金銀花水提物改善膿毒血癥的物質基礎研究

李文舉羅福龍王鳳忠貫東艷范 蓓Alberto Carlos Pires Dias王 瓊鐘 武

(1.西南醫科大學附屬醫院急診醫學部,四川 瀘州 646000;2.中國農業科學院農產品加工研究所,北京 100193;3.葡萄牙米尼奧大學生物系,分子和環境生物學中心,中葡藥食植物資源研究中心,葡萄牙 布拉加 4710-057;4.西南醫科大學附屬中醫醫院中葡中醫藥國際合作中心,四川 瀘州 646000;5.四川省康復醫院,成都 611139)

膿毒癥(sepsis)是ICU常見重癥之一,因為其起病快,病死率高的特點,目前已經成為國際上討論的主要健康問題[1]。在膿毒癥的疾病發生發展過程中,免疫調節失衡所導致的過度炎癥和免疫抑制狀態是導致多器官損傷的主要原因。目前主要以抗菌及多種支持治療方案管理膿毒癥患者,但長期的侵入性檢查、治療易導致感染,包括抗生素的過度使用出現的耐藥性等副作用都在影響著膿毒癥的治療。因此,中藥結合抗生素方案逐漸成為膿毒癥臨床治療探索的策略之一[2-3]。

最新藥理學研究表明,金銀花(Lonicerae japonicaeflos)是一種具有抗炎、抗菌、免疫調節、抗氧化及抗病毒及等功能的中草藥[4]。其復方制劑如痰熱清、熱毒寧及金銀花單體中部分成分被證明對膿毒癥炎癥抑制及免疫調節等有較好的輔助治療效果[5-6]。但目前對金銀花改善膿毒癥免疫狀態的機制研究較少,且由于金銀花成分復雜,二者相關結合研究存在困難。因此,我們首先使用超高效液相色譜-高分辨質譜技術對金銀花水提物進行成分分析。在此基礎上,通過小鼠RAW264.7巨噬細胞構建膿毒癥細胞模型,進而通過體外實驗研究金銀花改善膿毒癥的可能機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

小鼠RAW264.7巨噬細胞購于北京大學醫學部。

1.2 主要試劑及儀器

金銀花產自山東,購自北京太洋樹康藥業有限責任公司(批號2008113),經水提、濃縮、噴霧干燥、粉碎而成;DMEM培養基(Thermo Scientific,批號11965092);胎牛血清(Gibco,批號:10099141);LPS(Sigma公司,批號12880);RNA提取試劑盒(艾德萊,批號RN28);cDNA反轉錄試劑盒(Promega, 批號A5000);NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein,批號:E096-01B)。細胞培養箱(美國,Thermo);酶標儀(美國,MolecμLar Devices);CFX96實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad);低溫高速離心機(德國 Eppendorf公司,型號:5430R)。UPLC-QExactiveOrbitrap-MS四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(賽默飛世爾科技公司);超高效液相色譜系統(賽默飛,Ultimate3000);色譜柱LO90AC18(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)。

1.3 實驗方法

1.3.1 金銀花水提物成分檢測及活性靶點研究

(1)UPLC-QE-Orbitrap-MS分析金銀花水提物成分

精密移取金銀花提取物1 mg,用1 mL 70%甲醇溶解,超聲處理15 min,離心(1000 r/min,10 min),取上清,過微孔濾膜(0.22 μm),進行超高效液質(UPLC-QE-Orbitrap-MS)分 析。色 譜 柱 為Waters UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm×1.8 μm);

流動相A(甲酸水溶液:0.1%),B(甲酸乙腈溶液:0.1%);梯度洗脫條件為0～15 min:5% B→90% B;15 ～20 min:90% B,20 ～20.1:90% B→5% B,20.1～30 min:5% B;流速為0.3 mL/min;柱溫:30℃;進樣量為5 μL。該系統與QE Orbitrap質譜儀(美國Thermo Fisher Science)相連。電噴霧離子源,正、負離子切換全掃描(100～1500 Da掃描范圍),離子源溫度320℃,電離源電壓3.8 kV(+),輔助氣加熱溫度:350℃,分辨率70000,載氣為高純氮氣,鞘氣流速25 L/min,輔助氣流速8 L/min,碰撞能量15、30、45 eV。使用Compound Discoverer(2.1.0.401版)導入數據,結合本地OTCML數據庫進行成分預測。

(2)金銀花水提物活性成分的對應靶點研究

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP:Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform)、Swiss靶點預測平臺(Swiss Target Prediction)及相關文獻檢索篩選金銀花活性成分及靶點數據,通過Perl腳本對藥物有效成分及對應靶點進行匹配。在uniprot(https://www.uniprot.org)依次選擇“human”、“reviewed”下載最新所有已經驗證的人類基因靶點信息數據包,通過Perl腳本匹配金銀花活性成分及對應靶點Gene Symbol。

1.3.2 膿毒癥疾病靶點研究

從GEO數據庫下載GSE28750[7]、GSE54514[8]、GSE67652[9]、GSE69528[10]的膿毒癥表達譜數據。GSE28750包括10例膿毒癥和20名健康人群的全血樣本。GSE54514基于基因芯片平臺GPL6947(35例膿毒癥,18例健康樣本),GSE67652基于芯片平臺GPL16699(12名膿毒癥患者及12名健康志愿者),數據集GSE69528基于平臺GPL10558(28名健康人和83名膿毒癥患者)。根據平臺中的注釋信息,使用探針ID來識別相應的基因。使用R軟件的Limma軟件包(版本:3.40.2)研究mRNA的差異表達,校正數據批次。在GEO中分析了調整后的P值以糾正假陽性結果。以“AdjustedP＜0.05且log2(倍數變化)＞1或log2(倍數變化)＜-1”為閾值篩選差異表達基因。同時,以關鍵詞“sepsis”、“septic”、“septic shock” 在Genecard(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)數據庫搜索膿毒癥疾病靶點,使用Uniprot數據庫(https ://www.uniprot.org/)對疾病疾病靶點進行靶點基因識別轉換,與GEO分析所得差異基因進行整合,消除重復項,最終得到膿毒癥靶點基因數據庫。

1.3.3 金銀花水提物活性成分與膿毒癥靶點相關性研究

基于1.3.1、1.3.2所整理的數據,使用R包根據金銀花活性成分靶點與金銀花水提物-膿毒癥復合靶點預測出金銀花治療膿毒癥活性成分,通過Perl腳本和Cytoscape軟件構建金銀花活性成分-膿毒癥靶點網絡。

1.3.4 金銀花水提物活性成分與膿毒癥靶點蛋白質互作網絡及核心基因研究

在上述分析結果的基礎上,我們將金銀花活性成分對應靶點與膿毒癥靶點基因數據庫進行匹配,得到金銀花-膿毒癥復合靶點,上傳至STRING(https://string-db.org/)在線平臺進行蛋白質網絡互作用(PPI)分析。本研究使用STRING數據庫根據既往研究及大數據預測靶點基因來標注靶點基因與其他基因之間的功能交互作用,并通過網絡圖形予以展示。我們可以認為處于節點的基因在生物過程中發揮更重要的作用。并將蛋白質互作用網絡圖導入Cytoscape軟件中,使用CytoNCA插件計算靶 點 基 因BC、CC、Degree、Eigenvector、LAC、Network,篩選出大于所有參數中位數的基因,生成核心基因網絡[11]。

1.3.5 金銀花治療膿毒癥的具有生物標志物特征的核心基因

為了對1.3.4中核心網絡的基因賦予臨床診療價值,本研究使用受試者操作特征曲線(ROC)對核心網絡的基因進行分析。通過比較ROC曲線下面積(AUC)評估所選金銀花靶點對膿毒癥治療特性,篩選其中AUC＞0.8的基因作為金銀花水提物治療膿毒癥的潛在靶點基因。

1.3.6 金銀花水提物對RAW264.7膿毒癥細胞模型潛在靶點基因和炎癥因子mRNA表達干預研究

小鼠巨噬細胞RAW264.7使用完全培養基(含10%胎牛血清DMEM高糖培養基)在細胞培養箱中孵育(5% CO2,37℃),選擇細胞80%密度時進行實驗。除對照組外,模型組和實驗組均使用LPS(0.5 μg/mL)刺激RAW264.7細胞進行造模,其中實驗組造模前使用濃度為75 μg/mL的金銀花水提取物預處理2 h。造模24 h后按照說明書流程使用RNA提取試劑盒從細胞中提取總RNA、反轉錄和實時熒光定量,并計算各組分中金銀花水提物治療膿毒癥相關炎癥因子(IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS)和關鍵靶點基因的相對表達量。β-actin、IL-1β、IL-6、MAPK1和MYC等引物由擎科生物(中國,上海)設計、合成(表 1)。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.4 統計學方法

實驗數據統計學分析及圖片生成均采用GraphPad Prism 8.0軟件進行,結果用平均數±標準差(±s)表示,組間比較采用Studentt檢驗,以P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金銀花水提物的主要成分

UPLC-QE-Orbitrap-MS檢測結果顯示,在正、負離子流模式下共鑒定出59個可能的金銀花水提物成分。經TCMSP、Swiss數據庫及網絡文獻檢索分析出金銀花水提物活性成分23個,預測出對應靶點386個。金銀花水提物總離子流圖見圖1,金銀花水提物活性成分見表2。

表2 金銀花水提物成分表Table 2 Constituents of Lonicerae japonicae flos water extract

圖1 金銀花水提物總離子流圖Figure 1 Total ion current chromatogram of Lonicera japonica flos

2.2 金銀花水提物治療膿毒癥的活性成分和靶點

聯合分析GEO數據庫中的四個基因芯片(GSE28750、GSE54514、GSE67652、GSE69528)發現了1298個與膿毒癥相關的差異表達基因(圖2A)。此外,整合了Genecard、OMIM、TDD、Drugbank 4大數據庫的疾病靶標2533個(圖2B),將疾病靶標與GEO分析結果相結合并消除重復值,進而確定了3831個膿毒癥相關靶點。將金銀花的活性成分靶標與膿毒癥的疾病靶標進行匹配,篩選出244個金銀花和膿毒癥的復合靶標(圖2C)。使用Cytoscape軟件生成金銀花水提物治療膿毒癥靶點-成分網絡圖(圖3),按照Degree度值對化合物進行排名,木犀草素、山奈酚、槲皮素、馬錢子苷和咖啡酸為排名前五的金銀花水提物治療膿毒癥成分。

圖2 金銀花活性成分靶點與膿毒癥靶點韋恩圖Figure 2 Venn diagram of Lonicerae japonicae flos active ingredient target genes and sepsis target genes

圖3 金銀花活性成分-膿毒癥靶點網絡圖Figure 3 Lonicerae japonicae flos active ingredient-sepsis target network

2.3 金銀花水提物治療膿毒癥的核心靶點網絡

將244個共同靶點上傳至STRING,生成蛋白質互作用網絡圖,置信度得分設置為0.4,共有244個節點,4902條邊,平均節點度值40.2(圖4A)。將上述PPI網絡導入cytoscape后使用CytoNCA插件對PPI網絡進行BC、CC、Degree、Eigenvector、LAC、Network計算分析,再使用Perl腳本篩選出所有條件都大于中位值的核心基因,循環計算2次(第二次循環Betweenness＞21.0496、Closeness＞0.5212、Degree＞9、Eigenvector＞0.1078、LAC＞4.125、Network＞5.0142),最終預測出17個核心靶點基因(圖4B、4C)(表3):MYC、ESR1、SRC、JUN、RB1、CCND1、MAPK8、TP53、NFKBIA、FOS、MAPK1、AKT1、HSP90AA1、PIK3R1、RELA、TNF、EGFR。

表3 金銀花治療膿毒癥核心基因Table 3 Lonicerae japonicae flos sepsis hub genes

圖4 金銀花-膿毒癥基因靶點PPI網絡圖和核心靶點網絡圖Figure 4 Lonicerae japonicae flos sepsis PPI network and hub genes network

2.4 金銀花治療膿毒癥的具有生物標志物特征的核心基因

膿毒癥診斷特性的ROC曲線結果顯示核心靶點基因MAPK8、TP53、RELA、MAPK1和MYC的ROC曲線下面積(AUC)＞85(P＜0.05)。對膿毒癥診斷特異性、敏感性均大于80,表現出了對膿毒癥診斷較好的較好敏感性和特異性,進而選取作為金銀花水提物治療膿毒癥的具有生物標志物特性的關鍵靶點基因進一步驗證分析。見圖5。

圖5 金銀花治療膿毒癥核心基因ROC曲線Figure 5 Lonicerae japonicae flos sepsis hub genes ROC curve

2.5 金銀花水提物對膿毒癥相關靶點和炎癥因子的調控作用

用RT-qPCR測量膿毒癥8個關鍵靶點基因(MAPK8、JUN、RELA、AKT1、MAPK1、TP53、MYC、FOS)及相關炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-10、iNOS、TNF-α)的相對表達水平。結果顯示,與正常組相比,LPS 誘導的 RAW264.7細胞中膿毒癥相關關鍵靶點基因和炎性因子表達顯著上調(P＜0.05)。與模型組相比,金銀花藥物干預組MAPK8、TP53、RELA、MAPK1、MYC和炎性因子IL-1β、IL-6、IL-10、iNOS、TNF-α表達顯著降低,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見圖6、圖7。

圖6 金銀花對膿毒癥關鍵靶點基因相對表達量的調控作用Note. A, Control group. B, Model group. C, Lonicerae japonicae flos intervention group. Compared with the control group, *P＜0.05,****P＜0.0001.Figure 6 Effect of Lonicerae japonicae flos on relative expression of sepsis related hub genes

圖7 金銀花對膿毒癥相關炎性基因相對表達量的調控作用Note. A, Control group. B, Model group. C, Lonicerae japonicae flos intervention group. Compared with the control group, ****P＜0.0001.Figure 7 Effect of Lonicerae japonicae flos on relative expression of sepsis related inflammatory genes

3 討論

本研究中,金銀花水提物對細胞膿毒癥模型炎癥顯示出顯著的抑制作用。通過UPLC-QExactiveOrbitrap-MS檢測得到金銀花水提物主要成分,結合網絡藥理學對金銀花進行成分分析及膿毒癥治療機制預測,發現金銀花水提物的五種主要成分木犀草素、山奈酚、槲皮素、馬錢子苷和咖啡酸參與抑制膿毒癥炎癥,進一步研究實驗表明,MAPK8、TP53、RELA、MAPK1、MYC可能為金銀花作用于膿毒癥的關鍵藥物靶點。

金銀花水提物對膿毒癥作用靶點的調控作用明顯。導致膿毒癥炎癥反應失衡的相關靶點和通路很多,包括MAPK、NF-κB、IL-17、AMPK及mTOR等通路及靶點。其中,MAPK通路在致炎條件刺激下通過ERK、JNK、P38等途徑在調控炎癥因子生成方面發揮重要作用。本次研究發現MAPK通路中的MAPK8、MAPK1與下游通路RELA、TP53及MYC在金銀花水提物改善膿毒癥炎癥過程中起了關鍵作用。MAPK8、MAPK1與RELA、TP53及MYC在先前的文獻研究被提及通過MAPK/NF-κB、MAPK/P53、MAPK/c-MYC通路[12-14]在免疫介導多種炎癥疾病中發揮作用。其中,TP53為腫瘤抑制基因,敗血癥期間T淋巴細胞中的P53表達可能有助于增強T細胞的凋亡,導致免疫功能障礙[15],TP53通過負向調節 mTOR通路,在真菌膿毒癥期間通過自噬-凋亡途徑對促進CD4T細胞細胞自噬發揮重要的作用[16-17]。MAPK1和MAPK8是MAPK通路中的主要亞族,當炎癥反應發生時,中MAPK1通過NOD樣通路將外部信號由細胞膜傳遞到細胞核,促進由NF-κB信號通路介導的各種炎癥因子(如:TNF-α和IL-1β)的釋放,加重細胞損傷[18]。另有針對MAPK3/MAPK1信號通路的靶向藥物在治療如小鼠海馬體炎癥[19]、系統性紅斑狼瘡[20]及急性肺部炎癥[21]等各種炎癥性疾病中具有重要的價值[21]。最新研究表明,在蓮花清瘟治療小鼠膿毒癥急性肺損傷實驗中,通過網絡藥理學分析及實驗驗證,同樣篩選出TP53、MAPK1、MAPK8為膿毒癥治療關鍵靶點基因,并可能通過抑制 P53 介導的內在細胞凋亡途徑減輕 LPS誘導的急性肺損傷[22]。另一關鍵靶點基因RELA在機體免疫過程中可被IL-1β以及TNF-α等細胞因子激活,進而活化NF-κB發揮促炎作用[23]。還可通過MAPK/c-Myc 通路調節巨噬細胞極化來減輕敗血癥誘導的急性肺損傷[24]。上述文獻研究表明,我們的實驗結果符合這5個靶點基因在膿毒癥炎癥相關信號通路中所涉及的基因的表達情況,金銀花水提物在LPS膿毒癥細胞模型中抑制了TP53、MAPK8、MAPK1、RELA表達,上調MYC基因表達。這表明金銀花水提物中的多種活性成分可能通過作用于上述靶點及所在通路,調控過度炎癥反應和免疫抑制來改善膿毒癥的免疫失調,以及改善隨后導致的多器官功能障礙和并發癥。

長期大量的臨床觀察研究表明,膿毒癥患者免疫功能受損所導致的炎癥反應失調是膿毒癥患者病情進展的重要原因[25-26],而金銀花所含的主要成分在預防和改善膿毒癥方面的作用已有初步探索。本研究使用RT-qPCR對膿毒癥細胞模型的炎癥實驗結果表明,LPS造模后,IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α等炎性因子及其誘導基因iNOS均高表達。與針對單一靶點的西藥不同,中藥可以通過多成分作用于多靶點來進行整體施治。當代中醫認為膿毒癥發生發展主因“毒”、“瘀”、“虛”。邪氣侵襲,正邪交爭,生痰生瘀,繼而脈絡瘀滯,致使臟腑不得氣血濡養,機能紊亂,甚者內閉外脫。同時邪氣流連亦可令正氣漸傷,日久邪實正虛,正氣將絕[2,27]。目前中醫治療膿毒癥首選清熱解毒療法,其中單味中藥金銀花及提取物在目前研究中表現出良好的免疫調節功效[28]。金銀花是我國傳統清熱解毒中藥之一,藥理學分析表明金銀花的主要成分為黃酮、有機酸、揮發油及其他類物質,具有顯著的清熱解毒、抗炎、抗菌及抗氧化等功效。近年來的研究顯示出金銀花水提取物的某些成分在預防和改善膿毒癥方面有較好的效果,特別是其中的黃酮及有機酸類化合物,如綠原酸[29]、金絲桃苷[30]、槲皮素[31]、異槲皮苷[32]及木犀草苷[6]等成分在既往研究中均被證明可預防膿毒癥及其并發癥,并且能減少膿毒癥過程中炎癥因子產生。既有研究表明,木犀草素可以改善膿毒癥小鼠的急性肺損傷[33];在LPS誘導的巨噬細胞和小鼠模型中,抑制高遷移率族蛋白B1,降低炎癥因子釋放和膿毒癥小鼠死亡率[34]。山奈酚可減輕小鼠膿毒癥盲腸結扎穿刺模型的急性肺損傷[35],和白楊素協同作用時能提高敗血癥小鼠的存活率[36]。槲皮素能通過減輕炎癥和氧化應激、降低TOL樣受體的基因表達,調節免疫狀態,改善膿毒癥器官損傷[37]。馬錢子苷通過調節巨噬細胞極化和抑制 NLRP3 炎癥小體激活減輕膿毒癥誘導的急性肺損傷[38]。咖啡酸衍生物綠原酸及咖啡酸苯乙酯可降低膿毒癥大鼠的炎癥和氧化應激[39]。在本研究中,同樣含有木犀草素、山奈酚、槲皮素、馬錢子苷和咖啡酸五種主要成分的金銀花水提物在LPS膿毒癥模型中抑制了炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS基因mRNA的表達,進一步證實了上述早期發現。

近幾年研究發現,膿毒癥患者早期同時存在炎癥反應過度激活和免疫抑制狀態,二者相互作用,共同影響膿毒癥的發生發展[40]。這也解釋了為什么單純地抗感染治療并不能明顯改善膿毒癥患者預后。現在,我們可以利用超高效液相質譜技術分析中藥有效成分和生物信息學大數據分析相關靶點,篩選出金銀花改善膿毒癥的基因并探索其機制,為金銀花在膿毒癥的臨床治療找到關鍵靶點,為后期藥物研發提供理論依據和實驗基礎。

綜上,我們對金銀花治療膿毒癥的活性成分及藥物-膿毒癥核心靶點進行了研究,發現金銀花治療膿毒癥具有多成分、多靶點的特點,并找出金銀花治療膿毒癥可能的活性成分木犀草素、山奈酚、槲皮素、馬錢子苷和咖啡酸,以及金銀花防治膿毒癥的機制與調控MAPK及下游通路靶點TP53、MAPK8、MAPK1、RELA、MYC和調控的炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS有關。此研究為金銀花活性成分如何發揮治療膿毒癥的深入研究提供參考,也為相關疾病治療提供新的思路。