“FD工藝”對醬香型白酒堆積過程真菌群落結構和酒體品質的影響

稅梁揚，梁 濼，周 帥，楊明永，袁思棋，3，張峰華，王浩杰，張世強，范宏筠，

（1.瀘州國之榮耀酒業有限公司，四川瀘州 646000；2.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000；3.瀘州老窖集團有限責任公司，四川瀘州 646000)

醬香型白酒釀造工藝十分復雜，“堆積發酵”是醬香型白酒必不可少的重要環節之一，堆積發酵是在一個開放性的環境中，使酒醅與空氣充分接觸，網羅富集環境微生物。堆積過程產生的醬香前體物質也為微生物進一步生成醬香風味物質提供了作用的底物。因此，堆積發酵在培菌、產酒、生成醬香或醬香前體風味物質的同時為微生物入窖發酵產生醬香風味物質創造了必要條件。

在堆積發酵階段，堆子各位點酒醅發酵狀態常出現差異性，進而導致酒醅發酵不徹底或發酵過度，酒醅發酵狀態受影響，最終導致酒的質量和產量受到影響。張維山等根據實際生產以酒醅堆積發酵進行倒堆和不倒堆對照實驗，結果顯示經過倒堆的堆子升溫平穩，各位點溫度更趨一致，升溫層整體加厚，堆積時間相應延長；堆積結束后，酒醅香濃郁、果香悅人，松散、無板結現象。堆子“不來溫”或部分位點升溫，導致堆積發酵時間的延長，尤其在冬季更易發生，卓毓崇等發現采用破堆移位能夠有效提高出酒率；袁再順等采用破堆移位的方法處理后能夠有效促進微生物的生長繁殖。根據醬香型的實際生產，王邦坤等得出堆積酒醅的疏松度和含氧量對各種菌系的生長繁殖影響較大。

早先是通過分離培養鑒定微生物，但環境中可培養的微生物只占到1%，限制了分離培養鑒定方法的使用范圍。隨著現代的分子生物學方法不斷發展，有效規避了分離培養鑒定方法，可以直接提取環境中的DNA 用于后續分析，諸如DGGE，FISH，T-RFLP 以及克隆文庫測序，但以上技術受到通量的限制，如克隆文庫測序，一次研究只能檢測幾百條序列。高通量測序技術又稱第二代測序技術，一次性可對幾百萬到十億條DNA 分子進行并行測序，具有高通量、快速、高精度、實時監控、數據信息量大等特點。

醬香型白酒釀造過程中的酒醅堆積發酵環節，有時會出現升溫不均或升溫過于緩慢，隨著機械化在白酒生產過程的應用，機械設備對酒醅物理特性的影響，特別是氣溫較低的一輪次、二輪次，為堆積發酵最長的兩個輪次，更易出現堆積發酵升溫異常等現象。溫度直接影響微生物生長繁殖、種類和數量，從而影響酒醅發酵狀態，以及基酒的產量和品質。傳統醬香型白酒的堆積為蒸煮蒸餾后的酒醅一次性堆積至所需溫度48 ℃左右，即入窖發酵，酒醅層次起溫幅度不盡相同，進而影響酒醅在各位點發酵狀態。基于此對傳統堆積模式進行改良，形成“FD 工藝”：當堆積品溫達到43～45 ℃時，對堆積酒醅進行破堆、攪拌，外層酒醅移至內層，內層酒醅移至外層，底層移至頂層，頂層移至底層，實現內部酒醅與外部酒醅、底層酒醅與頂層酒醅互換的原則，再次進行堆積發酵。“FD 工藝”操作時酒醅體系經破堆、攪拌，重新引入大量氧氣，改善酒醅體系的溶氧水平，促使微生物再次生長繁殖，優化和豐富酒醅體系微生物群落結構，提升微生物種類和數量。

基于此，本實驗以正處于冬季的第二輪次醬香型白酒發酵酒醅為研究對象，采用“FD 工藝”對醬香型白酒堆積階段酒醅進行實驗，運用高通量測序技術分析堆積酒醅中真菌群落結構，初步探索“FD工藝”對醬香型白酒堆積酒醅真菌群落結構及其出酒數量和質量的影響，以期為大規模醬香型白酒生產提供有力的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒醅樣品：均來自于瀘州國之榮耀酒業有限公司醬香白酒發酵車間。

試劑與耗材：酚酞（成都科隆化學品有限公司）；氫氧化鈉、硫酸（天津市光復精細化工研究所）。樣品試劑均為分析純。

儀器設備：數顯溫度計，上海儀電科學儀器有限公司；E.Z.N.A.? Soil DNA Kit DNA 抽提試劑盒，美國Omega 公司；FastPfu Polymerase，北京全式金生物技術有限公司；ABI GeneAmp?9700 型PCR儀，美國ABI 公司；DYY-6C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；氣相色譜Agilent 123-7062UI，美國安捷倫科技公司。Illumina MiSeq 高通量測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 酒醅取樣方法

本項目以第二輪次堆積發酵階段的酒醅作為研究對象，取樣方法參考胡小霞等的研究方法分別對堆子頂層、中層、底層進行混合采樣（圖1）。采樣時間間隔1 d，4 d 取樣前進行“FD 工藝”操作，整個堆積發酵持續5 d，將收集的酒醅樣品充分混勻后儲存在-80 ℃冰箱中進行后續分析。傳統堆積發酵工藝組酒醅樣品編號為C 組，“FD 工藝”組酒醅樣品編號為F組。

圖1 堆積酒醅取樣點示意圖

1.2.2 真菌群落分析

使用FastDNA?SPIN 土壤試劑盒提取酒醅真菌總DNA，真菌引物采用ITS1F (5'-GTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和下游引物ITS2R(3'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-5')對基因組ITS1F_ITS2R區域擴增測序分析，擴增產物利用Illumina 公司的Miseq PE300 測序平臺進行高通量測序。

1.2.3 出酒量及香味物質成分分析

根據GB/T 10345—2007 中指示劑法測定總酸總酯。

酒體香味物質成分采用氣相色譜分析法,相關GC 分析條件：揮發性物質的檢測使用Agilent 123-7062UI 氣相色譜系統，采用DB-WAX 氣相色譜柱（60 mm×320 μm×0.25 μm）以氦氣（He，純度＞99.999%）為載氣（流速1.2 mL/min）的條件下分析樣品，分流比30∶1，程序升溫如下：初始溫度40 ℃保持3 min，2 ℃/min 升至50 ℃，保持0 min，4℃/min 升 至80 ℃，保 持0 min，6 ℃/min 升 至150 ℃保持0 min，8 ℃/min 升至200 ℃保持0 min，最后以10 ℃/min 升至230 ℃保持3 min，進樣口溫度240 ℃，檢測器溫度250 ℃。

1.3 數據及圖片處理

應用上海美吉公司在線云平臺（https://cloud.majorbio.com）進行測序數據分析。分析參數序列降噪方法：DADA2，物種注釋數據庫:silva138/16s_bacteria，物種注釋方法:bayes，分類置信度：0.7。

2 結果與分析

2.1 Alpha多樣性指數

Alpha 多樣性分析是分析微生物多樣性的一個重要指標，用于研究某一生境內（或樣本中）的群落多樣性。通過計算Sobs 指數和Ace 指數以確定物種豐富度，Shannon 指數和Simpson 指數以確定物種多樣性，用來描述堆積酒醅樣品中真菌群落的多樣性。

由表1 可知，表中Sob 值和Chao 值反映真菌群落豐富度。Sob 值和Chao 值在使用“FD 工藝”前后有較大的差異，即在“FD 工藝”堆積過程中，隨著溫度的升高再次對真菌菌群進行了富集、篩選和馴化。傳統堆積發酵工藝組C1—C5，真菌在經過高溫等一系列條件篩選后，入窖時C5 豐富度值變為19；“FD 工藝”組F1—F3 真菌數量經過篩選Sob 值變為39，經過“FD 工藝”后Sob 值增加至74，當達到入窖池條件F5時Sob值為72，顯著高于C5（19）。

表1 Alpha多樣性指數

表1 中Shannon 指數反應真菌群落多樣性。“FD 工藝”使用后的酒醅Shannon 指數呈動態變化趨勢，傳統堆積發酵工藝組C3 指數為1.518424，C4為0.315085，入窖時C5 為0.728729；“FD 工藝”組在堆積發酵F3 時指數為0.834332，經過“FD 工藝”后F4 指數為1.806771，真菌Shannon 指數顯著增加，入窖時指數F5為1.588978，顯著高于傳統堆積發酵入窖C5值0.728729。

在堆積發酵過程中，傳統堆積發酵產生高溫條件對真菌群落進行富集和篩選，真菌豐富度和多樣性顯著減少，經過“FD 工藝”操作后堆積酒醅大量引入氧氣，增加酒醅溶氧量，再次富集和篩選環境微生物，有利于微生物生長繁殖，使“FD 工藝”組酒醅微生物豐富度多樣性大幅上升，明顯多于傳統堆積發酵。

2.2 稀釋曲線分析

稀釋曲線（Rarefaction curve）主要是用來比較不同測序數據量的樣品中物種的豐富度、均勻度或多樣性，可以表示樣品的測序數據量是否合理。由圖2 可知，發酵酒醅樣品的稀釋曲線平整，說明每個樣品的測序數據足夠大，測序深度足夠反映樣品中絕大多數的微生物多樣性信息。

圖2 酒醅樣本中真菌稀釋曲線

2.3 PCA分析

PCA 分析（Principal Component Analysis）即主成分分析，是能夠有效地找出數據中最“主要”的元素和結構、去除噪聲和冗余、降低原始復雜數據的維數、揭示隱藏在復雜數據背后的簡單結構的一種簡化數據分析技術。

以微生物屬水平進行PCA 分析（圖3），平面二維坐標表示選取的兩個主成分，第一主成分貢獻值為29.82%，第二主成分貢獻值為19.34%。

圖3 屬水平上PCA分析

醬香型白酒的突出特點是高溫堆積和高溫發酵，在酒醅的堆積過程中溫度不斷升高，根據圖3可以看出，在經過溫度的篩選后，F1、F2、C2 在同一象限，C3、C4、C5、F3、F4、F5 在同一象限，表明F1、F2、C2 的物種相似度高，C3、C4、C5、F3、F4、F5 的物種相似度較高。以上結果說明“FD 工藝”處理不會破壞堆積酒醅的真菌群落結構。

2.4 真菌群落組成成分分析

2.4.1 門水平上真菌群落組成

基于門水平的真菌群落組成情況如圖4 所示，相對豐度≥1%檢測出有子囊菌門Ascomycota 和擔子菌門Basidiomycota，其中子囊菌門占絕對優勢，相對豐度占96.24%～99.99%，且隨著堆積時間的延長而增加。相關研究表明子囊菌門Ascomycota是醬香型、清香型、濃香型釀造酒醅的主要真菌，說明該菌門是中國白酒發酵過程中的關鍵真菌微生物種群。擔子菌門Basidiomycota 在醬香型白酒第二輪次堆積發酵階段酒醅中相對豐度為0 %～3.25%。傳統堆積發酵工藝的5 個樣本中，擔子菌門Basidiomycota 的相對豐度呈下降趨勢，C5 幾乎未檢出。酒醅進行“FD 工藝”后，與傳統堆積發酵工藝相比，擔子菌門Basidiomycota 相對豐度有所增加。

圖4 門水平真菌群落結構組成

2.4.2 屬水平上真菌群落組成

基于屬水平上真菌群落組成如圖5 所示，其中相對豐度≥1 %的有13 個屬，包括紅曲霉屬、嗜熱真菌屬s、未分類曲霉菌屬、畢赤酵母屬、絲衣霉屬、復膜孢酵母屬、嗜熱子囊菌、、伊薩酵母屬、曲霉菌屬、節擔菌屬、假絲酵母屬、孢圓酵母屬。

醬香型白酒在堆積發酵過程中，紅曲霉屬在傳統工藝的相對豐度較高，C4、C5分別為93.75 %、76.76 %，在“FD 工藝”相對豐度較低，F4、F5 分為52.09%、8.75%，紅曲霉屬在酒醅進行“FD 工藝”后相對豐度呈急速下降趨勢（圖5）。紅曲霉屬最適溫度為32～35 ℃（F4溫度為32.7 ℃，F5的溫度為49.3 ℃），生長最適pH3.5～5，耐pH3.5，嗜乳酸，說明“FD 工藝”不利于紅曲霉屬的生長。黃蘊利等發現在第二輪次酒發酵過程中紅曲霉屬僅占1.31 %，與本研究的“FD 工藝”處理后的入窖前糟醅真菌類微生物豐度接近，與傳統工藝有顯著差異可能是本研究的傳統堆積工藝酸類物質持續積累（傳統堆積發酵工藝酒醅酸度達到3.05 mmol/10 g顯著大于“FD 工藝”酒醅1.59 mmol/10 g），有助于該屬微生物的大量生長和繁殖，“FD 工藝”組經破堆、攪拌和再堆積發酵后，引入大量的氧氣，使得酒醅中微生物再次生長繁殖，并使得酒醅中的酸類物質分配比較均勻而避免持續積累。

圖5 屬水平真菌群落結構組成分布

嗜熱真菌屬在傳統工藝中相對豐度呈下降趨勢，C3、C4、C5 相對豐度分別為11.53%、0.53%、0.22%。“FD 工藝”組F3、F4、F5 分別為2.98%、8.27%、1.91%（圖5），在酒醅進行“FD工藝”后相對豐度上升。嗜熱真菌屬是白酒釀造過程中重要酶類的來源，可促進微生物的生長和繁殖，促進產酒生香，同時對醬香型白酒制酒環境的適應性較好。

嗜熱子囊菌在傳統工藝呈下降趨勢，C3、C4、C5 相對豐度分別為1.15 %、0.10 %、0.01 %。“FD 工藝”組F3、F4、F5 分別為1.58 %、3.25 %、0.61 %（圖5），經“FD 工藝”處理后呈增加趨勢（相對比例從1.58%增加到3.25%）。

曲霉菌屬在傳統工藝中相對豐度呈下降趨勢，C3、C4、C5 的相對豐度分別為5.12%、4.04%、0.90%。“FD 工藝”組F3、F4、F5 分別為2.21%、8.69%、2.92%（圖5），在酒醅進行“FD 工藝”后相對豐度有所上升（相對比例從2.21 %增加到8.69 %）。曲霉菌屬在傳統工藝中相對豐度呈下降趨勢，C3、C4、C5 的相對豐度分別為0.37 %、0.01 %、0 %；“FD 工藝”組F3、F4、F5 分別為0.25 %、0.67 %、0.18 %，在酒醅進行“FD 工藝”后相對豐度上升（從0.25 %增加到0.67 %）。本研究采用“FD 工藝”的曲霉屬變化情況與張春林等所研究的曲霉屬相對豐度（2.70%）變化趨勢基本一致。曲霉菌為絲狀真菌，代謝產生多種酶類、有機酸、脂肪酸等產物，對纖維素和淀粉質大分子物質的降解發揮顯著作用，還可以促進芳香類物質的產生，提高醬香型白酒的酒體風味物質和品質。

畢赤酵母屬在傳統工藝中相對豐度較低，C3 為2.21%，C4 幾乎未檢出，C5 的相對豐度為1.62 %；在“FD 工藝”中相對豐度較高，呈上升趨勢，F3 為3.43 %，F4、F5 相對豐度分別為19.66 %、71.62 %（圖5），說明“FD 工藝”后的酒醅發酵環境適合畢赤酵母屬的生長。本次研究傳統堆積發酵組的畢赤酵母屬豐度情況與張春林等研究第二輪次真菌屬畢赤酵母屬相對豐度（0.26%～2.09%）相近；采用“FD工藝”實驗組的酒醅畢赤酵母屬遠高于傳統堆積發酵組，以及張春林等的研究結果。畢赤酵母屬屬于耐高溫酵母菌，是酒醅發酵過程中產乙醇和產酯的功能菌。

絲衣霉屬在傳統工藝中相對豐度呈上升趨勢，C3、C4、C5相對豐度分別為4.66%、1.26%、19.44%，在“FD工藝”中相對豐度呈下降趨勢，F3 為1.91 %，F4 相對豐度為0.82 %，F5 幾乎未檢出（圖5）。“FD 工藝”不利于絲衣霉屬的生長。絲衣霉屬在傳統工藝中隨著堆積時間的延長而逐漸增多，產生的原因是酒醅在堆積過程中酸度的變化為該菌的生長提供了適宜的條件。本研究“FD 工藝”實驗組絲衣霉屬豐度較低，與黃蘊利等的研究中醬香型白酒酒醅第二輪次真菌屬中絲衣霉屬僅4.65%相近，說明“FD 工藝”能夠平衡酒醅酸類物質積累所導致的菌群持續增長的趨勢。

復膜孢酵母屬、、伊薩酵母屬、節擔菌屬、假絲酵母屬、孢圓酵母屬在傳統工藝中相對豐度呈下降趨勢；酒醅進行“FD 工藝”處理后，上述屬的微生物相對豐度均有所上升，分別為0.14%增至2.80%、0.08%增至0.88%、0.62%增至7.48 %、0.007 %增至0.077 %、0.036 %增至0.203 %、0.00 %增至0.24 %（圖5），有利于酒醅微生物豐度提升和酒體風味物質形成。

2.5 二輪次出酒率及酒的風味物質成分分析

2.5.1 二輪次出酒率

二輪次堆積采用“FD 工藝”及傳統堆積發酵的兩組酒醅在經30 d 窖內發酵后，產酒數量如圖6 所示，二輪次出酒量“FD 工藝”明顯高于傳統工藝，說明“FD 工藝”的使用能提高醬香型二輪次酒的產量。相較于醬香型白酒傳統工藝而言，“FD工藝”的應用提高了第二輪次酒醅的基酒產量，達到236 kg，顯著高于袁再順等使用“破堆移位”工藝后二輪次出酒提高72 kg 的數量。“FD 工藝”全程使用機械化使整個堆積酒醅充分混勻、攪拌，氧氣大量引入，使得酵母等一系列產酒微生物加速生長、繁殖，最終獲得更多出酒量。

圖6 醬香型二輪次酒醅產酒量

2.5.2 基酒的風味物質成分分析

2.5.2.1 總酸總酯分析

傳統工藝堆積發酵的基酒總酸和總酯含量分別為2.39 g/L 和5.53 g/L。相較于傳統工藝而言，“FD工藝”基酒的總酸和總酯含量分別為3.09 g/L和7.09 g/L，均是傳統工藝堆積發酵的1.28 倍多。“FD工藝”生產的原酒總酸與總酯含量均大于傳統堆積發酵，說明“FD 工藝”對基酒的酸類物質和酯類物質的增加均作出了貢獻。根據GB/T 26760—2011高度酒理化指標可知，酒樣總酸大于1.4 g/L，總酯含量大于2.2 g/L，屬于優級品。兩組樣品在總酸、總酯方面均大于標準值數，均屬于優級原酒。

2.5.2.2 氣相色譜分析

通過氣相色譜對第二輪次兩種不同工藝基酒風味物質成分進行檢測，共檢測出28 種化合物（表2）。由表2 可知，28 種香氣成分中，酯類7 種，酸類6 種，醇類11 種，醛類3 種，酮類1 種。

酸類物質含量變化：酸類在酒體中貢獻較大,醬香型白酒中總酸含量高于其他香型白酒，承擔調節白酒濃厚感的作用。由表2 可知,兩組酒樣酸類物質中乙酸含量明顯高于其他酸類物質，傳統堆積酒樣乙酸含量約占總酸含量83.26%，“FD 工藝”約占總酸的82.88%，處于酸類含量82%～96%范圍之間。“FD 工藝”酒樣乙酸含量2.561 g/L 明顯高于傳統酒樣乙酸1.99 g/L，有助于乙酸乙酯的形成，說明“FD 工藝”有利于酒醅和酒體酸類物質的積累。

表2 二輪次基酒風味物質成分 (g/L)

酯類物質含量變化：白酒中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯等四大酯含量最高，一部分由微生物直接代謝，另一部分由酸和醇類經酯化反應產生，能夠賦予酒體果香，令人產生愉悅感。乳酸乙酯和乙酸乙酯含量在醬香型白酒中占比較大。由表2 可知，“FD 工藝”酒樣中乙酸乙酯4.941 g/L 遠大于傳統酒樣3.135 g/L，乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯在兩組樣品中相差不大，說明“FD工藝”有利于增加酒中乙酸乙酯含量。

羰基類物質含量變化：乙醛主要給酒體帶來苦、辣的感官，乙縮醛是白酒老熟的重要標志之一，能給酒體帶來協調圓潤的感官。由表2 可知，在兩組酒樣的醛類物質中傳統酒均略大于“FD 工藝”酒樣，說明FD 工藝并未打破酒體總體結構。酮類物質中，“FD 工藝”酒樣和傳統酒樣中兩組數值相差不大，均能夠賦予酒體綿柔細膩感。

醇類物質含量變化：白酒中的醇類主要是一些高級醇類，是酵母酒精發酵的副產物，也是白酒重要的風味成分。適量的高級醇可以增加酒體的甜度和醇厚感，含量過高會給酒體帶來苦澀感，并會引起上頭。在醬香型白酒中,高級醇尤其是正丙醇含量普遍偏高。在兩組酒體對比中，僅正丙醇之間差異明顯。由此可知，“FD 工藝”對正丙醇含量（1.145 g/L）影響較為突出且大于傳統酒樣組，明顯低于唐維川等第二輪次正丙醇含量（6.77 g/L），說明“FD 工藝”對醇類物質影響不大，并未破壞酒體質量。

3 結論

本實驗通過對第二輪次堆積發酵酒醅采取兩組不同工藝后進行高通量測序分析，研究結果表明：經“FD 工藝”處理酒醅真菌群落結構多樣性和豐富度均有大幅上升，PCA 分析結果表明，“FD 工藝”組酒醅中入窖真菌群落組成成分和傳統堆積發酵入窖真菌群落組成成分相近，說明“FD 工藝”不破壞真菌群落入窖前組成成分。真菌群落組成成分分析，“FD 工藝”有利于大部分優勢真菌群落的增長，為入池發酵酒醅中提供更多的優勢真菌。“FD 工藝”原酒酒體總體呈好的發展趨勢，出酒率更高，主要呈香呈味物質成分有所提高，為醬香型白酒更大規模生產提供了一定的理論依據。但是，此次研究僅對一個輪次中真菌群落結構和基酒品質進行了實驗研究，后期應針對全輪次堆積發酵中“FD 工藝”的運用進行微生物群落結構、酒體品質研究，從而更好的解析“FD 工藝”對醬香型白酒堆積過程的影響，提高醬香型白酒品質。