賽里木酸奶細菌多樣性及揮發性風味物質成分分析

王子涵，林青，劉鈺潔，秦新政，李月，婁愷，袁華偉*，霍向東*

1(新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊,830052)2(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，新疆 烏魯木齊,830091)3(宜賓學院，質量管理與檢驗檢測學部/固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓,644000)4(新疆師范大學 生命科學學院，新疆 烏魯木齊,830054)

賽里木酸奶是新疆阿克蘇地區拜城縣賽里木鎮維吾爾族農家采用傳統方法制作的一種發酵乳制品，集鮮明的地域和民族特色為一體，是南疆特色乳品的代表[1]。賽里木酸奶氣味清香、酸甜可口、質地黏稠，能拉出近1 m長的絲，有“拉絲酸奶”之稱[2]。

近年，對賽里木酸奶的研究多數集中在菌株的分離鑒定、發酵工藝、生物活性物質及主體風味分析[2-5]。對原產地賽里木酸奶高通量測序結果表明，厚壁菌門是其優勢細菌門，乳桿菌屬為優勢細菌屬[1]。利用分離自賽里木酸奶的單株乳酸菌或復合菌發酵牛奶后，檢測出11種揮發性成分，其中乙醇、乙酸乙酯和3-羥基-2-丁酮是主體風味物質[2]。賽里木酸奶屬自然菌群發酵產品，菌種構成復雜，全面評判其主體發酵菌群及風味物質，還需要深入研究。

本文以賽里木酸奶引子為發酵劑，采用當地傳統工藝，制作賽里木酸奶，結合高通量測序及頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜(head space solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS)聯用技術，解析賽里木酸奶細菌群落結構多樣性及揮發性風味物質組成，旨在為新疆特色發酵乳中優勢功能菌的分離篩選及發酵劑的制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

純牛奶，利樂枕包裝，新疆西域春公司；Gene JET膠回收試劑盒，Thermo Scientific公司；D2000 DNA Marker，北京天根生化科技有限公司；帶識別條碼(barcode)的細菌16S rRNA基因V3～V4區擴展引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)，北京諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

PCR儀，美國Bio-Rad公司；Illumina NovaSeq 高通量測序平臺，美國Illumina公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭及萃取手柄，上海安譜實驗科技股份有限公司；TQ8040 NX三重四極桿型氣質聯用儀，日本SHIMADZU公司；電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；Fresco17離心機，Thermo Fisher Scientific公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統，北京六一生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

原產地賽里木酸奶樣品的采樣地點為新疆拜城縣賽里木鎮托喀其買里村，賽里木酸奶制作傳承人吐熱汗·吐熱甫工作室。使用經滅菌后的50 mL離心管進行分裝，每管30 mL左右，采集6管，1管用于高通量測序，1管用于后續試驗，4管作為備份，放入車載低溫冰箱保存。

1.2.2 賽里木酸奶發酵工藝流程

傳統賽里木酸奶主要有5道制作工序:

擠奶→煮奶→盛碗→添加引子(發酵劑)→發酵(8 h)→成品

每次制作酸奶后都要留下一些引子供下次發酵用。據此，本研究采用如下工藝：

純牛奶(西域春利樂枕)→分裝→預熱(42 ℃)→接種[加入賽里木酸奶引子，接種量4%(體積分數)]→發酵(42 ℃，8 h)→冷藏(4 ℃)

用于揮發性風味物質HS-SPME-GC-MS的檢測。

1.2.3 高通量測序

采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTMAB)溶解細胞膜的方法提取賽里木酸奶中的總DNA[6]。使用帶Barcode引物和高效高保真的酶，對細菌16S rDNA的V3～V4區域(引物 338F/806R)進行 PCR 擴增[7]。

PCR反應體系(30 μL)：15 μL Phusion Master Mix(2×)，3 μL Primer(2 μmol/L)，10 μL(5～10 ng)DNA(1 ng/μL)，2 μL雙蒸水；反應程序：98 ℃，1 min，(98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s)×30，72 ℃，5 min。PCR產物使用2%(質量分數)瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。選擇大小在400～450 bp的條帶，切膠回收純化。送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司，借助Illumina NovaSeq平臺及相關資源完成高通量測序，并返回原始序列。

1.2.4 生物信息學分析

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣本數據，使用FLASH軟件對樣本的reads進行拼接，過濾處理得到高質量的Tags數據[7]。參照QIIME的Tags質量控制流程，與物種注釋數據庫比對，剔除質量較差的的嵌合體序列，最終得到有效序列[8]。利用UPARSE軟件以97%的一致性將序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)[9]。用MOTHUR方法與SSUrRNA數據庫對OTUs代表序列進行物種注釋分析，獲得分類學信息并分別在各個分類水平上的群落結構進行統計分析[10]。通過QIIME軟件進行Alpha多樣性指數分析。

1.2.5 純牛奶及酸奶樣品中揮發性成分的提取

采用HS-SPME方法，稱取20.00 g樣品，放入100 mL帶有硅膠墊帽的頂空萃取瓶中，立即密封，于60 ℃水浴中預平衡15 min后，推出老化過的萃取頭，頂空吸附40 min。取出萃取針頭后進樣，250 ℃解析5 min。

1.2.6 GC-MS分析條件

GC條件：InertCap WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：進樣口溫度為250 ℃，初始溫度為35 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至240 ℃，保持4 min；進樣模式：不分流進樣；色譜柱流速：1 mL/min。

MS條件：電離方式EI；載氣為He；離子源溫度230 ℃；數據采集方式Q3 Scan；掃描范圍45～500m/z。

1.2.7 相對氣味活度值(relative odor activity value，ROAV)計算及關鍵風味物質的確定

ROAV值是一種能夠有效評價測得化合物的方法[11]，揮發性成分閾值見參考文獻[12-13]。定義樣品總體氣味貢獻最大化合物的ROAV值為100，其他風味化合物的ROAV按公式(1)計算：

(1)

式中：Ci和Ti分別為各揮發性物質的相對含量和閾值;Cmax和Tmax分別為對樣品總體風味貢獻最大組分的相對含量和閾值。

2 結果與分析

2.1 賽里木酸奶中Alpha多樣性分析

賽里木酸奶樣品高通量測序返回原始序列58 475條，最終用于后續分析的有效序列有39 457條。采用Alpha多樣性指標中表示群落多樣性的Shannon指數、Simpson指數，表示物種豐富度的Chao1指數、Ace指數以及群落覆蓋度指數Coverage[10]。對樣品中群落多樣性和物種豐度進行評估，結果如表1所示。樣品的OTUs覆蓋率達99.99%，說明樣品中細菌種類幾乎都能被檢測到，測序結果可靠。OTUs數量越多說明樣品中的細菌豐度越高，賽里木酸奶樣品中共檢測到186個OTUs，隸屬于9門、17綱、34目、58科、77屬。

表1 賽里木酸奶中細菌Alpha多樣性指數

2.2 賽里木酸奶中細菌群落結構組成分析

對賽里木酸奶樣品的有效序列進行聚類，以97%相似性度水平聚類的OTUs進行深度分析，將平均相對豐度>1%定義為優勢微生物，平均相對豐度>10%定義為絕對優勢微生物[10]。16S rDNA門水平上檢測到9個菌門(圖1)，厚壁菌門(Firmicutes)為絕對優勢菌門，占比97.45%，其次為擬桿菌門(Bacteroidota)占比0.74%，其他門豐度小于0.5%；共檢測出77個屬，賽里木酸奶樣品中占比最高的前10個屬(圖2)，鏈球菌屬(Streptococcus)占比82.94%為絕對優勢菌，其次為占比5.19%的乳桿菌屬(Lactobacillus)。

圖1 門水平上賽里木酸奶樣品的細菌群落組成

2.3 賽里木酸奶揮發性風味物質成分分析

采用HS-SPME-GC-MS對純牛奶及賽里木酸奶的揮發性成分進行定性和定量分析，結果如表2所示。兩種樣品共檢測出46種成分，包含酸、醛、酮、酯、醇、醚、酚、呋喃、烷烴和芳香族化合物。純牛奶共檢測出26種成分，其中酸類5種，醛類5種，酮類5種，酯類3種，醇類1種，醚類1種，酚類1種，呋喃類2種，烷烴及其他衍生類種。賽里木酸奶共檢測出31種成分，其中酸類10種，醛類1種，酮類5種，酯類5種，醇類4種，醚類1種，烷烴及其他衍生物4種，芳香族化合物1種。與純牛奶相比，賽里木酸奶中酸、酯、醇類化合物種類及含量明顯增加，醛類明顯減少，酮類含量減少但種類發生改變，減少了酚類、呋喃類化合物，增加了芳香族化合物；其中，酸類占總比例最大，為47.57%，其次是酮類及醇類，分別占21.31%、12.83%。酯類化合物在檢測結果中質量分數較低，但由于其香味閾值低，故對發酵乳風味的形成影響較大[14]。

2.4 根據相對氣味活度值鑒定賽里木酸奶中主體風味物質

酸奶的整體風味是多種物質協同作用的結果，計算樣品中揮發性成分的ROAV值確定賽里木酸奶中的主體揮發成分，ROAV越大表示該化合物對樣品總體氣味的貢獻作用越大，一般認為ROAV>1的風味化合物是關鍵風味化合物，1≥ROAV>0.1的風味化合物起修飾作用[11]。如表3所示，純牛奶中有5種特征成分，分別為2-甲基丁醛、糠醇、癸醛、2-甲基丙醛、壬醛；2種修飾性成分為2-壬酮和2-庚酮。賽里木酸奶中有11種關鍵成分，分別為甲基乙酰甲醇(乙偶姻)、壬醛、2-庚酮、正己酸、2-壬酮、正丁酸、2-十一酮、2-壬醇、乙酸正丁酯、正辛酸、己酸甲酯；2種修飾性成分為5-羥基癸酸-δ-內酯和正癸酸。

3 討論

本研究采用高通量測序對賽里木酸奶中細菌群落組成進行分析，發現Streptococcus占比82.94%為絕對優勢菌屬，能產生不同莢膜多糖和黏液多糖[15]，Lactobacillus占比5.19%，為優勢菌屬，可產生葡聚糖[16]。乳酸菌胞外多糖通過結合大量水或與酸奶中的其他成分相互作用而具有增稠、乳化、凝膠和穩定能力[17]，這與賽里木酸奶的拉絲特性相關。此外，在發酵過程中，鏈球菌與乳桿菌的協同作用能更快地形成更多的乳酸和芳香化合物[12]。

高冬臘對賽里木酸奶進行高通量測序，發現乳桿菌屬為優勢菌屬，其次為鏈球菌屬[1]。本研究中鏈球菌屬為優勢菌屬，其次為乳桿菌屬，鏈球菌屬為唾液鏈球菌嗜熱亞種，乳桿菌屬主要包含希爾加德氏乳桿菌和鼠乳桿菌(Lactobacillusminurnius)。不同樣本的的細菌群落組成有所差別，但鏈球菌屬和乳桿菌屬在賽里木酸奶中占比均最高。此外，吳陽[5]、瑪依諾·木圖拉等[4]，利用傳統的純培養方法從賽里木酸奶中分離得瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)；吐汗姑麗·托乎提[18]從賽里木酸奶分離得德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、嗜熱鏈球菌和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

雷華威[2]利用分離自賽里木酸奶的瑞士乳桿菌單獨或與嗜熱鏈球菌、馬斯克魯維酵母混合發酵酸奶，單獨發酵時包含8種揮發性成分，其中脂肪酸為主要風味物質；與嗜熱鏈球菌共發酵時產生10種揮發性成分，乙偶姻為主要風味物質；三者共發酵時檢測到11種揮發性成分，乙醇、乙酸乙酯和3-羥基-2-丁酮是主體風味物質，隨著菌種種類的增加酸奶的揮發性風味物質種類也隨之增加。本研究利用完整土著菌群的賽里木酸奶引子進行發酵，揮發性風味物質組成更加豐富，共有31種揮發性成分，主體風味物質包括酸、酮、酯、醇等物質，酸類物質占比最高，為47.57%，與賽里木酸奶口感偏酸相符。

賽里木酸奶中的主體揮發成分包括乙偶姻、壬醛、2-庚酮、正己酸、2-壬酮、正丁酸、2-十一酮、2-壬醇、乙酸正丁酯、正辛酸、己酸甲酯。酸類物質促進賽里木酸奶特有感官風味的形成。低分子量脂肪酸一般由微生物作用于脂肪分解產生，賦予酸奶酸爽的口感[19]。乙酸具有醋酸味，正丁酸天然存在于香茅中，普氏棲糞桿菌被認為是最豐富的丁酸產生菌之一，丁酸鹽在結腸黏膜中具有抗炎作用[20]。3-甲基戊酸微帶清香氣息，具有酸的藥草氣味。正己酸、正庚酸、壬酸都具有脂肪樣氣味，正己酸還賦予酸奶乳酸味及乳酪味[21]，壬酸還具有椰子香氣。辛酸游離于西藏柏木、柳杉、煙草、肉豆蔻等植物精油中，具有微弱水果酸味。酮類物質多由不飽和脂肪酸的氧化或微生物代謝產生，使酸奶具有特征的風味[22-23]。甲基乙酰甲醇(3-羥基-2-丁酮/乙偶姻)具有強烈的奶油香氣，是嗜熱鏈球菌發酵糖類產生的特征風味化合物之一[24]。2-庚酮有類似梨的水果香味，2-壬酮呈水果、花、油脂和藥草似的香氣，2-十一酮濃度低時具有類似桃子的香氣，有類似蕓香、油脂氣息，賦予酸奶奶油、乳酪風味。醇類化合物比較柔和，使酸乳口感更加爽口，是賽里木酸奶中特有風味物質[4]。(+)-5-甲基-2-己醇具有水果的香氣，2-乙基-1-己醇有甜味和淡淡的花香，不飽和醇的風味閾值較低，對風味有較大貢獻[13]。酯類化合物大多數具有花香和果香，有助于中和發酵乳中脂肪酸尖銳的刺激性氣味。乙酸異丙酯、乙酸正丁酯具有水果香，己酸甲酯賦予酸奶令人愉快的氣味，5-羥基癸酸-δ-內酯有奶油香味、椰子及桃子的果香氣，對酸奶風味起重要作用，增添酸奶的奶香氣味[24]。

4 結論

Streptococcus，Lactobacillus為賽里木酸奶中絕對優勢菌屬，與賽里木酸奶的拉絲特性相關；鏈球菌發酵糖類產生的乙偶姻賦予賽里木酸奶強烈的奶油香氣。純牛奶以原產地賽里木酸奶為引子發酵后生產的賽里木酸奶，其揮發性風味物質組成更加豐富，為開發具有新疆特色的酸奶發酵劑提供理論基礎。