AD動物模型及其相關指標評價方法研究進展

謝曉露陳 秀寇利秋李亞玲*

(1.西南醫科大學附屬醫院藥學部,四川 瀘州 646000;2.西南醫科大學藥學院,四川 瀘州 646000)

阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以進行性記憶力下降、認知功能障礙、行為異常和人格失常等為主要臨床表現的神經退行性疾病[1]。AD的典型病理改變包括神經元丟失、β-淀粉樣蛋白(amyloid β,Aβ)沉淀形成的老年斑(senile plaque,SP)及tau蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)等[2]。全世界約3000多萬人患有AD,到2050年預計其患病人數將達1.15億[3]。據美國阿爾茲海默協會統計,AD已成為美國第六大致死原因,其導致的死亡人數從2000到2019年間增加了145%以上,在2021年造成的經濟損失高達3550億美元[4],給患者及其家屬帶來巨大的經濟負擔和身心壓力。到目前為止,臨床上還沒有任何一種有效的方法能治愈或有效的預防和緩解此病的發生發展,主要是因為AD病因多樣、病機復雜。因此,闡明AD發病機制、探索治療AD藥物是腦科學研究的重要課題。在醫學研究中,根據疾病構建動物模型對疾病發生機制、治療評價、前沿研究有著極為重要的意義,故而尋求一種合適的動物模型來模擬AD患者的病理特征和臨床表現及選擇恰當的方法來評估模型相關指標就十分重要。本文通過總結目前國內外常見AD動物模型及其相關指標的評價方法,以期為相關課題的研究選擇合適的動物模型和評價方法做參考,并為構建新型動物模型和發展新的模型指標評價方法提供新思路。

1 國內外常見AD動物模型的構建

目前,國內外常見AD動物模型分為轉基因AD動物模型和非轉基因AD動物模型。轉基因AD動物模型是通過重組DNA技術,將一個或多個外源性突變基因整合到動物的基因組中,從而表達AD的某些特征。常引入的突變基因包括淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因、早老蛋白(presenilin,PS)基因和tau蛋白基因等。非轉基因AD動物模型主要通過注射Aβ或tau蛋白、化學物質損傷膽堿能神經或致神經炎癥、金屬灌胃、老化、破壞腸道菌群平衡和物理手段制作而成。

1.1 轉基因AD動物模型

根據模型所表達的AD主要病理特征和使用動物,目前轉基因動物模型分為APP與PS轉基因小鼠、tau轉基因小鼠、APP/PS/tau轉基因小鼠、特殊轉基因小鼠、基因敲入小鼠和轉基因大鼠。

1.1.1 APP與PS轉基因小鼠

APP為一種Ι型跨膜蛋白,由21號常染色體上的APP基因編碼,該基因上有25個與AD相關突變,常用的包括印第安納突變(V717F)、瑞典突變(K670N/M671L)和倫敦突變(V717I)。PS基因分為14號常染色體上的PS1和1號常染色體上的PS2,目前對PS1的研究居多。這可能是因為PS1在腦內的表達量更高,表達PS1的小鼠發病年齡更早且疾病進展更為快速[5]。雖然PS單轉基因小鼠能形成AD相關的神經元和突觸喪失及血管病變,但不能形成淀粉樣斑塊,而將PS突變基因引入APP轉基因模型后,Aβ和斑塊顯著表達。

根據模型所攜帶的突變基因種類和數量,APP與PS轉基因小鼠可分為APP單轉基因小鼠、APP雙轉基因小鼠與APP/PS轉基因小鼠。這些模型以Aβ斑塊與認知和記憶功能障礙為主要特征,但因模型所攜帶的突變基因和啟動子不同,在形成時間和部位上有所差異,具體見表1。APP單轉基因小鼠至今已使用二十多年,特性明確,在繁殖與管理上更加簡便,但出現AD特征的時間較晚。APP雙轉基因小鼠與APP/PS轉基因小鼠雖然大多能相對較早地表現AD特征,但由于這些小鼠多為兩種攜帶單個或兩個突變基因小鼠雜交而來,遺傳背景的改變可能會對實驗結果產生影響。

表1 常用APP與PS轉基因小鼠Table 1 Commonly used APP and PS transgenic mice

1.1.2 tau轉基因小鼠

tau轉基因小鼠通過表達tau蛋白突變基因P301L和P301S,出現過表達的tau蛋白、NFTs、腦萎縮和行為障礙等,主要用于tau蛋白和治療藥物的相關研究。此類模型主要形成與額顳葉癡呆和帕金森病相關的tau蛋白病理,因此突變基因產生的tau蛋白在毒性和初始形成部位上與AD患者有差異,并且在小鼠上觀察到未在AD患者中出現的明顯的tau蛋白相關行為障礙[12]。

1.1.3 APP/PS/tau轉基因小鼠

為了更全面地模擬AD特征,通過雜交或轉入APP/PS/tau突變基因,研發出了能產生淀粉樣斑塊和NFTs的小鼠。這些小鼠與表達單一突變基因的小鼠相比,無論是在淀粉樣斑塊或NFTs的產生時間、面積或是數量上都占有一定優勢。但是淀粉樣斑塊的產生通常明顯先于NFTs。本類模型中,3XTg小鼠使用較為廣泛,其攜帶PS1M146V、APPSwe和tauP301L突變基因,在6月齡便出現淀粉樣沉積、神經炎性變、記憶和認知障礙,12月齡形成NFTs[13]。近來將5XFAD小鼠與tauP301L小鼠雜交得到的6XTg小鼠較5XFAD小鼠具有明顯優勢,在2月齡時出現更加顯著的淀粉樣斑塊,4月齡時在皮質與海馬體中的形成NFTs,認知和記憶缺陷也更早出現[14],但還需要更多的實驗證據支持和完善。

1.1.4 特殊轉基因小鼠

一些轉基因模型能特異性地表達AD某種特征,如Tg-SwDI小鼠和Aβ-GFP小鼠。Tg-SwDI小鼠表達APPSwe693Q/D694N突變基因,在3月齡時出現纖絲血管Aβ的大量積累和較不明顯的彌漫性實質斑塊,可用于CAA研究[15]。Aβ-GFP小鼠攜帶人Aβ1-42與GFP融合蛋白的DNA片段,在雞β-肌動蛋白啟動子的控制下,能在神經細胞內高表達Aβ寡聚體[16]。

1.1.5 基因敲入小鼠

為了避免上述轉基因模型的突變基因過度表達導致產生人為表型和影響疾病相關基因表達的研究,研發出了更為生理化的模型,即基因敲入小鼠。此類模型包括hAβ基因敲入小鼠、APP基因敲入小鼠、htau基因敲入小鼠和APP/tau雙基因敲入小鼠,具體見表2,可用于臨床前AD相關基因分子病理研究與AD預防研究。

表2 基因敲入小鼠Table 2 Knock-in mice

1.1.6 轉基因大鼠

轉基因大鼠也能表現出AD特征,與小鼠相比,在生理、基因和形態學上更接近人類,具有更加復雜的行為表現,腦部操作更容易[20]。但因其制作更加困難,有著更高的工藝要求而使用較少。TgF344-AD大鼠和McGill-R-Thy1-APP大鼠較常使用,前者通過表達APPSwe/PS1ΔE9突變而呈現AD完整的病理特征[21],后者通過表達APPSwe/V717F突變出現明顯的認知行為障礙[22]。

1.2 非轉基因AD動物模型

1.2.1 Aβ或tau蛋白損傷模型

腦內注射Aβ或tau蛋白能快速產生AD病理模型,大鼠因體積大、在海馬和腦室注射更加方便而最為常用。在單側或雙側海馬注射Aβ,短期內出現顯著的記憶力下降、Aβ沉積和磷酸化tau蛋白[23],用于研究SP所致的記憶障礙和神經炎性病變以及Aβ亞型在AD病變過程中的作用。當注射tau蛋白時可產生NFTs樣結構,并會加快tauP301S、5XFAD小鼠模型病理特征的形成[24-25]。這些模型雖能快速形成AD病理,但需反復注射達到穩定,很容易因注射不當導致Aβ或tau蛋白難以擴散至腦內,使局部濃度過高,造成局部損傷。

1.2.2 化學物質損傷膽堿能神經或致神經炎癥模型

該類模型以嚙齒類動物造模最為常見,少數研究使用斑馬魚和非人靈長類動物。根據化學物質造模的主要機制分為神經炎癥模型和膽堿能神經損傷模型,具體見表3。這些模型多采用腹腔或腦室注射的方式構建,建模成功與否很大程度上與注射規范程度和化學物質濃度相關。該類模型操作簡單,成模時間較短,但都難以形成NFTs。

表3 化學物質損傷膽堿能神經或致神經炎癥模型Table 3 Chemical substances damage cholinergic nerves or cause neuroinflammatory models

1.2.3 鋁損傷模型

鋁損傷模型通過AlCl3灌胃致使小鼠出現學習和記憶功能障礙[31]。該模型制作簡單,經濟,但只能表現單一的AD特征。通常與其他造模方法結合以加快AD病理形成。

1.2.4 老化模型

包括誘導老化模型、快速老化模型與自然衰老模型,具體見表4。誘導老化模型通過D-半乳糖誘導大鼠或小鼠產生,具有價格低、操作簡單、可重復性高的優點。快速老化模型以AKR/J小鼠作為祖先近交繁殖得到,具有實驗周期短,學習和記憶障礙的發生較誘導老化模型更加自然等優點,但發病機制復雜,對于單一機制的研究不太適宜。自然老化模型以非人靈長類動物或嚙齒類動物自然衰老構建。非人靈長類動物最接近生理化,能表現出SP,且大多能出現CAA,與人類遲發型AD最為相似。與非人靈長類動物相比,嚙齒類動物實驗周期更短,相對更加經濟且省時省力。

表4 老化模型Table 4 Aging models

1.2.5 人源性腸道菌群模型

朱華等[36]將AD患者糞便移植到小鼠體內,能表現出與AD患者相類似的腸道菌群結構,無SP,可用于菌群與AD關系、相關微生態制劑評價。

1.2.6 物理損傷模型

此類模型通過物理手段造成機體損傷,進而發展出AD相關的病理特征。如手術摧毀雙側海馬穹窿傘出現學習和記憶功能障礙[37];長期腦缺血老年小鼠出現明顯的腦組織萎縮與認知行為障礙[38]。但上述模型均無SP和NFTs,且造模成功率較低。

2 AD動物模型相關指標評價方法

認知與記憶功能障礙、核心生物標志物(Aβ和tau蛋白)與主要病理特征是否出現是評價動物模型制作成功與否的3個關鍵指標。認知與記憶功能障礙通過對實驗動物行為的評價而間接確定,核心生物標志物與主要病理特征通過免疫學或影像學方法確定。

2.1 行為學方法

常用的包括Morris水迷宮、Y型迷宮、Barnes迷宮、條件恐懼實驗(fear conditioning,FC)、新物辨別實驗(novel object recognition test)、曠場試驗(open field test),具體見表5。

表5 六種行為學評價方法Table 5 Six behavioral evaluation methods

2.2 免疫學方法

常用的包括免疫組織化學染色、免疫熒光染色、免疫印跡分析(Western blot)與酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。

免疫組織化學染色與免疫熒光染色主要操作步驟基本一致,經過組織切片的制備、抗原修復、雙抗孵育、顯色劑染色或抗熒光衰減劑封片,最后使用光學顯微鏡或熒光顯微鏡進行觀察,記錄目標抗原的分布與數量。這兩種方法常用于腫瘤的病理組織觀察分析。在AD動物模型應用上,常使用單克隆抗體(如2G3、21F12、3D6、8E5、BS42、AT8等)、抗氧化應激抗體、大鼠抗小鼠CD45抗體與牛抗小鼠GFAP抗體等用于APP、Aβ肽及其各種多聚體、SP、氧化應激、tau蛋白及磷酸化tau蛋白、小膠質細胞、星形膠質細胞等的定位或定量分析。這兩種方法應用較為廣泛,能可視化地對病理組織進行分析,雖然使用二抗間接標記提高了方法的靈敏度和準確性[44],但傳統方法仍面臨著抗體種屬來源少,只能同時標記一到三種標記物與染料重疊帶來的信號識別等問題[45]。

Western blot和ELISA主要用于蛋白質的定量分析,在低濃度蛋白的檢測上更為敏感,具有更高的準確性與精確性。在AD模型的研究上,Western blot和ELISA用于APP及其蛋白水解產物、突觸蛋白、tau蛋白等的定量檢測,后者還用于白介素、堿性成纖維生長因子的定量分析。Western blot主要操作步驟包括腦組織勻漿制備、BCA法蛋白定量、凝膠電泳與濕法轉膜、雙抗孵育、化學發光顯影與定影及測定蛋白表達。該方法操作復雜繁瑣,實驗變量多,結果不穩定,需要耗費大量時間與精力探索實驗條件[46]。ELISA操作較為簡單,分為間接ELISA和競爭或阻斷ELISA,主要包括制備腦組織勻漿、雙抗孵育、加入底物與酶結合成色,酶標儀測試OD值。該方法不足之處在于會因顯色不明確導致假陽性結果,或因與平板非特異性結合導致高陽性結果[47]。

2.3 影像學方法

分子影像學方法即在分子和細胞層面對活體生物進行無創或微創的生物學過程的成像分析,主要用于腫瘤、冠心病等方面的診治。在AD動物模型的應用上,常使用核磁共振成像(MRI)、功能磁共振成像(fMRI)、正電子發射斷層掃描(PET)、熒光成像等對實驗動物海馬、大腦皮層、小腦、灰白質宏觀與微觀結構變化或淀粉樣斑塊進行評估。Sidiqi等[48]利用姜黃素進行熒光成像發現小鼠視網膜上淀粉樣斑塊可作為腦中淀粉樣斑塊用于AD早期診斷的替代。影像學方法具有靈敏性高、分辨率好等特點,但價格偏高,熒光成像相對便宜。

3 總結與展望

多年來,研究人員已利用轉基因技術與各種理化方法制備了大量的AD動物模型,各模型各有特點,但都無法完美復刻人類AD:轉基因動物模型具有復雜的生化、病理和認知行為學特征;采用理化手段制備的非轉基因動物模型在進行單一致病因素導致的認知行為障礙相關研究上更具優勢,且更具經濟性;非人靈長類動物與人類具有遺傳相似性,其病理生理發展過程和人類遲發型AD更相似,但受限于經濟、倫理、表型和病理出現時間不一致等問題而較少進行相關研究[34];基因敲入小鼠可能是更具代表性的生理化AD模型,但仍需在未來的研究中進一步證實。這些模型被廣泛用于AD發病機制、影響因素和治療藥物的開發與驗證中,并在藥物臨床前研究中取得了不錯的成績。但這些成果在臨床的轉換率卻較低,可能是因為AD復雜的病因和病機及實驗動物與人類間的種屬差異,即使實驗動物表現出相似的病理與癥狀,復雜的內在機制卻有所差別。而將人類干細胞來源的神經細胞移植到嚙齒類動物大腦中可能解決上述問題,得到最接近生理的AD動物模型,但難以用于研究免疫系統和神經間的相互作用,故該方法仍需未來的進一步開發研究[49]。鑒于此,在進行AD相關研究時有必要根據各種建模方法的特點將多種方法結合進行動物模型的構建,或者在多個動物模型中進行研究,以確保臨床前研究成果最大可能地轉化為人類臨床試驗。在評定所制備的模型是否達標上,未發現統一的評價標準。并在對同一模型評價時,同一指標對不同方法的敏感性有所差異導致評價結果不同。因此,建議選用多種方法配合,如選用1～2種行為學方法評價認知與記憶功能以及2～4種免疫學或影像學方法評價腦內核心標志物和組織病理特征。