(optical density,OD)值表示,計算公式為,目的蛋白的相對表達含量=目的蛋白OD值/內(nèi)參(β-actin)OD值,比值越高,則提示目的蛋白的表達越高。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析,免疫組化及Western blot圖像半定量數(shù)據(jù)使用Leica Qwin圖象分析軟件及Image J軟件進行分析,計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用ANOVA單因素方差分析,當P＜0.05時則表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 YLSC對MI/RI大鼠心梗面積的影響

未觀察到假手術(shù)組有梗死心肌,可觀察到有略微的缺血組織,可能與打開大鼠胸腔且縫合針和縫合線繞過冠脈左前降支造成輕微缺血有關(guān)。與模型組比較,各組心肌組織缺血程度基本一致,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),提示結(jié)扎冠脈左前降支的手術(shù)操作平行性較好。與空白組比較,模型組與各給藥組大鼠的心肌缺血范圍擴大較明顯(P＜0.05),提示缺血模型制備成功。與模型組比較,陽性對照組、YLSCH組和YLSCM組大鼠心肌梗死面積呈不同程度的減少(P＜0.01),YLSCL組大鼠心梗面積減少不明顯(P＞0.05),提示YLSC能顯著縮小MI/RI大鼠的心肌梗死范圍。結(jié)果見表1和圖2。

圖2 YLSC對MI/RI大鼠心肌缺血范圍和梗死范圍的影響Figure 2 Effect of YLSC on myocardial risk area and infarction area in MI/RI rat

表1 YLSC對MI/RI大鼠心肌缺血范圍和梗死范圍的影響(±s)Table 1 Effect of YLSC on myocardial risk area and infarction area in MI/RI rat

表1 YLSC對MI/RI大鼠心肌缺血范圍和梗死范圍的影響(±s)Table 1 Effect of YLSC on myocardial risk area and infarction area in MI/RI rat

注:與假手術(shù)組比較, *P＜0.05;與模型組比較, ##P＜0.01。Note. Compared with the sham group, *P＜0.05. Compared with the model group, ##P＜0.01.

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2.2 YLSC對MI/RI大鼠血清CK、CK-MB及Hyp水平的影響

與假手術(shù)組比較,模型組及各給藥組中的CK、CK-MB及Hyp水平顯著增高(P＜0.05),心肌酶活性增強、心肌膠原組織破壞,提示模型制備成功;與模型組比較,YLSC可以降低MI/RI所致的CK、CKMB及Hyp水平的升高(P＜0.05或P＜0.01),且呈劑量依賴關(guān)系;YLSCL組大鼠的Hyp水平下降不明顯,差距無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。提示YLSC對MI/RI大鼠心肌組織具有保護作用,能減少心肌膠原組織的破壞,減少心肌細胞損傷時心肌標志物CK和CK-MB的滲出。結(jié)果見表2。

表2 YLSC對MI/RI大鼠血清CK、CK-MB及Hyp水平的影響(±s)Table 2 Effect of YLSC on level of CK, CK-MB and Hyp in MI/RI rat

表2 YLSC對MI/RI大鼠血清CK、CK-MB及Hyp水平的影響(±s)Table 2 Effect of YLSC on level of CK, CK-MB and Hyp in MI/RI rat

注:與假手術(shù)組比較, *P＜0.05;與模型組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the sham group, *P＜0.05. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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2.3 免疫組化法測定NIK/IκK/IκB/NF-κB通路蛋白

由免疫組化結(jié)果可知,被染為黃色及棕黃色的細胞漿及細胞核為NIK、IκK、IκB及NF-κB蛋白的陽性表達。與假手術(shù)組比較,模型組和各給藥組的IκB蛋白的陽性表達范圍明顯減少,而NIK、IκK及NF-κB陽性表達范圍則明顯增多。與模型組相比,YLSC能下調(diào)NIK、IκK及NF-κB的酶活性,抑制其蛋白表達的升高,同時減少IκB的降解,且呈劑量依賴關(guān)系(P＜0.05或P＜0.01)。說明YLSC對MI/RI大鼠具有保護作用,能減少NIK、IκK及NF-κB蛋白的表達,降低NIK和IκK的酶活性,能減慢IκB的降解并使其表達增多。結(jié)果見表3和圖3。

圖3 YLSC對MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影響Figure 3 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat

表3 YLSC對MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影響(±s,灰度值)Table 3 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat(gray value)

表3 YLSC對MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影響(±s,灰度值)Table 3 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat(gray value)

注:與假手術(shù)組比較, *P＜0.05;與模型組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the sham group, *P＜0.05. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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2.4 Western blot法測定NIK/IκK/IκB/NF-κB通路蛋白

實驗結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,各實驗組NIK、IκK及NF-κB的酶活性被激活,陽性表達增多(P＜0.05),反之IκB的陽性表達則減少(P＜0.05)。與模型組比較,YLSC各劑量能不同程度地抑制NIK、IκK及NF-κB的 陽 性 表達(P＜0.05或P＜0.01),且減少IκB的降解,增加IκB的陽性表達(P＜0.05或P＜0.01),呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果表明,YLSC對MI/RI大鼠具有保護作用,其能通過調(diào)控NIK/IκK/IκB/NF-κB信號通路中相關(guān)酶的活性來阻斷后續(xù)損傷。結(jié)果見表4和圖4。

圖4 YLSC對MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影響Figure 4 Effect of YLSC on protein expression level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat

表4 YLSC對MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影響(±s)Table 4 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat

表4 YLSC對MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB蛋白水平的影響(±s)Table 4 Effect of YLSC on level of NIK/IκK/IκB/NF-κB in MI/RI rat

注:與假手術(shù)組比較, *P＜0.05;與模型組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01。Note. Compared with the sham group, *P＜0.05. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

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3 討論

NIK是IκK的上游激酶,其能通過級聯(lián)反應(yīng)引起IκK的活化,IκK的活化繼而使得IκB發(fā)生磷酸化,磷酸化后的IκB被蛋白酶體識別繼而解體,即解除了NF-κB-IκB復(fù)合物的聚集,復(fù)合物的解體使得NF-κB恢復(fù)了游離和活性狀態(tài),同時也讓NF-κB的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域處于裸露狀態(tài),則NF-κB將與細胞核內(nèi)相關(guān)基因激活區(qū)接軌,啟動轉(zhuǎn)錄多種免疫因子[11]。由此得出,若是IκB的降解過程受到阻斷或干擾,將會造成NF-κB-IκB復(fù)合物的解體失敗,則NF-κB無法暴露核定位序列,其誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和炎癥因子的釋放也將無法激活。付海榮等[12]發(fā)現(xiàn),MI/RI大鼠心肌組織中NF-κB表達升高,反之IκB蛋白表達卻呈下降趨勢,陽性對照藥復(fù)方丹參片及受試藥能逆轉(zhuǎn)該勢態(tài);同時鄧紅等[13]也發(fā)現(xiàn)在肺缺血再灌注損傷大鼠模型中,肺臟組織中的NF-κB被激活,蛋白表達顯著上調(diào);在Yu等[14]的研究中也發(fā)現(xiàn)了,慢性心衰患者在給予中藥參附湯干預(yù)之后,能阻斷NF-κB通路的酶活性并抑制促炎因子的釋放,改善心功能的同時有效減緩了心力衰竭患者的病理進程;周玥等[15]的研究發(fā)現(xiàn),吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)作為NF-κB的專屬性抑制劑,其能有效阻斷NF-κB信號傳導(dǎo)通路的活化,下調(diào)心肌組織中NF-κB的酶活性,且能減輕炎癥介質(zhì)的釋放;楊敏華等[16]研究發(fā)現(xiàn),在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠模型中,使用核因子特異性抑制劑PDTC進行干預(yù),能改善膿毒癥大鼠心臟、肺病理損傷程度和炎癥反應(yīng)。可見,尋找對NIK/IκK/IκB/NF-κB信號通路具有針對性調(diào)控作用的靶點藥物,也成為了MI/RI疾病治療研究的急切任務(wù)。

該項實驗結(jié)果也與上述研究相呼應(yīng),MI/RI大鼠NIK/IκK/IκB/NF-κB通路被激活,各類激酶活性增強、IκB降解增多、NF-κB得以激活,提示MI/RI大鼠心肌組織損傷與該條通路的表達上調(diào)密切相關(guān),受試藥YLSC則是通過抑制該通路的各激酶活性、減少復(fù)合物的解體、阻止核因子核定位序列的暴露阻斷了該通路介導(dǎo)的下游炎癥反應(yīng)。近年來大量的研究證實了,NF-κB家族作為一種聯(lián)通各類免疫、炎癥、增殖、分化、凋亡、氧化應(yīng)激的重要通路,參與了多種病理生理過程,其同時也存在于心肌細胞中介導(dǎo)缺血性心肌病、心肌炎、心肌細胞凋亡及壞死等,而有效的對抗該條通路即能為MI/RI的防治開辟更多防治路徑[17]。

另外,實驗表明,尾靜脈注射YLSC給藥預(yù)處理可明顯縮小MI/RI大鼠的心肌梗死范圍。急性MI/RI時患者的心肌梗死范圍對預(yù)后有著很大的影響,且患者的心梗并發(fā)癥及病死率也與心梗面積的大小密切相關(guān)[18]。據(jù)研究表明,當缺血性心肌病發(fā)生后,其衰減的心功能預(yù)后好壞受梗死面積影響,心肌梗死面積越小則預(yù)后越好,因而縮小心梗面積可作為抗心肌缺血藥物的主要療效指標[19],而該項研究的實驗結(jié)果也印證以上結(jié)論。此外,當心肌細胞受損后,相應(yīng)的心肌酶如CK、CK-MB等會隨著細胞膜的破壞而漏出到細胞外,并進入到血流中,故檢測血中心肌酶活性可反映心肌受損程度[20],給與YLSC預(yù)處理能減少CK和CK-MB的活性,減少心肌酶的漏出,改善心肌受損程度;Hyp是膠原組織的主要成分之一,當體內(nèi)結(jié)締組織大量增生或破壞時,其在血、尿中的含量會顯著增加,因此通過對血液和尿液中羥脯氨酸的測定,可了解體內(nèi)組織膠原蛋白分解代謝情況[21],給與YLSC預(yù)處理能減少MI/RI大鼠血中Hyp含量,提示YLSC能減少心肌組織的膠原代謝、減輕心肌組織的損傷和心肌細胞的壞死分解。

綜上所述,YLSC對MI/RI大鼠受損心肌具有保護作用,其能減少MI/RI大鼠心梗面積,減少血中CK、CK-MB和Hyp水平,調(diào)控NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白的表達,實驗結(jié)果可為后續(xù)研究YLSC治療MI/RI提供基礎(chǔ),也為YLSC進一步的探索開發(fā)提供科學依據(jù)。