基于TLR4/NF-κB信號通路探討重組BPI對肺炎支原體感染小鼠肺炎癥反應的影響

韓 紅陳旭霞逯建立韓艷珺*

(1.邢臺市人民醫院兒一科,河北 邢臺 054000;2.秦皇島市第一醫院兒科,河北 秦皇島 066000)

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae,MP)感染多發于童和青少年,其致病率高、易于流行,臨床可引發咳嗽、發熱,并可導致多器官、多系統的肺外損害,嚴重影響人體健康[1-2]。肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)由MP感染引起,發病機制與上皮細胞凋亡和機體過度免疫應答有關[3-4]。近年來的研究證實,“TLR4/NF-κB”信號通路與機體抗炎免疫機制密切相關。TLR4是首個發現的Toll樣受體TLRs(toll-like receptor,TLR),其參與支原體肺炎發病進程,介導炎癥反應[5]。當TLRs識別外源性刺激危險信號后,核因子κB(nuclear factor-κB)被激活,從而啟動炎癥免疫相關細胞因子的分泌[6]。

殺 菌、通 透 性 增 加 蛋 白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)是機體在免疫反應中釋放的免疫分子,可特異性地中和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),對革蘭氏陰性菌具有強烈的細胞毒性效應[7],在機體免疫中發揮重要作用。有研究表明[8],BPI具有抑制促炎因子IL-6的表達,促進抗炎因子白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)表達的作用,能有效減輕機體炎癥反應,同時還具有增效抗生素殺菌的作用[9],但重組BPI在支原體感染小鼠肺部炎癥中的作用還尚不清楚。因此,本研究通過建立支原體感染小鼠模型,給予重組BPI干預,研究重組BPI對MPP小鼠炎癥反應及TLR4/NF-κB信號通路的影響,為研究重組BPI在MP的抗病機理研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

4～6周齡SPF級雄性BALB/c鼠67只,體重14～18 g,購于河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2018-004],飼養于河北醫科大學實驗動物公共服務平臺[SYXK(冀)2020-002],單籠飼養,飼養溫度控制在25℃～26℃,相對濕度為50%～60%,充足光照,飼養1周后進行試驗。實驗過程遵守減少、替代、優化的3R原則,所有動物實驗經我院實驗動物倫理委員會審批(IACUC-2019-0356)。

1.2 主要試劑與儀器

肺炎支原體(ATCC15331)FH標準株(上海佰泰科技有限公司);兔抗鼠TLR4抗體、兔抗鼠NFκB p65抗體、重組BPI蛋白及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);RIPA裂解液、IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑及MP核酸檢測試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司);HRP標記羊抗兔IgG(武漢武漢博士德公司);HE染色試劑盒(北京中山生物技術公司);TRIzol總RNA提取試劑及RNA反轉錄試劑盒(Invitrogen公司)。

ELX88型酶標儀(美國Bio-Tek儀器有限公司);CKX41倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司);2720 Thermal cycler PCR擴增儀(美國Applied Biosystem公司);UV-3型紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);實時熒光PCR儀(美國Bio-Rad公司);RM2335石蠟切片機、Histostar石蠟包埋機、TP1020型自動組織脫水儀(德國leica公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 研究路線

本文研究路線圖如圖1所示。

圖1 研究路線圖Figure 1 Research roadmap

1.3.2 動物分組及模型制備

適應性飼養1周后,根據樣本量計算公式φ2=(∑si2/g)/[∑(xi-x)2/(g-1)]計算得出本研究單組小鼠的最小樣本量為9.27,采用隨機數字表法將小鼠分為正常對照組(15只)、肺炎支原體(MP)模型組(13只)和重組BPI蛋白高、中、低劑量組(各13只)。按照文獻[10]中的方法對除正常對照組外的小鼠建立MP模型,1%戊巴比妥鈉(0.05 mL)腹腔注射麻醉小鼠,鼻滴100 μL濃度為1×106CCU/mL的MP菌液,完成后將小鼠頭部后仰30～45°,保持1 min,使MP菌液經鼻腔到達下呼吸道,對照組以等量不含MP的培養液滴鼻,連續滴鼻4 d。次日對小鼠進行核酸檢測,陽性結果提示造模成功。造模過程中MP模型組死亡兩只小鼠,其余造模小鼠核酸檢測結果均呈陽性,造模成功。

1.3.3 藥物處理

除正常對照組和MP模型組,其余組小鼠開始藥物治療,重組BPI蛋白各治療組小鼠腰靜脈注射0.45、0.3和0.15 mol/L重組BPI,注射量為1.5 mL,每3 d注射1次,空白對照組和模型組腰靜脈給予等量生理鹽水注射,所有小鼠均采用不同方法干預4周。

1.3.4 小鼠肺指數、干濕比測定

末次給藥后禁食12 h后,將小鼠麻醉后進行稱重,無菌解剖,分離小鼠雙側肺組織并稱重,計算肺濕重指數,肺指數=肺重/體重×100%。

取右中肺葉組織置于錫箔紙上,采用潔凈濾紙吸干肺組織表面水分置于玻璃瓶中精確稱濕重(W),然后將肺組織連同錫箔紙置于80℃恒溫箱中烘烤72 h后測定肺組織干重(D),記錄并計算出肺組織W/D重比值。

1.3.5 HE染色觀察肺組織病理變化

將小鼠麻醉處死后取左肺上葉,在4%多聚甲醛中固定24 h 后轉移至75%的乙醇中,脫水、透明處理,石蠟包埋后5 μm切片,水浴展開,撈片,瀝干,置于烘箱中烤2 h,HE染色,顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理學改變。

1.3.6 肺組織病理評分

由兩位主治醫師采用雙盲法閱片,并根據肺組織病理變化進行肺組織病理學評分,每張切片通過5個分類評價系統進行評分,評分標準見表1[11]。總評分計算公式為:總分=A+3(B+C)+D+E。

表1 肺組織病理評分標準Table 1 Lung tissue pathology scoring standard

1.3.7 ELISA檢測炎癥因子水平

小鼠眼眶靜脈叢取血,離心分離血清(3000 r/min,15 min),ELISA檢測IL-6、TNF-α及IL-1β水平。

1.3.8 RT-PCR檢測肺組織TLR4、NF-κB p65 和IκBα mRNA相對表達量

小鼠基因引物序列由上海生工合成,見表2。取小鼠肺組織并粉碎,TRIzol提取總RNA,紫外分光光度計分析RNA純度。合成cDNA,PCR擴增,RT-PCR檢 測 肺 組 織TLR4、NF-κB p65和I-κBα mRNA表達水平。反應體系:SYBR Greeb PCR Master Mix(2×)15 μL;Primer A 0.5 μL;Primer B 0.5 μL,加超純水至30 μL。擴增程序:95℃預變性5 min,95℃變性15 s,60℃退火50 s,共40個循環。反應均以β-actin為內參,采用2-ΔΔCt算法計算mRNA相對表達量。

表2 RT-PCR基因序列Table2 RT-PCRgenesequence

1.3.9 Western blot檢測蛋白表達

采用RIPA細胞裂解液裂解小鼠肺組織,離心(12000 r/min,10 min)收集上清。取樣30 μL,12%SDS-PAGE凝膠電泳,電轉至PVDF膜,浸入封閉液中孵育1 h,加入一抗室封閉過夜。次日加入二抗孵育1 h,凝膠成像系統成像,以GAPDH為內參,計算蛋白表達。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0版,采用Graphpad 5.0繪圖,計量資料采用(x±s)表示,組間比較采用t檢驗,檢驗水準α=0.05,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺指數、W/D及病理評分

與對照組比較,MP模型組小鼠肺指數及肺組織病理學評分顯著增加(P＜0.05),不同劑量重組BPI干預后,小鼠肺指數、組織病理學評分有所降低,除重組BPI低劑量組肺指數與模型組比較無統計學意義外,其余組別肺指數及肺組織病理學評分與模型組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.05);各組W/D比差異均無統計學差異(P＞0.05),見表3、表4。

表3 各組小鼠肺指數、W/D比較Table 3 Comparison of lung index and W/D of mice in each group

表4 各組小鼠肺組織病理學評分Table 4 Lung histopathological scores of mice in each group

2.2 小鼠肺組織病理學改變

對照組小鼠肺組織肺泡清晰正常,無炎性物滲出,周圍血管未見炎性細胞浸潤;MP模型組小鼠肺泡結構不完整,見大量滲出物,毛細血管擴張,氣管管壁及周圍間質充血,肺泡間質見炎性細胞浸潤;重組BPI高、中、低劑量組肺部炎癥較輕,滲出物和炎性細胞浸潤較少,并呈出劑量依賴性,見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織病理變化(HE染色)Figure 2 Pathological changes of lung tissue of mice in each group(HE staining)

2.3 各組小鼠血清炎癥因子水平

MP模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平較對照組顯著增加(P＜0.05),與MP模型組比較,重組BPI各劑量組小鼠血清炎癥因子水平均降低(P＜0.05),其中重組BPI治療組炎癥細胞因子水平隨給藥量的增加而下降,呈現出劑量依賴性,見表5。

表5 各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較(ng/L)Table 5 Comparison of TNF-α, IL-1β and IL-6 levels in serum of mice in each group

2.4 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65 和I-κBα mRNA 的表達水平

RT-PCR檢測結果顯示,與正常對照組比較,MP模型組小鼠肺組織TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達明顯上調(P＜0.05);重組BPI各組小鼠肺組織TLR4 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達與MP模型組比較明顯下調(P＜0.05);MP模型組I-κBα mRNA表達較對照組明顯下調(P＜0.05),重組BPI各組小鼠肺組織I-κBα mRNA表達與MP模型組比較明顯上調(P＜0.05),見表6。

表6 各組小鼠肺組織NF-κB p65、TLR4、p-IκB mRNA表達變化Table 6 Expression changes of NF-κB p65, TLR4 and p-IκB mRNA in lung tissue of mice in each group

2.5 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65 和I-κBα蛋白表達水平

與正常對照組比較,MP模型組小鼠肺組織中NF-κB p65、TLR4蛋白表達明顯上調,I-κBα蛋白表達明顯下調;與MP模型組比較,重組BPI各組蛋白表達明顯下調,而I-κBα 蛋白表達明顯上調(P＜0.05),見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織NF-κB p65、TLR4、I-κBα 蛋白表達水平Note. Compared with normal control group, *P＜0.05. Compared with MP model group, #P＜0.05.Figure 3 Protein expression levels of NF-κB p65, TLR4 and I-κBα in lung tissue of mice in each group

3 討論

MPP是一種主要由肺炎支原體感染引起的急性呼吸道感染疾病,易在兒童群體中爆發流行,但目前關于支原體肺炎致病的具體機制尚不完全明確。臨床研究多認為其與上皮細胞損傷和免疫學機制有關[12-13]。BPI是一種陽離子膜結合型抗菌蛋白,廣泛分布于小鼠、人皮膚及粘膜上皮細胞中,具有抑制炎性介質生成及殺滅革蘭氏陰性菌的作用,并且不易產生抗性,在機體免疫防御系統中起著重要作用[14]。與常規抗生素不同,BPI可通過與脂多糖結合抑制免疫系統的過度激活[15]。近年來,人們對BPI的天然蛋白及重組蛋白進行了系統的研究。早期研究發現[16],在狒狒大腸桿菌膿毒血癥模型中,靜脈注射重組BPI后能減少細菌量并緩解器官衰竭,胡伶俐[17]等通過體外抑菌試驗證明重組BPI具有抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生物活性。基于以上研究結果,本研究將重組BPI蛋白應用于肺炎支原體感染小鼠的治療中。

MP感染后機體免疫功能紊亂,促進炎癥浸潤和炎癥細胞因子釋放。TNF-α可通過促進中性粒細胞釋放誘導炎癥反應,與MP發病有關[18-19],MP感染患者的TNF-α水平較正常者明顯增加[20]。IL-6是炎癥反應的重要媒介,在肺部炎癥反應和機體免疫防御中起重要作用[21],研究發現MP感染小鼠肺泡灌洗液中IL-6水平與炎癥程度呈正相關[22]。本研究中,MP感染小鼠血清炎性細胞因子水平與對照組顯著升高,提示MP感染可影響炎性細胞因子水平,從而引發機體炎癥反應。重組BPI干預后,MP小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低,HE染色結果顯示,重組BPI干預后的MP小鼠肺組織炎細胞浸潤較少,肺泡滲出減輕,表明重組BPI能有效減輕MP感染肺炎癥反應。

Toll樣受體(TLRs)是具有天然免疫和獲得性免疫的識別受體,TLR4是其家族成員之一,能介導機體的抗病毒固有免疫,促進獲得性免疫的產生[23],被證實與肺部感染性疾病密切相關,NF-κB是一種很重要的轉錄因子,位于TLR下游信號通路的樞紐位置,當細胞內TLR被激活后,通過髓系分化蛋白MyD88激活NF-κB,正常情況下,NF-κB通過其抑制劑IκB蛋白在細胞質中螯合處于未激狀態,當受到致病菌刺激時I-κBα被磷酸激酶磷酸化,導致其蛋白酶體降解和NF-κB p65的激活和釋放,從而激活炎癥細胞因子,調控機體免疫功能[24-26]。本研究結果顯示,MP模型組小鼠肺組織TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白表達均較正常對照組明顯上調,I-κBα mRNA及蛋白表達均較對照組明顯下調,提示MP感染可激活TLR/NF-κB信號通路,引起炎癥反應。重組BPI各給藥組肺組織中TLR4和NF-κB 蛋白表達明顯降低,TLR4和NF-κB mRNA活性被顯著抑制,提示重組BPI蛋白可能通過TLR/NF-κB信號通路抵抗MP感染造成的肺部炎癥反應和損傷。

綜上所述,重組BPI蛋白能夠減輕MP小鼠肺部損傷,推測這一作用是通過調控TLR/NF-κB信號通路從而抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的產生,為肺炎支原體引起的肺炎治療提供了新的思路。本研究尚存在不足之處,TLR/NF-κB相關通路分子和基因表達網絡還有待進一步研究。