缺血性腦卒中非人靈長類動物模型研究進展

孫宇航管博文魏 強孟愛民

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,國家衛生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室,北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,國家人類疾病動物模型資源庫,北京 100021)

腦卒中有較高的發病率和致殘、致死率,其中缺血性腦卒中占85%左右。1990年到2019年,全球腦卒中患病人數、死亡人數和傷殘調整壽命年逐年上升,造成了嚴重的疾病負擔[1]。為滿足臨床對缺血性腦卒中的防治需求,建立了多種動物模型用于機制研究及干預措施的評價。目前廣泛使用嚙齒類動物,通過阻塞大腦中動脈(middle cerebral artery,MCA)構建缺血性腦卒中模型。這類模型具有許多優點,如成本低、易操作、生理反應特性好、能夠研究遺傳信息和共病(如糖尿病、高血壓)等[2],但所有在嚙齒動物腦卒中模型中有效的神經保護策略都未能成功轉化到臨床。NHPs與人類在腦血管系統、腦代謝、灰質與白質比例以及認知和行為的復雜性等方面高度相似,使其可能比其他類型動物更適合模擬人類神經系統疾病[3]。本文對缺血性腦卒中NHPs模型進行了總結,并與傳統嚙齒類模型進行比較分析,這對于了解各種模型的優缺點,根據實驗的具體條件和目的選擇最佳NHPs模型至關重要。

1 常用缺血性腦卒中動物模型

腦卒中研究中最常用的是嚙齒類動物模型,這類模型成本低,操作方便,倫理標準完善,近年來轉基因技術的發展也使小鼠模型具備了更多優勢。但嚙齒動物在腦梗塞后只會出現暫時性偏癱,康復過程中恢復很快[4],且生理條件、大腦解剖結構和血管血液供應方面與人類有很大不同。缺血性腦卒中作為一種復雜疾病,梗死體積和神經系統功能缺失的嚴重程度取決于多種因素,如有無側支循環建立和有無足夠的血壓保持灌注,梗死的病因及部位,年齡、性別、遺傳背景,是否有并發癥,是否經過藥物治療等。已經構建了多種模型用于各種影響因素的研究(表1),對闡明腦卒中的分子、細胞和系統病理生理學機制發揮了重要的作用。然而,由于嚙齒類動物缺血性腦卒中模型臨床前研究成果向臨床轉化困難,需要構建與人類腦卒中相似性更高的模型以提高臨床轉化率。

表1 常用缺血性腦卒中動物模型Table1 Commonanimalmodelsofischemicstroke

2 NHPs腦卒中模型的優勢和必要性

為了解決嚙齒類動物和人類之間的差異導致的治療反應性的差異,2009年腦卒中治療學術企業圓桌會議(Stroke Therapy Academic Industry Roundtable,STAIR)建議首先選擇嚙齒類動物腦卒中模型進行初步研究,靈長類動物或貓作為第二物種開展后續試驗[8],以提高臨床前研究的轉化能力。

2.1 解剖學相似性

NHPs具有與人類相似的復雜腦部結構及血管系統。目前建立缺血性腦卒中模型的NHPs可分為缺腦回型(皮層光滑)如絨猴、松鼠猴等,以及多腦回型(皮層有卷曲的腦溝和腦回)如狒狒、恒河猴、非洲綠猴以及食蟹猴等。與缺腦回型相比,多腦回型NHPs腦結構,特別是管理運動和感覺功能的大腦皮層結構,以及灰質與白質的比例(＞60%)與人類更為相似[3]。研究發現,白質缺血性損傷是影響人類腦卒中預后的重要因素,NHPs在腦缺血后灰質和白質的變化以及功能損傷方面比其他中風動物模型更近似人類,因此可以解決無白質結構的嚙齒類動物無法復制白質損傷的問題[9]。此外,NHPs具有與人類相似的腦血管系統、頸內動脈和椎動脈分布,以及豐富的側枝循環系統,M1栓塞主要導致基底節和白質缺血;而嚙齒類動物由于側支循環與人類差異較大,MCA梗塞后損傷部位和性質都有不同[10];貓、犬、綿羊、豬等由于許多分枝構成血管網結構(rete mirabile),不適合制備大腦中動脈阻塞模型[3]。

2.2 病理生理學相似性

NHPs腦卒中模型在免疫應答、血栓組成和梗死區域方面與人類相似性高。NHPs免疫成分與人類相似性較嚙齒類更高,腦卒中后可引發相似的免疫反應,針對人類腦卒中相關蛋白質/表位的免疫試劑,可以直接用于NHPs的相關檢測,但其他低等哺乳動物通常不適用[11]。其次,嚙齒類動物的血小板缺乏人類普遍表達的血小板激活因子受體,在人類和靈長類動物MCAO過程中,缺血區發生中性粒細胞(polymorphonuclear leukocyte)聚集,但尚未在大鼠中發現該現象,而大鼠白細胞表面表達的整合素α4?1也未在 人 類和NHPs細 胞上 發現[10]。NHPs的血管止血成分主要包括血小板、血漿凝血蛋白、纖溶蛋白和抑制蛋白等,與人類腦血管中血栓成分更相似[12]。此外,多腦回型NHPs腦部體積更大,結構更復雜,其大腦比大鼠大5倍,約占其體重的2.7%,相當于人類的比例,適于針對性地觀察不同區域損傷對預后的影響。Ramirez-Garcia等[13]將食蟹猴大腦MCAO半球分成50個相關區域,發現額葉、顳葉、枕葉、中白質、內囊、顳葉上回、顳葉中回和尾狀核損傷均會導致模型評分差異,更符合人類腦卒中的復雜情況。因此,NHPs腦卒中模型可以更全面地模擬人類腦卒中后病理生理變化。

2.3 檢測和評價方法相似性

NHPs有很強的學習記憶能力和執行復雜行為任務的能力,在感覺和運動功能方面與人類更為相似,進行神經行為測試時能更有效模擬臨床評價指標[14]。此外,NHPs上肢結構與人類相似,在手部精細動作功能研究中具有不可替代的作用,故NHPs模型可用于研發各種手靈巧任務(hand dexterity task)相關的臨床評價手段,檢測腦卒中的功能損傷及干預效果[15]。NHPs的體型適用于人類臨床影像檢測技術,如計算機斷層掃描(CT)、腦正電子發射斷層掃描(PET)、腦磁共振成像(MRI)和血管造影(DSA)等,其中MRI對缺血性腦卒中發現早,敏感性高,是目前臨床廣泛使用的檢測手段。卒中后殘存行為能力與基于MRI成像的腦功能連接(functional connectivity,FC)變化關系密切。Hernandez-Castillo等[16]應用食蟹猴MCA卒中模型研究發現3個FC變化與行為顯著相關,同側FC減少與恢復不良相關。這提示NHPs腦卒中模型中靜息狀態網絡的分析可以成為腦卒中轉化醫學領域的一種相關研究方法,可能會作為新的藥物治療的生物標志物,用于判斷卒中后神經變化情況,或者為腦-機接口的實現提供信息,以恢復腦卒中后的功能損傷。

3 建模方法及應用

構建NHPs缺血性腦卒中模型的方法可以分為手術法、血管內介入法和光化學誘導法,根據建模后能否產生再灌注,可分為永久性和短暫性栓塞模型。

3.1 外科手術法

通過手術暴露MCA的方法主要分為兩種:經眶進入法和經顱進入法。外科手術模型的優點是精確地阻斷了靶血管,因此可以降低病變變異程度和模型動物死亡率[17]。然而,侵入性手術產生的創傷會影響模型應用,而人類缺血性腦卒中通常與頭部創傷無關,且開顱手術與經眶手術不僅操作難度大,對動物心理生理有重大影響,還會影響術后神經和運動行為的評估。

3.1.1 微血管夾栓塞法

此法可以嚴格控制缺血及再灌注的位置和時間,但手術難度大,易引起血管痙攣和腦部循環障礙等問題。Meloni等[18]采用右側翼點開顱術,在食蟹猴眶額支遠端用5 mm鈦動脈夾阻斷右側MCA,通過MRI成像確定栓塞,阻斷持續90 min后,取下動脈夾以恢復血流。該模型損傷可以持續數小時,恢復血流后發生了再灌注,使用該模型成功驗證了聚精氨酸肽-18(poly-arginine peptide-18,R18)的神經保護作用。R18等神經肽具有多模式神經保護作用,如抗興奮性毒物、抗炎、抗氧化和有毒分子清除、抗蛋白水解和線粒體穩定等。最近的三期臨床實驗中發現神經肽可改善急性中風血栓切除術后再灌注恢復情況,有效改善了預后,降低死亡率[19]。使用食蟹猴血管夾MCA模型,發現神經保護劑nerinetide(NA-1)能將突觸后密度蛋白-95從神經毒性信號通路中解偶聯,在減少中風損傷、改善靈長類動物缺血再灌注模型的恢復方面顯示出前景。三期臨床試驗驗證了進行血管內血栓切除術后NA-1的神經保護作用[19],盡管NA-1不適合已經接受溶栓的患者,但無疑為神經保護帶來了新的希望。NHPs實驗結果為腦卒中新型藥物開發提供了可靠依據。

3.1.2 化學物質誘導法

內皮素-1(endothelin-1,ET-1)是一種強效的血管收縮肽,立體定向注射到大腦的靶區可以收縮局部小動脈,通過改變ET-1的濃度或體積可以調整腦損傷的范圍[20],目前已構建了多種品系的大鼠及恒河猴、絨猴ET-1腦卒中模型。然而,這種方法的局限性在于不能嚴格控制缺血時間,且不同個體損傷程度差異大,死亡率高。Le Friec等[21]在中年絨猴初級運動皮層立體定向注射線粒體毒素丙二酸鹽誘導形成局灶性病變,該方法安全、經濟、易操作,丙二酸鹽引起的感覺運動障礙在嚴重程度和持續時間方面重復性好,有利于腦卒中后慢性期的運動恢復治療策略的研究。由于誘發性栓塞與人類腦血栓形成相似,可能適用于使用抗血小板和抗血栓藥物的治療康復研究。

近年來,干細胞療法作為治療中風的細胞替代療法得到了廣泛的探索,但一直存在長期植入后移植細胞的存活率較低的問題。Ge等[22]報告了一種通過NeuroD1基因治療修復成年恒河猴缺血性腦卒中后受損大腦的體內神經再生方法,在恒河猴大腦雙側初級運動皮層每側的六個部位顯微注射ET-1,以誘導局灶性缺血性損傷構建腦卒中模型,發現基于NeuroD1基因治療的體內細胞轉化,可以通過再生新神經元使成年恒河猴模型腦組織修復。與依賴外部細胞移植的干細胞療法相比,該基因療法更依賴于內部神經膠質細胞來再生新的神經元,這些神經元可以在NHPs大腦中存活超過1年,這種長期存活的神經元有望有效修復腦卒中后受損的神經回路。基于NeuroD1的基因療法在NHPs模型中的成功應用可能會縮小動物模型與未來臨床試驗之間的差距。

3.1.3 電凝法

常用的MCA栓塞模型有助于揭示皮質缺血對腦功能的損害,但對腦卒中患者進行影像學研究發現,白質損傷對腦卒中后運動功能恢復的影響比皮質損傷更大。電凝法建模梗死部位明確可控,較血管夾栓塞法對目標血管空間要求小,適于研究不同缺血位置對疾病的影響。Puentes等[23]建立了一種利用電凝法誘導絨猴脈絡膜前動脈栓塞的方法,用于研究非人靈長類腦卒中后的白質損傷和行為變化。結果顯示,用雙極電凝系統切斷脈絡膜前動脈能誘發絨猴白質梗死并導致運動障礙,有助于深入了解白質損傷,尋找腦卒中后運動功能缺陷恢復新策略。然而,盡管絨猴在系統發育上與人類相似性較嚙齒類或其他低等哺乳動物更高,但絨猴缺乏腦回,其大腦結構與人類仍有較大差異,且模型構建成功率較低,手術后約40%絨猴未出現神經損傷,可能限制該模型的進一步應用。

Ouyang等[24]使用多腦回型NHPs食蟹猴構建了電凝MCAO模型,研究腦卒中后運動功能障礙與腦內Aβ蛋白沉積的關系。研究發現中風12個月后,模型同側丘腦和海馬中沒有細胞外淀粉樣蛋白Aβ沉積的跡象,即Aβ斑塊沉積可能不是卒中后認知障礙的病理基礎,這與在嚙齒動物中獲得的結果相反。引起差異的原因可能是嚙齒動物淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein)的結構與人類并不相似,已有研究表明 Aβ 肽不會在鼠類嚙齒動物中聚集,因此本質上不會形成斑塊,相反,NHPs和人類一樣,腦內的Aβ 肽具有聚集和形成老年斑的能力。因此,多腦回型NHPs可以為研究腦卒中病理生理學和人類腦疾病的基本分子機制提供更適用的動物模型[25]。

早期非人靈長類腦卒中模型多利用手術方法建立,對腦卒中后缺血組織的病理生理過程及干預措施研究起到了重要作用。具有定位準確,模型重現性好,梗死成功率高等優點。但是存在著以下局限性:外科手術創傷會對動物心理產生影響;手術失敗率和動物死亡率較高;容易引起神經損傷和血管痙攣;有時梗死灶的范圍和體積不可預測等。

3.2 血管內介入栓塞法

血管內介入栓塞法是借助影像學成功建立局灶性腦梗塞的技術,通常是將引導導管插入股動脈并穿過胸主動脈、主動脈弓和頸總動脈到達頸內動脈,將栓子傳送到MCA的特定位置以誘發局灶性缺血。常用的栓子有微導管、自體血凝塊、充氣球囊、彈簧線圈或手術縫合線等。此外,還可以通過導管將粘合劑直接注射到目標位置以形成栓塞,此法對目標血管閉塞完全,模型構建成功率高,但無法進行溶栓操作,不能有效模擬臨床治療過程[26]。

3.2.1 自體血凝塊法

將動物自身血液凝結成的凝塊輸送到MCA以形成閉塞,與臨床情況相似性最高,是分析取栓和溶栓最理想的動物模型,特別適于探究局部或區域輸注纖溶藥物、神經保護藥物或新型給藥方式的安全性和可行性,以及干細胞植入和腦卒中治療后的長期生存情況。可以通過此類腦卒中模型在基因、細胞和電生理水平上進一步分析大腦神經系統疾病的發生發展機制。

Wu等[27]使用自體血栓誘導建立恒河猴腦卒中模型,通過微導管將血栓插入恒河猴右大腦中動脈M2段的末端,術后通過血管造影和MRI確認模型構建成功,使用該模型驗證了鼻內遞送鼠尾草素A可有效減小梗死體積,并改善神經系統預后。鼻內給藥可以將藥物直接輸送到中樞神經系統,研究前景廣闊,因NHPs給藥方法和裝置與人類臨床情況相似,能更加準確地評估受試藥物的安全性和有效性。Ramsay等[28]使用自體血栓誘導的兩只雄性恒河猴卒中模型,發現了卒中前后在大腦和血液中高度差異表達的九個基因,通過測定血液轉錄組學,有望確定用于評估神經保護的生物標志物,以對卒中發生發展進行及時有效的表征。

3.2.2 微導管/球囊法

使用微導管或球囊構建NHPs腦卒中模型相對容易,但成本較高[29],使用固定尺寸的微導管或球囊難以阻塞不同尺寸和角度的MCA。但是,在再灌注之前或之后通過該模型中的微導管局部輸注纖溶劑或神經保護藥物,靶組織中藥物濃度更高[30],因此可能更適用于新型藥物的功效驗證研究,或用于局部藥物輸注作為血栓切除術的輔助治療手段研究。

Wu等[31]用16只恒河猴對比了兩種血管內缺血模型的梗死面積、神經功能和生存率。與血栓栓塞組相比,微導管或球囊栓塞的動物偏癱更為嚴重、梗死面積更大、Spetzler評分更低、死亡率更高。在血栓組中,血栓要么靠近注射部位(M1),要么被沖到MCA的上部(M2),未見血栓溶解。M2栓塞所有動物均存活,M1血栓栓塞組有50%的動物死亡。微導管法的優點包括栓塞部位、梗死面積易于控制,缺血誘導時間較短、缺血再灌注時間可控;缺點是梗死范圍較大和MRI檢測出現偽影。血栓注射法的優點包括發病機制與臨床有可比性,梗死面積較小,死亡率低并且可能用于溶栓治療的評價研究,缺點是操作技術更為復雜和難以控制栓塞確切位置。兩種模型在臨床上的重要差異,為進一步研究急性缺血性卒中的血栓栓塞提供了技術支撐。

3.2.3 線栓模型

該法是將一端涂有熱熔性粘合劑的尼龍線插入頸內動脈,并推進至MCA構建缺血性腦卒中,可以通過抽出尼龍線誘導再灌注[32]。這種方法手術過程簡單,創傷小,可以嚴格控制缺血時間,因此在構建嚙齒類動物腦卒中模型中廣泛應用。在臨床上很難研究閉塞血管再通后,伴隨人類大腦相關變化的細胞病理改變,NHPs線栓MCAO模型可以幫助我們更好地理解這一點。Yeo等[33]使用恒河猴線栓模型,揭示了表達CD68的小膠質細胞/巨噬細胞可能通過分泌 TGF-β引起長期抗炎作用,因此調節內源性CD68+小膠質細胞/巨噬細胞可能是潛在的治療靶點。但臨床腦卒中患者的血管栓塞通常不完全,且伴隨著緩慢的自發性再灌注,進行溶栓治療時完全溶解也需要30 min到數小時[34],與拔出線栓引起的即刻再灌注完全不同,而且用于制備模型的線栓直徑對動物體重有嚴格的要求。這種模型不適合用于溶栓研究,但是栓塞再灌注損傷與臨床血栓剝離手術治療后的再灌注類似。

與手術方法相比,血管內介入方法對實驗動物的創傷較小;模型重復性較好;直接在血管內進行阻塞,更接近于人類腦卒中的病變微環境,因此逐漸得到廣泛應用。但是也存在梗死部位不精確;手術技術要求高;使用成本高等局限性。

3.3 光化學誘導法

光化學誘導法手術創傷小,死亡率低,可以控制梗死的部位、大小和程度,具有良好的可操作性和可重復性。使用大鼠構建光化學模型時,其神經功能會在誘導后2周內恢復,而在絨猴中的研究發現NHPs光化學模型恢復較慢,可導致持續的運動功能缺陷,因此更適用于研究卒中后運動功能恢復及用于臨床評分標準的建立[35]。目前已經建立了食蟹猴、絨猴和恒河猴等多種光化學誘導的NHPs腦卒中模型。Yang等[36]證實circSCMH1可顯著改善光化學法誘導的恒河猴腦卒中模型的神經功能損傷程度并促進運動功能恢復,從環狀RNA層面揭示了缺血性腦損傷后神經功能修復的新機制,并且為環狀RNA的中樞靶向遞送策略研究提供了新思路。然而,光化學法誘導的梗死部位通常位于遠端,溶栓劑可誘導再灌注,但再灌注時間卻難以控制。

4 總結與展望

NHPs腦卒中模型經過多年發展,已經在疾病防控、機制探索、治療及預后等研究中廣泛應用。最早用于研究腦卒中的NHPs模型是經眶放置充氣球囊的狒狒永久性大腦中動脈閉塞模型[2],永久性模型具有典型的腦損傷特征,常用于卒中后腦部病理生理學研究。電凝法也用于構建永久性腦卒中模型,且梗死部位明確,適用于閉塞皮質表面小血管。為了更好地了解繼發性再灌注損傷和隨后的微血管衰竭,NHPs缺血再灌注模型受到關注,較常用的如立體定向注射ET-1、丙二酸鹽誘導血栓形成模型,適用于抗血小板和抗血栓藥物的治療康復研究;血管內介入法放置自體血凝塊,是分析取栓和溶栓最理想的動物模型;使用微導管或球囊構建NHPs腦卒中模型,更適合用于神經保護藥物功效評價;而使用NHPs構建線栓模型,更適用于研究腦卒中發生和再通前后腦部細胞和免疫變化。伴隨著建模手段的發展,研究使用的NHPs種類也逐步增加,較早使用的缺腦回物種如絨猴、松鼠猴等多用于運動及神經功能損傷情況研究,且光滑皮層更適合進行電生理檢查,多腦回物種狒狒、恒河猴、非洲綠猴以及食蟹猴等與人類更相似,可以有效評估學習運動等高級功能。然而,對于哪一種NHPs中風模型最接近模擬人類病理和生理狀況,目前還沒有共識[4]。

迄今為止,大多數NHPs腦卒中模型尚未考慮共病因素,例如糖尿病和高血壓,構建共病模型對提升臨床相關性非常重要。此外,目前的NHPs模型都主要用來研究急性期神經保護劑的效果以及再灌注引起的神經功能改變[37],但神經修復階段的相關研究,則需要在亞急性和慢性階段進行,此類NHPs模型標準化還需要進一步推進。值得注意的是,目前唯一一種成功轉化的缺血性腦卒中治療方法——溶栓術,其臨床數據來自兔模型,而在狨猴腦卒中模型治療中顯示陽性結果的藥物NXY-059,卻并未在臨床研究中顯示出神經保護作用[3],多物種多因素的實驗研究不可或缺。總之,臨床前研究應著眼于將腦卒中有效治療手段從實驗室成功轉化到臨床,采取“嚙齒類動物-NHPs-人類”的思路有望有效提升轉化效率,降低治療風險。