FAH/GSTZ1雙基因突變肝細胞模型的建立

劉 艷顧 鵬葉 行梁春錦關雅今張映輝鄒慶劍*顧為望*

(1.五邑大學生物科技與大健康學院,廣東 江門 529020;2.江門市大健康國際創新研究院,廣東 江門 592040;3.華南生物醫藥大動物模型研究院,廣東省醫學大動物模型重點實驗室,廣東 江門 529728;4.南方醫科大學實驗動物管理中心暨比較醫學研究所,廣州 510515)

人延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumaroylacetoacetate hydrolase,FAH)位于染色體15q25.1,主要在肝和腎中表達,是酪氨酸代謝通路最后一步的酶[1]。FAH缺失會導致其上游中間代謝產物在肝細胞中積累,并通過旁代謝通路轉化為琥珀酰乙酰乙酸(succinylacetoacetate,SAA)和琥珀酰丙酮(succinylacetone,SA)[2]。這兩種代謝產物與其它蛋白的巰基結合,影響其功能,最終造成肝、腎損傷,形成I型遺傳性酪氨酸血癥(HT1)[3],大多數HT1患者在嬰兒早期就會死于急性嚴重的肝腎功能衰竭[4]。HT1目前的治療方法主要通過飲食、藥物或肝移植治療控制疾病,降低血酪氨酸及其代謝產物水平,減輕酪氨酸及其代謝產物對機體的損傷,目前沒有簡便且有效的治愈方法。

肝中的谷胱甘肽S-轉移酶-Z1(glutathione Stransferase zeta 1,GSTZ1)是酪氨酸代謝通路的倒數第二個酶,屬于谷胱甘肽硫轉移酶(GST)超家族新成員。催化馬來酰乙酰乙酸酯(maleylacetoacetate,MAA)異構化為延胡索酰乙酰乙酸(fumarylacetoacetate,FAA)[5]。作為GST家族的一員,GSTZ1還能催化二氯乙酸鹽(dichloroacetate,DCA)氧化生成乙醛酸,并可能參與外源α-鹵酸代謝[6-7]。人GSTZ1基 因 定 位 于 人 類 染 色 體14q24.3,長度為10.9 kb[8],主要在肝中表達,編碼216個氨基酸組成,分子量在24×103左右[9]。研究發現GSTZ1在肝細胞癌(HCC)中顯著下調[10],提示GSTZ1的表達降低可能導致了細胞的活性增強,但具體機制未知。

HT1主要病因是FAH的功能缺失,酪氨酸代謝通路中其它酶的作用需要進一步了解。通過基因編輯分析各個基因對該疾病的影響,可以更好地了解該疾病的具體發病機制。然而,受到倫理道德的限制,很多研究無法直接在人體中進行,必須首先通過細胞以及動物實驗對疾病做相應的研究論證。本研究擬通過建立FAH/GSTZ1雙突變肝細胞模型,研究GSTZ1的敲除對FAH缺失所導致的肝損傷是否具有影響,進一步研究兩個基因在肝損傷中的作用,以及探索新的HT1肝損傷治療方案。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系

人正常肝細胞系LO2來自南方醫科大學實驗室,人胚腎細胞HEK293T、感受態細胞DH5α由本實驗室保存。

1.1.2 載體質粒

LentiCRISPR V2和PX458載 體 均 購 自Addgene。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養基(Gibco;C11995500BT)、胎牛血 清(Gibco;10270106)、Opti-MEM?(Gibco;1119701)、0.25%胰酶(Gibco;25200056);無血清細胞凍存液(新賽美生物科技有限公司;C40100);轉染試劑lipofectamine 2000(Invitrogen;2004957);嘌呤霉素無菌溶液(Meilunbio;MA0318);全蛋白提取試劑盒(凱基生物;KGP250);蛋白BCA定量試劑盒(Biosharp;BL521A)、ECL化 學 發 光 試 劑 盒(Biosharp;BL520A);PVDF膜(Millipore;TPVH00011);GSTZ1單克隆抗體(Proteintech;14889-1-AP);FAH抗體(K004637P)、GAPDH抗體(K200057 M)、二抗羊抗兔(SE134)和二抗羊抗小鼠(SE131)、CCK8試劑(CA1210)、1%結晶紫染液(G1062)均購自Solarbio;T4 PNK磷酸酶(M0201 S)、BsmBI(R0580 L)和BbsI(00397116)限制性內切酶均購自NEB;T4DNA連接酶(TaKaRa;M0202 S);EdU檢測劑盒(BBI;E607204-0100);基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN;DP304);無內毒素質粒大提試劑盒(TIANGEN;DP117-TA)。

細胞培養皿、Transwell小室、離心管、細胞凍存管(Corning);CO2細胞培養箱、生物安全柜和NanoDrop 2000(Thermo Scientific);PCR擴增儀、電泳儀、凝膠自動成像儀、熒光定量PCR儀(Bio-Rad);超純水儀(ELGA);低速離心機(Eppendorf);旋渦振蕩器(QILINBEIER);倒置熒光顯微鏡(Nikon)。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因敲除載體構建

(1)GSTZ1位點基因編輯質粒的構建

通過GeneBank網站(https://www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找人的GSTZ1基因組序列。在人GSTZ1基因第6號外顯子(E6)上找到N20NGG的靶向序列,合成相應的兩條互補的單鏈引物(表1),退火形成雙鏈DNA片段。LentiCRISPR V2載體用BsmBI酶切,回收后與雙鏈DNA片段在T4 DNA連接酶作用下,16℃進行連接反應。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態后涂板,利用無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒DNA,并送測序分析。測序正確的質粒稱為LentiCRISPR-V2-sgRNAGSTZ1,將用于細胞轉染。

(2)FAH位點基因編輯質粒的構建

在GeneBank網站查找人的FAH基因組序列。在人FAH基因第7、8號外顯子(E7、E8)上找到兩個N20NGG的靶向序列,合成相應的兩條互補的單鏈引物(表1),退火形成雙鏈DNA片段。PX458載體用BbsI酶切,回收后與雙鏈DNA片段在T4 DNA連接酶作用下,16℃進行連接反應。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態后涂板,利用無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒DNA,并送測序分析,將序列正確的質粒(PX458-sgRNAFAH)用于細胞轉染。

表1 基因編輯引導RNA引物Table 1 Design of primers for guide RNA construction

1.3.2GSTZ1基因敲除細胞的構建

(1)慢病毒包裝

HEK293 T細胞培養基為10%胎牛血清的DMEM高糖培養基,培養條件為37℃、5% CO2。轉染前1 d鋪60%匯合度的HEK293 T細胞于60 mm培養皿中,24 h后進行轉染,轉染試劑為脂質體lipofectamine 2000,將LentiCRISPR-V2-sgRNAGSTZ1與包裝質粒pMD2.G、pSPAX2按照質量比4∶1∶3的比例混合后轉染HEK293 T細胞,8 h后換成新鮮培養基培養,于48、72 h后分別收集培養基上清液,3000 r/min離心5 min去除細胞碎片,0.45 μm濾膜過濾,并將病毒上清液分裝為每管1 mL,-80℃冰箱保存備用。

(2)慢病毒感染LO2細胞

LO2細胞培養基為10%胎牛血清的DMEM高糖培養基,培養條件為37℃、5% CO2。慢病毒感染前1 d鋪40%匯合度的LO2細胞于6孔板,12 h后加入1 mL的慢病毒上清液感染LO2細胞。

(3)摸索嘌呤霉素殺傷LO2細胞的最適工作濃度

將40%匯合度的LO2細胞鋪于6孔板中,12 h后加入不同濃度梯度的嘌呤霉素(0、0.1、1、4.5 μg/mL)至細胞培養基中。48 h后觀察細胞存活情況,選取細胞全部死亡的最低濃度為后續篩選的工作濃度。

1.3.3 篩選GSTZ1敲除細胞株

慢病毒感染LO2細胞2 d后,加含嘌呤霉素的培養基篩選。待對照組LO2細胞全部被殺死后,將感染慢病毒的LO2細胞用胰酶消化,利用有限稀釋法將細胞稀釋成每毫升100個細胞,取10 μL加入96孔板中繼續培養。1周后待單個細胞長成細胞團后,消化傳代繼續擴增培養。取單克隆細胞株部分細胞提取基因組DNA,利用鑒定引物(表2)進行PCR擴增并測序分析。將具有目標基因突變的細胞株進行擴大培養和凍存保存。

1.3.4FAH基因敲除細胞株的篩選

將構建好的PX458-sgRNAFAH共轉染進野生型(wild type, WT)LO2細胞和GSTZ1敲除的LO2細胞,轉染試劑為lipofectamine 2000,轉染過程按照說明書操作。轉染12 h后,換成10%胎牛血清的DMEM高糖培養基繼續培養。48 h后,用胰酶消化,利用有限稀釋法將細胞稀釋成每毫升100個細胞,取10 μL加入96孔板中繼續培養。一周后待單個細胞長成細胞團后,消化傳代繼續擴增培養。取單克隆細胞株部分細胞提取基因組DNA,利用鑒定引物(表2)進行PCR擴增并測序分析。將具有目標基因突變的細胞株進行擴大培養和凍存保存。

表2 基因編輯鑒定引物Table 2 Primers for gene editing identification

1.3.5 敲除細胞株功能學實驗

(1)Western blot檢測GSTZ1、FAH蛋白表達情況

收集細胞后,利用全蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白,取10 μL進行凝膠電泳。SDS-PAGE分離膠和濃縮膠分別按照濃度為10%和5%配制,電壓為恒壓80 V,30 min;120 V,40 min。再電轉入PVDF膜,電流200 mA,120 min。5% BSA封閉2 h,GSTZ1、FAH的抗體以及GAPDH內參抗體作為一抗分別4℃孵育過夜。用TBST室溫搖床洗膜4次,加入二抗后室溫孵育1 h。最后加入ECL顯色后,觀察拍照。

(2)CCK8檢測細胞增殖

將GSTZ1、FAH敲除細胞及親本對照組細胞胰酶消化后計數,以每孔1×104密度鋪至96孔板中,每個樣品6個重復。同時以全培為空白對照,分別在0、6、12、24和48 h加入10 μL CCK8溶液,37℃避光孵育4 h。用酶標儀測定450 nm處的吸光度,用細胞的吸光度扣除空白對照的吸光度,得到相對吸光度值,并進行統計學分析。

(3)克隆形成實驗檢測細胞增殖

將GSTZ1、FAH敲除細胞及親本對照組細胞胰酶消化后計數,以每孔1×103密度鋪至6孔板中,正常培養14 d。待細胞長至肉眼可見的細胞克隆時,去除培養基,采用PBS輕柔清洗細胞兩次后用4%多聚甲醛固定細胞15 min。然后棄去多聚甲醛,用清水清洗細胞表面,晾干后用1%結晶紫染色10 min。最后用清水洗凈染液,于體視顯微鏡下計數。

(4)劃痕實驗檢測細胞遷移

將GSTZ1、FAH敲除細胞及親本對照組細胞胰酶消化后計數,以每孔5×104密度鋪置6孔板中。待細胞長滿后,使用200 μL槍頭劃痕細胞,洗去細胞碎片,換成2%胎牛血清的新鮮培養基繼續培養。間隔72 h后再次拍照,計算細胞相對遷移距離比(0 h距離-72 h距離)/0 h距離。

(5)EdU分析

將GSTZ1、FAH敲除細胞及親本對照組細胞使用EdU細胞增殖試劑盒評估其增殖能力。將60%匯合度細胞鋪至24孔板中,12 h后換成1×EdU標記培養基繼續孵育細胞2 h,采用PBS輕柔清洗細胞兩次后用4%多聚甲醛固定細胞15 min,棄去多聚甲醛,利用PBS清洗細胞兩次。按照說明書將1×反應緩沖液、催化劑溶液、TAMRA紅色熒光溶液和緩沖添加劑按照一定比例配制成檢測混合液,將其加入細胞中并室溫避光孵育30 min,利用PBS清洗細胞。檢測前,用PBS將Hoechst稀釋成1×染色液,室溫避光孵育30 min,用熒光顯微鏡拍照觀察。

1.4 統計學方法

用Graphpad prism 8.0進行數據處理以及統計學分析,結果以平均數±標準差(±s)表示。組間比較采用t檢驗,P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 LO2細胞篩選條件測試

LO2細胞為正常人源肝細胞,目前還沒有文獻對其進行嘌呤霉素敏感性實驗。我們在正常培養的LO2細胞培養基中設置了4組不同濃度梯度的嘌呤霉素,發現最高濃度4.5 μg/mL嘌呤霉素可在48 h殺死全部野生型LO2細胞(圖1)。因此在后續實驗中,篩選基因編輯細胞系均采用終濃度4.5 μg/mL的嘌呤霉素。

圖1 LO2細胞對puromycin藥物濃度的耐受測試Figure 1 Sensitivity of LO2 cells to puromycin

2.2 細胞敲除模型的構建

2.2.1GSTZ1基因敲除細胞株的構建

LO2細胞的GSTZ1基因敲除位點設計在基因的第6號外顯子(圖2A)。LentiCRISPR V2-sgRNAGSTZ1構建成功,并包裝獲得慢病毒顆粒,進而感染LO2細胞,獲得10株細胞克隆。基因組PCR和測序顯示除了野生型序列外,共有6種突變形式,從缺失1～35 bp不等(圖2B)。其中克隆#6在gRNA靶位點刪除了5 bp,導致移碼突變,提前形成終止密碼TAA(圖2C),將會導致表達出截短的無功能的GSTZ1蛋白。將這個細胞克隆株進行擴大培養,作為后續實驗使用。

2.2.2FAH基因敲除細胞株的構建

進一步在FAH基因的第7和第8外顯子分別設計兩個基因編輯靶位點。將兩個基因編輯質粒共轉染到野生型LO2細胞和GSTZ1突變的LO2細胞中。通過有限稀釋法篩選,分別獲得了6株細胞克隆,PCR和測序結果顯示主要有7種突變形式,包括大片段刪除(如刪除159 bp和163 bp),以及單位點或雙位點基因編輯(圖2D)。野生型和GSTZ1突變的LO2細胞通過編輯都分別在FAH基因位點獲得了159 bp大片段刪除的細胞克隆(圖2E)。將這兩株細胞分別擴大培養,進行進一步鑒定實驗。

圖2 人GSTZ1和FAH雙基因敲除LO2細胞株的建立Note. A, Schematic diagram of the design at human GSTZ1 gene locus. B, Genotype analysis of GSTZ1 knockout cell clones. C, Sequencing analysis at gene targeting sites in wild-type and gene-target cells. D, Schematic diagram of gene targeting site design at human FAH gene locus. E, Genotype analysis of FAH knockout cell clones.Figure 2 Establishment of LO2 cell line with human GSTZ1 and FAH dual-gene knockout

2.3 基因編輯LO2細胞株GSTZ1與FAH蛋白表達

首先對GSTZ1基因敲除細胞進行Western blot檢測,發現與野生型對照組比較,GSTZ1基因敲除后,相應的蛋白無法檢出(圖3A)。隨后檢測野生型、單個基因敲除和雙基因敲除細胞的FAH蛋白,發現FAH基因敲除后,細胞內源FAH蛋白不再表達(圖3B)。結果說明通過基因編輯手段可以將LO2細胞中的GSTZ1和FAH基因進行單獨和雙敲除,實現相應蛋白的徹底失活。

圖3 蛋白水平檢測GSTZ1和FAH的表達Note. A, GSTZ1 protein detected by Western blot. B, FAH protein detected by Western blot.Figure 3 GSTZ1 and FAH protein test by Western blot assay

2.4 GSTZ1、FAH敲除對LO2細胞增殖能力的影響

CCK8細胞增殖實驗顯示GSTZ1、FAH基因敲除會顯著的增加肝細胞的增殖速率(圖4A)。進一步,我們利用克隆形成實驗檢測,同樣發現敲除GSTZ1、FAH基因后,肝細胞克隆形成能力也明顯增加(圖4B～4C)。另外,我們還通過EdU染色實驗再次證實GSTZ1、FAH基因敲除均顯著增加LO2細胞的增殖能力(圖4D～4E)。

圖4 GSTZ1和FAH基因敲除對LO2細胞增殖能力的影響Note. A, Proliferation rates were evaluated via CCK8 trial. B, Colony formation was determined by crystal violet staining. C, Ability of clone formation was investigated by clone formation assay. D, EdU assay for different cell lines. E, percentage of EdU positive cells.Compared with WT, **P＜0.01,***P＜0.001, ****P＜0.0001.Figure 4 Effect of GSTZ1 and FAH gene knockout on the proliferation of LO2 cells

3個獨立的測試方式均顯示GSTZ1基因的敲除可大幅提高肝細胞LO2的增殖活性。FAH基因的敲除也能顯著提高LO2細胞的活力,但提高幅度大大低于GSTZ1敲除。并且在FAH敲除細胞的基礎上,敲除GSTZ1可進一步提高LO2細胞的增殖活力。

2.5 劃痕實驗檢測細胞增殖能力

為驗證基因敲除是否影響LO2細胞的遷移能力,我們利用劃痕實驗觀察到72 h的GSTZ1敲除細胞株的相對遷移比為(0.4±0.012),是野生型LO2細胞的10倍(圖5)。FAH敲除細胞株的相對遷移比為(0.2±0.014),顯著高于野生型細胞株。GSTZ1和FAH雙敲除細胞株的相對遷移比為(0.25±0.021),并且GSTZ1和FAH雙敲除可進一步提高細胞遷移能力。

圖5 GSTZ1和FAH基因敲除對LO2細胞遷移能力的影響Note. A, Cell migration was observed under a microscope. B, Quantitative determination of cell migration rate. Compared with WT, **P＜0.01, ***P＜0.001.Figure 5 Effect of GSTZ1 and FAH gene knockout on the migration ability of LO2 cells

3 討論

本研究成功構建了GSTZ1和FAH單個基因和雙基因敲除肝細胞模型,并比較了不同基因編輯細胞在細胞增殖能力、克隆形成能力、遷移能力等方面的差異。FAH和GSTZ1都是肝中酪氨酸代謝通路的關鍵酶[11]。FAH的缺乏會導致遺傳性Ⅰ型酪氨酸血癥,并且會增加肝細胞癌風險[12]。迄今為止,關于酪氨酸分解代謝的倒數第二個酶GSTZ1的研究較少。有研究報道GSTZ1序列變異引起輕度高琥珀酰丙酮血癥,但沒有肝功能障礙的證據[13]。GSTZ1缺乏導致GSH耗竭,隨后氧化應激升高和持續的Nrf2激活,從而促進肝癌細胞的增殖。但目前為止,GSTZ1在人正常肝細胞中缺失對酪氨酸代謝通路的影響仍然沒有確切研究。我們首次在人正常肝細胞中進行GSTZ1基因突變研究,發現GSTZ1蛋白功能的缺失對肝細胞活性具有提升作用,并且對FAH基因突變的肝細胞的活性也有改善作用。

通過對酪氨酸代謝通路的另一個關鍵酶——羥苯丙酮酸二加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPD)的研究,發現HPD基因敲除能夠成功阻止因FAH基因缺失所導致的急性致死性肝損傷[14-15]。HPD基因阻斷治療可以有效促進酪氨酸代謝的重編程,并恢復該條代謝途徑中TAT、HGD和GSTZ1的表達,進而減少肝的炎癥反應和氧化應激反應。那么同樣作為酪氨酸代謝通路上游的酶GSTZ1是否能達到HPD對酪氨酸代謝的重編程的效果?研究首次在人正常肝細胞LO2中敲除了GSTZ1和FAH基因,在FAH突變的基礎上,進一步突變了GSTZ1,分別構建了FAH突變、GSTZ1突變和FAH/GSTZ1雙突變肝細胞模型,Western blot證實基因突變導致相應蛋白缺失。進一步通過細胞增殖實驗和細胞遷移實驗,首次發現GSTZ1基因的敲除可增加FAH基因突變細胞的活性,并且研究發現FAH和GSTZ1雙突變肝細胞比FAH突變肝細胞具有更強的增殖活性和遷移能力。由于FAH的突變,HT1患者肝細胞內積累大量有毒物質FAA,引起肝細胞損傷。此外,FAA還具有誘變作用,可導致HT1中所見的肝癌[16-17]。GSTZ1是低毒物質MAA轉變為FAA的關鍵酶,由于GSTZ1敲除會激活其依賴的谷胱甘肽非酶通路,積累的MAA可以繼續轉化為FAA,相比于GSTZ1正常通路減少了有毒產物FAA的積累,因此對肝細胞活性和功能影響較小[18]。本實驗中,我們發現FAH的敲除并不會造成LO2肝細胞的死亡,相反,細胞活性有一定程度的增強。我們推測FAH突變導致積累的毒素物質FAA和SA被釋放到了培養基中,稀釋了FAA對細胞毒性的作用;另一方面,FAH的缺失也會影響細胞周期,促進細胞增殖[4]。除此之外,本研究還發現肝細胞系LO2中敲除GSTZ1后細胞的增殖和遷移能力進一步增加,可能是由于毒性中間產物減少造成。另有其它研究證實GSTZ1基因是一個重要的抑癌因子,突變后也會促進細胞增殖[19]。

總之,我們的實驗研究發現GSTZ1基因可能成為HT1治療的潛在靶點。未來的研究可以進一步在HT1動物模型上開發針對GSTZ1的小分子抑制劑或基因編輯治療,阻斷FAA的形成,探索HT1疾病的治療新方案。