商品羊奶粉中DNA的質量評價及牛源性成分摻假檢測

張雪茹，付尚辰，鄭衛民，李玲，劉永峰*

1(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710062)2(西安市奶牛育種中心，陜西 西安，710075)

近年來，羊奶及其產品的生產和消費迅速增加，眾多品牌紛紛進入市場，使市場呈現大規模增長。2017年世界羊奶年產量超過1 800萬t，10年內(2007～2017年)累計增長約20%，市場趨勢表明2030年羊奶產量將再增加53%[1-2]。由于羊奶脂肪分子小、易消化、低過敏性以及一些功能特性吸引了更多消費者，羊奶及其產品的需求量明顯增加[3-4]。奶粉由于含水量低且無需冷藏，具有較長保存期、易于貯存和運輸等優點，在國際乳品貿易中占比份額較大[5]。羊奶是一種季節性強且產量低的產品，而牛奶的價格低廉，促使國內外羊奶粉真實性或牛乳成分污染檢測成為羊奶產品質量檢測中的重點檢測項目之一。GOLINELLI等[3]聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測報告顯示巴西4個品牌的20批山羊奶酪中都存在摻假牛奶的現象。有報道，采用雙重PCR方法對巴西160份羊奶樣品檢測，發現市場上41.2%的羊奶中摻入了牛奶[6]。因此，羊奶及其產品價值提高和市場擴大趨勢促使羊奶產品中牛奶成分的檢測已成為必然。

目前，基于DNA的檢測方法已逐漸取代基于蛋白質的檢測方法。因為DNA與蛋白質相比，其耐熱性更強，在大多數生物體細胞中均存在且不受物質形態的影響[7]。在DNA的分析方法中，PCR由于特異性好、靈敏度高已經被廣泛應用[8]。MAFRA等[9]將PCR技術應用于含一定量牛奶的山羊奶酪和17份商業奶酪檢測。DENG等[10]通過PCR法對原料奶和加工乳制品(冷凍干燥、巴氏殺菌、超高溫滅菌)的二元混合物進行了檢測。SOVOV等[11]利用開發的基于PCR的高分辨率熔解曲線法對人工制備的乳制品和豆制品混合樣品以及市售的真實產品進行了驗證。目前采用PCR技術檢測奶類摻假的研究較多，然而對于市售羊奶粉的摻假應用研究報道較少。

綜上，本研究采集了38種國內外市售羊奶粉產品，其中包括純羊奶粉和配方羊奶粉，提取其中DNA，通過普通PCR與實時熒光定量PCR對羊奶粉中的牛源性成分進行定性定量檢測，為消費者提供目前市售羊奶粉的整體安全信息和質量參考，同時為食品安全監督管理部門提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

38種市售國內外品牌的羊奶粉產品線上、線下購于國內，包括33個純羊奶粉(其中6個國外品牌)、5個配方羊奶粉(均為國內品牌)。對采集的樣品進行編號和記錄，國內羊奶粉品牌共32個，編號為1～31和38，國外羊奶粉品牌共6個，編號為32～37，所有羊奶粉在常溫條件下保存，在較短時間內完成檢測。純羊奶粉和純牛奶粉樣品均為實驗室前期對生鮮羊奶、牛奶噴霧干燥獲得。

1.2 試劑與儀器

試劑：十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)，Sigma公司；Tris平衡酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇，西安晶博生物技術有限公司；6×DNA loading buffer、瓊脂糖、2×Es Taq MasterMix、UltraSYBR Mixture、Bio DL 2 000、蛋白酶K、Dured 核酸染料，康為世紀生物科技有限公司；引物(ATP-6和12SBT-REV)，生工生物工程股份有限公司。

儀器：ND-1000超微核酸分析儀，美國熱電公司；T100 Thermal Cycler梯度PCR儀、CFX Connect Optics Module實時熒光定量PCR儀，BIO-RAD；UVCI-1100凝膠呈像儀，Major Science；TGL-16aR高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；1-14K臺式小型離心機，美國Sigma公司；HH4數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇友誼儀器研究所；DYY-4C水平電泳儀，北京六安儀器廠。

1.3 羊奶粉中DNA的提取

稱取1 g羊奶粉樣品加入9 mL蒸餾水溶解均勻，5 000 r/min離心10 min，棄去上層清液，加入600 μL磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)充分混合，12 000 r/min離心10 min，棄去上層清液，保留底部沉淀。向上述沉淀物中加入350 μL DNA提取緩沖液，50 μL SDS和20 μL蛋白酶K，混合均勻后置于56 ℃恒溫條件下水浴4 h。加入500 μL DNA提取酚試劑充分混勻，12 000 r/min離心10 min；取上清液加入等體積V(DNA提取酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1的混合液萃取1次，12 000 r/min離心10 min；再取上清液加入等體積V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1的混合液萃取2次，12 000 r/min離心10 min；再取上清液加入2倍體積無水乙醇，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入體積分數75%的乙醇沉淀DNA，離心5 min后棄去乙醇溶液，將液體晾干，最后加入30 μL TE溶液溶解DNA沉淀。

1.4 DNA含量、純度以及PCR擴增效果檢測

采用超微量核酸分析儀測定總DNA濃度和純度。吸取1 μL TE緩沖溶液作為空白對照，同樣吸取1 μL DNA樣品測定讀取濃度和純度。將提取的羊奶粉DNA用1%(質量分數)的瓊脂糖凝膠在110 V下電泳40 min，在凝膠成像儀下觀察DNA的完整性。利用線粒體引物ATP-6進行普通PCR擴增，以檢驗提取出的可擴增DNA的質量。

PCR反應體系：3.4 μL 2×Es Taq MasterMix，引物各0.3 μL，DNA模板1 μL，加入ddH2O補齊至10 μL。PCR擴增條件：在95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃(12SBT-REV)/58 ℃(ATP-6)退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復30個循環；最后在72 ℃總延伸10 min。PCR反應產物使用1%的瓊脂糖凝膠在110 V下電泳40 min后，在凝膠成像儀紫外光下觀察并拍照。具體引物序列見表1。

表1 引物序列及擴增片段長度

1.5 普通PCR檢測羊奶粉摻假牛乳成分

1.5.1 普通PCR檢測羊奶粉中牛奶粉DNA的檢測限

為了確定本試驗中普通PCR對牛奶粉中DNA的檢測能力，將純牛奶粉以0.01%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%和50%(質量分數)的比例與純羊奶粉混合均勻，并從中提取DNA。以牛特異性基因12SBT-REV為目的基因，使用上述PCR反應體系及條件，經過瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像儀下拍照。

1.5.2 普通PCR定性檢測羊奶粉產品中的牛乳成分

按照上述DNA的提取方法從羊奶粉中提取DNA，采用牛特異性目的基因12SBT-REV進行普通PCR擴增，以檢測38種羊奶粉產品中的牛乳成分。

1.6 實時熒光定量PCR檢測羊奶粉摻假牛乳成分

1.6.1 實時熒光定量PCR檢測牛奶粉DNA的靈敏度

將純牛奶粉中提取的DNA以10倍梯度進行連續稀釋，即DNA質量濃度分別稀釋成100、10、1和0.1 ng/μL，再結合SYBR Green I染料進行實時熒光定量PCR，以測定12SBT-REV的擴增效率和靈敏度。每個稀釋度進行3次重復，以DNA濃度的對數值與獲得的Ct值建立標準曲線。實時熒光定量PCR的擴增效率根據標準曲線的斜率按照公式(1)進行計算：

擴增效率/%=[10(-1/斜率)-1]×100

(1)

實時熒光定量PCR反應體系：5 μL 2×Ultal SYBR Mixture，上下游引物各0.3 μL，1 μL的DNA模板，用ddH2O將反應體系補齊至10 μL。反應條件為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，40個循環。在每個循環結束處采集1次熒光信號，熔解曲線溫度為65 ℃升高至94 ℃。

1.6.2 實時熒光定量PCR定量檢測羊奶粉產品中的牛乳成分

將純牛奶粉分別按照比例0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%和50%(質量分數)與純羊奶粉混合均勻以制備摻假模型標準曲線。從制得的二元混合物中提取DNA，并使用牛的引物對12SBT-REV，在上述實時熒光定量PCR反應條件下進行定量檢測。再將經過普通PCR定性檢測出的摻假羊奶粉以同樣的實時熒光定量PCR條件進行定量檢測。

1.7 統計分析

每個樣品均進行3次平行測定，結果取平均值。實驗數據采用SPSS 22.0 統計分析軟件進行T檢驗和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 羊奶粉DNA含量、純度、完整性的檢測結果

2.1.1 DNA純度與含量的檢測

從38種羊奶粉中提取的DNA利用超微量分光光度計測定，不同種類羊奶粉的DNA純度和含量的測定結果如圖1所示。DNA的OD260/280值為1.3～1.5，其中從純羊奶粉中提取DNA的OD260/280值約為1.4，顯著高于配方羊奶粉中DNA的OD260/280值約1.25(P<0.05)，而最佳的DNA的OD260/280值通常為1.8。DNA質量濃度為200～500 ng/μL，其中從純羊奶粉中提取的DNA含量顯著高于配方羊奶粉(P<0.05)。該結果表明，純羊奶粉中提取DNA的純度和含量均較高于配方羊奶粉。

a-DNA純度；b-DNA含量

2.1.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測

為了檢測DNA的降解程度，對38種羊奶粉中提取的總DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。從羊奶粉產品中得到的總基因組DNA均呈現出不同程度的彌散和拖尾，部分加樣孔較亮，表明樣品中提取的DNA有較明顯的降解，可能含有蛋白質、酚等雜質污染。

1～38-38種羊奶粉樣品；M-DL 2000 Marker

2.1.3 PCR檢測的結果

PCR成功擴增是判定DNA質量的一個重要依據，通常需要較高質量的DNA模板。如圖3所示，采用羊特異性引物ATP-6對所提取的DNA樣品進行普通PCR擴增，本研究中38個樣品中所提取的總基因組DNA均可擴增出294 bp的目的基因片段，條帶清晰且明亮，空白對照無條帶。因此，羊奶粉樣品中所提取的DNA雖然有不同程度降解，但均具有滿足PCR擴增的模板數量和質量，可用于后續摻假檢測分析。

1～38-38種羊奶粉樣品；M-DL 2000 Marker；NTC-無模板對照

2.2 牛乳中DNA的普通PCR檢測限

以12SBT-REV為特異性引物對不同摻假比例牛乳提取的DNA進行普通PCR擴增，電泳結果如圖4所示。泳道1～8依次表示牛乳摻假比例為0.01%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%(質量分數)，NTC表示無模板對照，明顯觀察到0.01%比例的泳道沒有出現目標條帶，從0.1%到50%比例的泳道隨著牛乳成分摻假比例的增加，得到目的條帶的亮度依次增加。因此，普通PCR可以實現羊奶粉中牛源性成分的定性檢測，并且最低可以檢測到0.1%的牛源性成分。

泳道1～8-羊奶粉中含有0.01%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、30%、50%(質量分數)的牛奶粉；NTC-無模板對照；M：DL2000 Marker

2.3 牛乳中DNA的實時熒光定量PCR靈敏度檢測

為了測定牛特異性引物12SBT-REV在實時熒光定量中的擴增效率和靈敏度，對牛奶粉中提取的DNA進行10倍梯度稀釋，得到100～0.1 ng的靈敏度(圖5)。所得標準曲線的斜率為-3.141，表明擴增效率為108.1%。因此，特異性引物12SBT-REV在實時熒光定量中靈敏度較好，可以用于下一步的試驗。

圖5 牛奶粉中DNA檢測靈敏度

2.4 普通PCR定性檢測羊奶粉中摻假牛源性成分的結果

對38種市售羊奶粉進行摻假檢測試驗，使用純羊奶粉和純牛奶粉分別作為陰性和陽性對照，同時設置空白對照。檢測結果如圖6所示，在38種羊奶粉產品中，共檢測出8種產品含有牛源性成分，樣品序號分別是2、3、7、8、12、17、18和30號。根據羊奶粉產品配料表(表2)得知，樣品7、12、17和30號樣品中分別添加有乳清蛋白粉或者脫鹽牛乳清粉，與檢測結果相一致。而國產羊奶粉樣品2、3、8和18號樣品的配料表中均顯示為生羊乳，未標明添加有牛乳成分。故該4種羊奶粉中存在牛源性成分污染或摻假情況。15號樣品雖然為配方羊奶粉，但在其配料表中未標示含有牛乳成分，并且也未檢測到含有牛乳成分，說明產品中不含牛乳成分，與檢測結果相一致。綜上所述，在38種羊奶粉產品中共檢測到4種國產羊奶粉產品(2、3、8和18號樣品)與配料表不相符，具有牛源性成分污染或摻假的情況。

1～38-38種羊奶粉樣品；M-DL 2000 Marker；NTC-無模板對照;牛-純牛奶粉；羊-純羊奶粉

2.5 實時熒光定量PCR檢測羊奶粉中牛源性成分的結果

為了量化羊奶粉中的牛源性成分，通過ΔCt值與牛源性成分百分比的對數建立的定量標準曲線如圖7。該圖顯示羊奶粉中含有0.1%～50%(質量分數)的牛源性成分時，所建立的標準曲線線性良好(R2=0.986 9)，表明羊奶粉中牛源性成分含量為0.1%～50%時可以用此標準曲線進行定量檢測。

圖7 實時熒光定量PCR檢測摻假牛源性成分標準曲線

對上述定性檢測結果得到的4種與配料表不相符的羊奶粉產品進一步進行牛源性成分的定量檢測，得到定量檢測結果如表2所示。2、3、8和18號羊奶粉樣品通過實時熒光定量檢測得到Ct值分別為25.33、28.64、26.42以及19.45(圖8)，擴增曲線為S型，熔解曲線具有單一的熔解峰。根據定量標準曲線，對應得到的牛源性成分分別為1.70%、0.1%、0.66%和高于50%(質量分數)。該結果表明，2、3、8號羊奶粉中牛源性成分極低，可能是由于生產加工中污染造成的，而18號羊奶粉樣品中牛源性成分較高，存在牛乳摻假情況。

表2 38種市售羊奶粉中牛源性成分摻假檢測

NTC-無模板對照

3 討論

羊奶粉在生產加工中經過高溫高壓等多道加工程序，會導致奶中的DNA發生一定程度的斷裂或者降解，同時DNA的質量還會受到蛋白質、殘留酚類物質的影響，因此奶粉中DNA提取具有一定的難度。本研究從羊奶粉中提取DNA的OD值為1.3～1.5，低于最佳值1.8[14]，該結果與LIAO等[12]所得DNA純度相近。DNA質量濃度范圍為200～500 ng/μL，與LIAO等研究從奶粉中提取DNA的濃度值相接近，該值均高于LIU等[15]和劉永峰等[16]對牛奶提取DNA的濃度值。DNA濃度的提高可能受高溫條件下細胞膜通透性增加的影響，朱揚等[17]研究中也表明肉制品經過高溫加工處理后，DNA含量相比較于生肉試驗組顯著升高。另外，純羊奶粉中提取的DNA純度和含量均顯著高于配方羊奶粉，這可能是由于配方羊奶粉中添加有較多種類的營養物質，對DNA提取造成更多的干擾和影響。其次，配方羊奶粉與純羊奶粉生產加工工藝有所不同，也會影響配方羊奶粉DNA的提取質量。運用本實驗中DNA提取方法得到的羊奶粉DNA，能夠較好地滿足于后續的摻假檢測試驗。

本研究羊奶粉中牛源性成分的檢出限為0.1%(質量分數)，該結果低于RODRIGUES等[6]研究中通過PCR檢測方法得到山羊乳樣品中0.5%(質量分數)牛乳的檢出限，并且驗證了市場上有41.2%的羊奶中摻有牛奶。LIAO等[12]研究結果得到的牛奶成分的檢出限同本研究一致，然而其提出0.1%牛源性成分含量的定量結果可能并不可靠，這是由于在0.1%摻假檢測水平下的目標分析物濃度低造成的。雖然0.1%的定量結果存在不可靠的可能性，但是在實際判斷產品摻假時，考慮到0.1%的摻假量不具有獲取經濟利益的動機，因此該水平下的牛源性成分的定性檢測比定量檢測更具有意義。

在38種國內外市售羊奶粉樣品中檢測出有4款國內羊奶粉中含有牛源性成分，且在營養成分表中未進行標明。其中3款羊奶粉中的牛源性成分遠低于10%，然而故意摻假含量通超過10%才具有經濟利潤[18]，因此該3款羊奶粉中的牛源性成分可能為生產加工中污染導致的。本研究僅在國內羊奶粉品牌產品中檢測出不應出現的牛源性成分，而在國外品牌羊奶粉產品中未見不符合規定的牛源性成分。

4 結論

本研究分別通過普通PCR和實時熒光定量PCR對羊奶粉中的牛源性成分進行定性和定量檢測。羊奶粉中提取DNA的OD值為1.3～1.5，質量濃度為200～500 ng/μL，純羊奶粉DNA的純度和濃度顯著高于配方羊奶粉(P<0.05)，DNA部分降解，PCR擴增效果較好，DNA質量滿足后續摻假檢測要求。普通PCR以及實時熒光定量PCR均最低能夠檢測到質量分數0.1%的牛源性成分，實時熒光定量PCR可實現對0.1%～50%(質量分數)的牛源性成分進行定量。對38種市售品牌的羊奶粉進行摻假檢測，有4種標簽為純羊奶粉的國產羊奶粉產品中檢測出牛源性成分，其中3種羊奶粉中牛源性成分約為1%，另一種羊奶粉中牛源性成分含量高于50%。本研究有助于消費者了解國內外羊奶粉品質安全情況，為商業羊奶粉摻假檢驗提供可靠依據。