糖尿病心肌病體內與體外模型研究進展

劉 倩姚雨峰蔡 琳*張冬卉*

(1.湖北大學生命科學學院生物催化與酶工程國家重點實驗室,武漢 430062;2.華中科技大學生命科學與技術學院,武漢 430062 )

糖尿病是一種以持續高血糖為特征的常見代謝性疾病,截至2021年全球已有5.37億糖尿病成人患者,相較于2019年增加了0.74億患者[1]。糖尿病人群中約90%屬于是2型糖尿病,主要由于機體代謝水平改變引起肌肉、脂肪等外周組織產生胰島素抵抗和進行性的β細胞功能衰竭所導致[2]。國際糖尿病聯合會(International Diabetes Federation,IDF)調查顯示,糖尿病患者相比于非糖尿病人群患心血管疾病的可能性要高2～3倍,并且心血管并發癥是糖尿病病人死亡的首要原因[3]。

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)于1974年由Riff等[4]提出,是在排除高血壓、冠心病、心臟瓣膜病等心臟疾病后,患者會出現的心肌結構和功能障礙。DCM在疾病早期僅表現出心臟舒張功能受損,收縮功能正常;隨著病情進展,心臟出現收縮功能減低,最終導致心衰[5]。但由于影響該疾病發生的因素復雜,DCM的致病機理仍未完全闡明。目前除了臨床上對糖尿病患者的研究外,通過建立糖尿病動物模型和細胞模型成為進一步闡述DCM關鍵生理過程的主要研究手段[6]。但動物與人類因種屬生理活動等方面存在差異,本文除分析傳統基于基因修飾和飲食誘導的DCM動物模型與動物來源的細胞模型外,進一步總結了基于人多能干細胞誘導的心肌細胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSCCMs)能夠作為人類原代細胞的代替物,在平面單層細胞和基于人體工程心臟組織(human engineered heart tissue,hEHT)的三維組織結構來研究DCM的病理生理過程,有利于深化對DCM機制的理解和藥物篩選方面的應用。

1 糖尿病心肌病疾病動物模型

DCM的病理生理過程,具體涉及心肌結構和功能、心肌代謝方式以及心律失常等方面的改變[6]。為了探究DCM的致病機理,動物模型是目前在疾病模擬、藥物篩選和臨床前研究等方面不可或缺的體內模型。其中大鼠、小鼠是研究疾病機理的重要工具。

1.1 基于遺傳性肥胖和糖尿病的DCM動物模型

DCM模型采用的遺傳性基因缺失小鼠主要有ob/ob和db/db小鼠兩類,其中ob/ob小鼠是由瘦素基因缺失引起了極度肥胖和代謝異常;而db/db是瘦素受體缺失導致瘦素信號通路異常,出現肥胖和糖尿病。在用于DCM評價時,兩種小鼠均會出現明顯的心肌肥大和纖維化,心肌細胞出現脂質堆積和凋亡;心肌能量代謝方面也比較類似,均為葡萄糖的氧化能力降低,更多使用脂肪酸作為代謝底物,導致線粒體氧耗增加,ATP產生效率卻降低,氧化應激水平增加,進而引起蛋白質氧化、脂肪變性以及線粒體和基因組的DNA出現損傷[7]。不同點在于心臟超聲評價時,ob/ob小鼠主要表現出舒張功能障礙而收縮功能僅部分受損,而db/db小鼠會同時出現心臟舒張和收縮功能異常[8]。此外,db/db小鼠在與正常小鼠心率相當的情況下,給予腎上腺素刺激后會出現心率不齊的癥狀[9]。

用于DCM研究的遺傳缺陷大鼠有3種,包括從肥胖型Zucker大鼠中篩選出的能發展成嚴重2型糖尿病的近交系ZDF大鼠(Zucker diabetic fatty rats,ZDF rats),多基因連鎖的肥胖糖尿病OLETF大鼠(Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rat,OLETF rats),以及從Wistar大鼠篩選的無肥胖但具有胰島素抵抗的近交系GK(Goto-Kakizaki,GK)大鼠。它們均會出現明顯的心肌舒張功能障礙,心肌結構出現纖維化、肥大和凋亡,同時出現線粒體氧化應激和功能障礙[10-12]。相較而言,ZDF大鼠能模擬的DCM表型最多,包括出現心率失常、心肌鈣處理異常、糖脂氧化水平改變和炎癥增加等[13-14]。GK大鼠除未出現明顯的心律失常和心肌細胞脂質累積外,DCM的其它表型都能模擬。OLETF大鼠則更偏向糖尿病的進展過程,后期逐漸出現胰腺功能減退和糖尿病腎病,不能模擬糖脂代謝轉變和心律失常等過程[15]。

1.2 飲食誘導的DCM模型

目前關于飲食誘導產生DCM動物模型的方式有兩類,一類是單純通過高糖和/或高脂飲食的長時間喂養形成的動物模型。小鼠高脂喂養6個月會出現明顯的心臟舒張和收縮功能減低、心肌肥大和鈣離子處理異常[16]。通過高蔗糖喂養則會引起大鼠全身胰島素抵抗,在喂養早期(2.5周)即出現心臟舒張功能異常,10周會出現收縮功能異常,肌漿網的鈣離子吸收降低和心肌結構異常[17]。高糖加高脂的誘導模式會加速小鼠肥胖、心肌舒張、收縮功能障礙損傷和心室擴張等改變[18-19]。兩種誘導方式通過肥胖和胰島素抵抗方面影響心肌結構、功能和代謝表型,可以觀察到疾病早期的心臟舒張功能異常,但存在誘導時間長和成本高的問題。另一類方法是通過高糖高脂短時間喂養(4周)加上損傷胰島β細胞的藥物鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)單次低劑量腹腔注射,誘導大小鼠出現肥胖、糖尿病癥狀和DCM表型,可有效縮短造模時間并提高成功率,但缺點在于STZ用量不易控制且容易引起因胰島功能喪失導致的1型糖尿病和非心臟表型[20]。

DCM病人心肌早期最明顯的特診為心臟舒張功能受損,具體表現為左心室充盈和舒張時間延長,隨著病程進展,隨后逐步出現心臟收縮功能下降、左心室擴張和心衰的癥狀[21-22]。上述幾種動物模型都能較好的模擬出這些表型。

2 DCM細胞模型

合適的細胞模型對于探討DCM詳細的分子機制以及各種單因素的影響有不可或缺的作用。由于DCM進展過程中心肌細胞受多種復雜因素影響,構建模型模擬心肌細胞在體內受到多種壓力產生的細胞表型,是研究者們一直想解決的問題。本文歸納了目前常用的心肌細胞類型與各自的特點和適用范圍。

2.1 原代心肌細胞

原代新生大鼠心室肌細胞(neonatal rat left ventricular cardiomyocytes,NRVMs)是最常用的研究心肌細胞生理功能的細胞模型[23]。通過使用高濃度(如33.3 mmol/L)的葡萄糖誘導或暴露在高濃度(如20 μmol/L)的棕櫚酸酯的培養基中,心肌細胞會表現炎癥反應、氧化應激、葡萄糖攝取量降低、脂肪酸攝取升高以及蛋白激酶(protein kinase B,PKB/Akt)磷酸化減少等DCM相關表型[24-25]。但受限于NRVMs分離過程復雜以及細胞難以轉染,在分子機制研究和藥物篩選方面存在較大困難。

直接分離糖尿病心肌病患者或者DCM動物的心肌細胞是研究細胞表型最理想的工具,但由于成體心肌細胞高度分化,在體外不能長時間培養和刺激,也不能增殖,故難以用于機制探究[26]。而糖尿病患者的心肌細胞不僅面臨以上問題,還需要事先通過嚴格的倫理審查和知情同意,資源稀缺更加難以開展研究。

2.2 動物心肌細胞系

大鼠心室H9c2細胞系和小鼠心房HL-1細胞能部分模擬心肌細胞表型,也在心臟研究領域被使用。HL-1細胞是心房細胞,H9c2是未成熟的心室細胞,其成熟度均低于NRVMs,所以這兩種細胞系并不能完全出現心肌細胞所有結構和功能。H9c2和HL-1在能量代謝方面存在差異,在DCM研究中會有選擇偏向性。H9c2細胞相比于HL-1細胞產生的ATP水平更高,線粒體結構成熟度和呼吸能力都更強,并且對缺氧-復氧損傷更敏感,因此H9c2在研究線粒體氧化應激相關表型時更常用[27]。有研究表明高尿酸引起H9c2細胞出現胰島素抵抗和ROS水平升高[28]。而HL-1細胞PGC-1α表達水平更高,常用于研究高脂肪酸誘導的糖脂代謝方式轉變[24]。

2.3 多能干細胞分化的心肌細胞

盡管嚙齒動物尤其是小鼠被廣泛用于包括心臟疾病研究的眾多醫學領域,小鼠心臟和人心臟在心率、心肌細胞大小、多核頻率以及肌球蛋白重鏈表達水平都存在明顯差異[29-30]。為了進一步的研究DCM的潛在機制,更加清楚的闡明疾病機理,建立基于人誘導性多能干細胞分化心肌細胞(hiPSCCMs)的疾病模型,成為一個理想選擇[31]。利用體細胞重編程技術可以將人類的白細胞、皮膚細胞、成纖維細胞或尿道上皮細胞等通過仙臺病毒、質粒轉染或者化學修飾RNA等方式獲得iPS細胞[32-34]。iPS可以通過特定誘導方法可以定向分化為心肌細胞、肝細胞、腎足細胞等人源功能性細胞[35-37]。由于iPSCs可編輯并且可以大量擴增,通過iPSCs可大批量獲得心肌細胞,一方面可以常規平面培養,為心臟疾病的機制探索和藥物篩選提供優良平臺;另一方面可以通過與水凝膠等基質膠混合制作成心肌微組織,直接進行心肌收縮功能測定、鈣成像等組織層面功能評價。hiPSC-CM在DCM的研究策略見圖1。

圖1 人誘導多能干細胞來源的心肌細胞在DCM研究中的應用Figure 1 Applications of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in Diabetic cardiomyopathy studies

2.3.1 平面培養的hiPSC-CM構建DCM模型

目前研究一般針對平面培養的iPSC-CMs采用改變培養體系來進行DCM模型構建,與NRVMs的誘導方法有類似之處,經典方法沿用Drawnel等[26]提出的策略,首先將iPSC-CMs培養在富含游離脂肪酸的培養基中促進心肌細胞成熟,然后采用含10 mmol/L葡萄糖、10 nmol/L內皮素-1和1 mmol/L皮質醇的培養基進行培養;經刺激的心肌細胞會出現心肌細胞收縮功能下降、心肌肥大標記物BNP的增加、氧化應激升高、鈣瞬變下降,以及不規則跳動頻率增加等表型。該條件雖然能滿足DCM模型所需具備的大部分要求,但缺乏心肌細胞胰島素敏感性和能量代謝方式改變的數據支撐。

針對DCM病人心肌細胞胰島素敏感性降低以及糖脂代謝方式轉變,可采用過量棕櫚酸酯刺激的方法實現。干細胞誘導分化的心肌細胞暴露于高濃度棕櫚酸酯培養條件,會出現葡萄糖攝取量降低,脂肪酸攝取升高以及胰島素信號下調;同時心肌細胞會出現收縮障礙和肌節長度減少[24-38]。但高濃度脂肪酸會對細胞產生脂毒性,在進行誘導時要控制其用量。

hiPSC-CMs采用平面培養的方式容易實現,對于從單因素、多因素以及多角度探究DCM表型和機制,大規模藥物篩選都有明顯優勢。但它也存在局限性,例如hiPSC-CMs成熟率與成人心肌細胞成熟率存在一定差距,并且DCM出現的心臟的舒張功能異常和心律失常無法模擬和研究[39]。利用hiPSCCMs構建成人體工程心臟組織(human engineered heart tissue,hEHT)可以進一步提高心肌細胞成熟度,并從組織水平表征心肌收縮力,可能會進一步拓展DCM研究的寬度和深度[40]。

2.3.2 iPSCs-CMs構建的hEHT應用于DCM研究

hEHT是將hiPSC-CMs與水凝膠(如細胞外基質,膠原蛋白)等細胞外基質膠混合制成條狀、片狀或其它適合檢測的心肌微組織進行培養,所建立的心肌組織能夠在一定程度上代替人心臟組織。與二維培養的心肌細胞相比,這種與基質結合的心肌細胞會表現出更成熟的特性[41]。hEHT可通過干細胞階段基因編輯和微組織培養時改變培養基環境來實現模擬疾病表征和體外模型構建,如肌聯蛋白突變導致的擴心病、兒茶酚胺多形性室性心動過速[42-43]等。雖然hEHT在DCM研究中鮮有報道,但基于它能直接表征心肌細胞整體的收縮力,hEHT可以在iPSC-CMs探索DCM模型的基礎上,分析DCM發展過程中心肌收縮力的變化,捕捉早期舒張異常的發生時間和條件;另一方面可以對DCM研究發現的關鍵分子進行基因編輯制作突變型iPSC,分化成心肌細胞并制作hEHT進行表型驗證。

EHT的細胞來源可以是原代大鼠心肌細胞也可以是由人多能干細胞分化而來的心肌細胞,隨著組織工程和生物醫學技術不斷發展和深度融合,以此構建的hEHT在未來應用于疾病模型或藥物篩選平臺具有一定潛力[44]。目前的臨床前測試評估副作用還存在一定的局限性,對于藥物的開發仍然受到阻礙,尤其藥物應用于臨床時發現的心律失常和心臟毒性,hiPSC分化的心肌細胞能夠對心臟毒性化合物做出反應,可以作為疾病模型,但目前所分化的心肌細胞不夠成熟,在基因表達,結構組織,對藥物的反應都與成熟心肌存在差異,將hiPSC-CM作為三維的EHT培養,能夠提高其成熟度,在進一步研究DCM機制與篩選相關藥物上具有巨大的潛力[39]。

利用hiPSC-CM構建的hEHT用于藥物篩選與建立三維DCM模型流程圖如圖2所示。

圖2 使用組織工程技術用于建立三維DCM模型流程圖Figure 2 Flow chart of generating a three-dimensional DCM model with tissue engineering technology

3 討論

本篇綜述主要總結歸納了目前研究糖尿病心肌病的體內和體外模型,并比較了各類模擬模型的優缺點和使用范圍。2018年葉婷等[45]對DCM動物模型的定義及其心臟功能表征進行了總結。而我們在歸納DCM動物模型的基礎上,對于細胞模型尤其是以iPSC來源人心肌細胞模型進行了歸納,比較了各種模型的優勢與不足。動物模型能從整體宏觀以及疾病發展進程的角度理解DCM,能夠模擬出較多的疾病表型。但其與人類基因存在差異,體內致病因素復雜,在研究具體致病機理上具有一定的局限性。而體外模型有助于從細胞和分子角度解析DCM的影響因素和機理。hiPSC-CMs具有在體外可長期培養以及能夠大量供應的優勢,是細胞模型較為理想的細胞來源。而iPS-CMs的成熟度不足等問題,是未來以人的是iPSCs分化的心肌細胞作為DCM疾病模型所需要面臨的挑戰,并且基于其平面單一細胞類型的培養條件,在研究心臟組織功能,心臟與其他器官之間的相互作用上具有局限性[39]。基于此,以心肌細胞建立的3D組織模型,通過將心肌細胞取向排列等方式,克服了部分在2D培養心肌細胞的限制因素,能夠在組織層面上去研究細胞間的互作與心肌組織功能,因而更加接近人體內心臟功能與生理環境。通過組織工程技術構建的微器官芯片,將不同微器官之間的連接,以達到體外模擬人體內生理環境,以此構建DCM疾病和藥物篩選體系具有良好的前景。