人源化CSF-1R基因敲入小鼠模型的構建*

劉甦蘇 吳 勇 谷文達 曹 愿 翟世杰 趙皓陽 范昌發

(中國食品藥品檢定研究院 實驗動物資源研究所，北京 102629)

CRISPR-Cas9基因編輯技術是目前使用最為廣泛的編輯技術，該系統由sgRNA和Cas9蛋白組成，sgRNA與Cas9結合并引導Cas9到達DNA靶點，Cas9作為核酸內切酶對靶序列進行切割，形成DNA雙鏈斷裂，實現特定基因的敲除或插入[1]。與鋅指核酸酶(zincfinger nucleases，ZFNs)[2]、ES細胞打靶[3]和轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)[4]等基因編輯工具相比，CRISPR-Cas9技術更加高效且快速，可以精確地控制細胞內基因的表達水平[5]。

巨噬細胞集落刺激因子受體(colony stimulating factor-1 receptor,CSF-1R)屬于受體酪氨酸激酶家族，及其配體CSF-1 (colony stimulating factor-1)的過表達廣泛存在于各類實體腫瘤中，并在腫瘤惡性增殖、轉移和微環境調控等方面發揮著重要的作用。CSF-1R信號傳導控制著巨噬細胞的分化和存活，且對腫瘤中相關巨噬細胞的促進和免疫抑制起著關鍵的作用。研究表明，阻斷CSF-1/CSF-1R通路可顯著降低巨噬細胞在腫瘤部位的浸潤，并減緩原發性腫瘤生長、減少腫瘤轉移。因此，CSF-1R成為了迄今巨噬細胞研究最成熟的靶點之一，大批針對該靶點的抗體藥物及小分子抑制劑處于研發階段[6-10]。

人鼠CSF-1R基因同源性存在差異，能識別人CSF-1R受體分子的藥物或者抗體不一定能識別鼠CSF-1R，因而給評價針對此靶點的抗體和藥物帶來困難。為滿足CSF-1R靶點人源化小鼠模型在藥企及研究的需要，本文嘗試利用CRISPR-Cas9基因編輯系統，構建人源化CSF-1R基因敲入小鼠，并對其表達特性、模型資源冷凍保存進行初步探索，為這類腫瘤免疫藥物的臨床前篩選與評估提供有效的工具[11-12]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：C57BL/6Jnifdc、BALB/cCrSlcNifdc小鼠，18～22 g，雌性各20只，均來自中國食品藥品檢定研究院實驗動物研究所，動物生產許可證號SCXK(京)2017-0005。繁育環境為SPF級，動物實驗的使用許可證號SYXK(京)2017-0013，在清潔級環境中進行，飼喂SPF級小鼠顆粒飼料，飲用滅菌自來水。

本實驗所有研究均按照中國食品藥品檢定研究院實驗動物福利倫理委員會批準的動物方案進行，倫理審批號：中檢動(福)第2021(B)002 號。

1.1.2主要儀器及試劑：限制性內切酶、T4DNA 連接酶、Taq酶、Trizol試劑、RT-qPCR 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物公司)；瓊脂糖及其他生化試劑為進口分裝、DMEM高糖培養基、L-谷氨酞胺、非必需氨基酸、青鏈霉素溶液、PBS緩沖液(Gibco公司)；疏基乙醇、EDTA、二甲亞楓(Sigma公司)；胎牛血清 (ES細胞認證) (HyClone公司)。R18S3精子凍存液、HTF培養液(日本熊本大學動物資源研發中心)。

Roche 480Ⅱ熒光定量PCR儀(Roche公司)；Nano Drop超微量分光光度(Thermo公司)；微量移液器(Eppendorf公司)；引物由生工基因公司合成；TE緩沖液、TAE緩沖液自行配置；其他常見生化試劑乙醇、異戊醇、苯、氯仿均購自北京化學工業集團有限公司。

1.2 方法

1.2.1模型的構建：根據NCBI中提供的基因序列參考可知，小鼠CSF-1R基因(NCBI參考序列：NM001037859.2)位于小鼠18號染色體上，有22個外顯子，其中ATG起始密碼子位于外顯子2，TGA終止密碼子位于外顯子22(轉錄本：Csf1r-201 ENSMUST00000025523.12)。人源CSF-1R基因(NCBI參考序列：NM 005211.3)位于人類5號染色體上，有22個外顯子，其中ATG起始密碼子位于外顯子2，TGA終止密碼子位于第22外顯子(轉錄本：CSF1R-201 ENSMUST0000286301.7)。在構建該模型時，在小鼠CSF-1R外顯子3的第20個氨基酸丙氨酸下游主要插入二段基因原件，一是人源CSF-1R-CDS部分的3到11外顯子，二是鼠源CSF-1R-CDS的11外顯子到TGA終止密碼子，并在CCT-gr-1和CCT-gr-1的同源序列中引入GCC-A20和CCT-2的同源突變，具體構建策略見圖1。

圖1 模型構建設計策略Fig.1 Design strategy of model construction

1.2.2采用CRISPR-Cas9技術設計模型SgRNA表達載體：通過http://crispr.mit.edu/在線網站設計，確認sgRNA靶序列(5′-GCCACTAGGCTCGATGAC AGGGG-3′)，將sgRNA上下游引物退火后引物與PCS載體，室溫連接。使用高保真Tag DNA聚合酶從BAC克隆中擴增出含有同源臂(homologous arm)的小鼠基因組片段，并與重組位點和選擇標記一起依次組裝成同源打靶載體。

1.2.3胞質注射及胚胎移植：將制備好的SgRNA與Cas9 mRNA分別用無RNA酶水稀釋至25 ng/μL和50 ng/μL，并于13 000 r/min離心20 min，吸取上清。用口吸管吸取液體從注射針后端注入尖端，進行顯微注射導入到受精卵的細胞質中，并移植到與結扎雄鼠合籠的見栓假孕母鼠輸卵管膨大部，縫合后將移植母鼠飼養于IVC環境中，產生靶向F0子代。

1.2.4陽性小鼠基因型PCR、測序分析及Southern雜交鑒定：逐只提取鼠尾基因組DNA，取100 ng DNA通過PCR檢測基因型。引物設計針對轉入基因的編碼序列，引物設計3對，PCR 條件為：95 ℃ 5 min變性；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環。將PCR產物送諾賽基因公司進行測序，測序引物為F2及R2(設計策略見圖2A、具體序列見表2)。Southern雜交的預期片段大小：5′探針-Aflll:3.45 kb-WT，7.44 kb-MT；3′探針-Scal:8.28 kb-WT，2.27 kb-MT。

表2 熒光定量RT-PCR引物序列及退火溫度Table 2 Primer sequence and TM of qRT-PCR

注：ORF：開放閱讀框，UTR：非翻譯區，PolyA：多聚腺苷酸，WPRE：調控元件Note: ORF:Open Reading Frame, UTR: Untranslated Region, PolyA:Polyadenylic acid,WPRE: Control element圖2 陽性小鼠基因型鑒定及Southern雜交設計策略Fig.2 Genotype and Southern hybridization design strategy of positive mice

1.2.5小鼠模型繁殖建系：用PCR和序列分析法鑒定插入基因陽性的F0代首建鼠，隨后將其與野生型小鼠進行種系傳代獲得F1代小鼠，將獲得的F1雜合子小鼠進行兩兩交配，用于小鼠模型繁殖建系。

1.2.6熒光定量RT-PCR(RT-qPCR)檢測基因表達水平：檢測不同組織轉基因RNA及蛋白表達水平：處置動物時解剖取心臟、肝、脾、肺、腎、腦，采用熒光定量RT-PCR及Western blot測定RNA水平及蛋白水平表達量。選用GAPDH內參基因，設計RT-qPCR 引物，CSF-1R基因特異上游引物為RQ-CSF-1R-F，下游引物為RQ-CSF-1R-R，目的片段長139 bp，序列及退火溫度(表1)。進行反應時，測定cDNA 溶度，稀釋終溶度為50 ng /μL，反應條件：95 ℃ 30 s 預變性，隨后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

表1 CSF-1R陽性小鼠PCR、測序分析及Southern雜交鑒定引物信息表Table 1 Primer information of PCR, sequencing analysis and Southern hybridization in CSF-1R positive mice

1.2.7模型精子冷凍資源保存：按照Nakagata方法冷凍精子和復蘇[13]。頸椎脫臼處死雄鼠，取出附睪尾，放入R18S3精子凍存液液滴的培養皿37 ℃恒溫板上平衡3 min后，取精子懸浮液裝0.25 mL麥管沉入液氮中，隨后解凍復蘇并通過體外受精驗證模型保存效率。

2 結果

2.1 sgRNA打靶載體驗證

根據設計sgRNA序列退火成雙鏈后，在T4連接酶參與下連接到質粒上，通過限制性內切酶ApaLl、Ahdl/Drdl、Fspl驗證打靶載體序列。實驗結果見圖1：具體的片段大小分別為ApaLl：5 000、3 100、2 100、1 200 bp；Ahdl/Drd：7 600、1 500、1 100、800 bp；Fspl：3 900、3 400、2 400、1 200 bp。

2.2 F0代小鼠的獲得及繁殖建系

基因型鑒定結果顯示，編號7號鼠為CSF-1R基因成功敲入的F0代小鼠。進一步將構建成功的F0代小鼠與野生型小鼠交配，獲得1雄3雌的F1代陽性仔鼠，編號為34、37、38、39，鑒定結果見圖4A和圖4B，雜合子電泳結果可在約600 bp的位置清晰可見兩條電泳條帶，而野生型僅有一條；通過基因型鑒定后，選出一只陽性F1代小鼠編號為34，對其PCR產物進行序列比對，比對結果見圖4C；Southern雜交的結果見圖4D，序列比對結果顯示插入了人源相關片段，Southern雜交預期片斷大小也符合預期。

注：圖中1是ApaLl酶，目標條帶：5 000、3 100、2 100、1 200 bp；2是Ahdl/Drdl酶，目標條帶：7 600、1 500、1 100、800 bp，3是Fspl酶，目標條帶：3 900、3 400、2 400、1 200 bpNote: 1 is ApaLl enzyme, target band: 5 000、3 100、2 100、1 200 bp; 2 is Ahdl/Drdl enzyme, target band: 7 600、1 500、1 100、800 bp; 3 is Fspl enzyme, target band: 3 900、3 400、2 400、1 200 bp圖3 打靶載體限制性內切酶驗證結果Fig.3 Results of targeting vector restriction enzyme

注：A，B：F1代陽性小鼠PCR結果圖；C：34號陽性鼠PCR產物序列比對圖；D：34號陽性鼠Southern雜交片段圖;WT.野生型小鼠Note: A, B: PCR results of F1 positive mice; C: Sequence comparison diagram of PCR products of No.34 positive mouse; D: Southern hybridization fragment of positive mouse No.34；WT.Wild-type mouse圖4 CSF-1R基因敲入小鼠的鑒定結果Fig.4 Identification results of CSF-1R gene knock in mice

2.3 轉入基因轉錄表達水平

根據轉入基因CSF-1R的外顯子區域和內參基因GAPDH序列設計引物，并通過梯度PCR優化退火溫度，以擴增出單一條帶為最佳退火溫度。將同一樣品同時擴增轉基因和內參基因，當內參基因能順利擴增出來，陰性對照無擴增情況，記錄擴增結果。采用SYBR Green熒光嵌合法檢測，建立RT-qPCR方法。首先分析了內參基因和轉基因的溶解曲線，以檢測本反應體系的特異性。二基因的溶解曲線主峰單一，表明特異性較好，擴增條件可靠。

分別選取8周齡雜合小鼠3只，解剖其主要目的臟器，結果表明轉入基因能在小鼠模型心臟、肝、脾、肺、腎、腦主要臟器中表達，符合建立模型的初衷(圖5)。

注：CSF1R：CSF-1R基因敲入小鼠；WT：野生型小鼠Note：CSF1R：CSF-1R knock in mouse; WT:Wild-type mouse圖5 熒光定量RT-qPCR溶解曲線及各組織轉錄水平表達結果Fig.5 RT-qPCR dissolution curve and expression results of transcription level in various tissues

2.4 模型精子復蘇體外受精結果

將冷凍精子麥管獲能培養后進行復蘇。并將復蘇后精子與卵丘細胞復合體進行體外培養，挑選正常的2-細胞期胚胎數并計算受精率，3次的受精率分別54.93%、67.13%、81.15%，平均受精率67.74%。隨后分別移植到13只假孕鼠輸卵管中，產仔率分別13.33%、16.67%、18.18%、總計出生42只幼鼠，經過PCR檢測得到12只陽性小鼠，具體結果見表3。

表3 精子復蘇體外受精實驗Table 3 Experiment of sperm resuscitation in vitro fertilization

3 討論

近年來，癌癥免疫療法成為研究熱點，以免疫檢查點人源化小鼠、免疫系統人源化小鼠為基礎的免疫治療性藥物開發在抗腫瘤領域取得顯著進展，基于免疫治療的新藥開發成為當前腫瘤研究熱點[14]。CSF1與CSF-1R信號通路與腫瘤的發生發展密切相關，因此，該靶點也是抗癌藥物布局的重要方向[15-16]。目前，很多藥企都開展了針對人源CSF-1R的在研藥物。

人源化小鼠模型是臨床前藥物研究必不可少的有力工具。傳統制作小鼠模型的方法是在小鼠胚胎干細胞中引入突變，然后將干細胞注射到胚囊中形成嵌合體小鼠，再經過一代才能獲得純合突變的小鼠[3]，技術要求較高，操作流程長。CRISPR-Cas9系統可以更加高效且精確的實現對模式生物的基因編輯，構建特定重要基因的模型[17]。本研究利用CRISPR-Cas9技術在C57BL/6小鼠中敲入了人源CSF-1R基因，打靶載體設計時用將人源CSF-1R基因的3到11插入了小鼠的第3外顯子后，成功建立了人源化CSF-1R小鼠模型。該小鼠模型能穩定傳代，生長發育正常。為了保存遺傳資源，本研究利用凍精技術凍存精子，保證了后期模型推廣應用。

本研究選取1只7號首建雄鼠用于其后的建系繁育，獲得1雄3雌的F1代小鼠。在獲得陽性雜合F1鼠的基礎上繼續進行F2代純合子小鼠的繁殖，希望能夠獲得雙鏈插入的小鼠模型。多次繁殖交配后一共出生35只小鼠，鑒定得到22只雜合子，但無純合子出生，懷疑純合子致死。另外，取3.5 d囊胚進行驗證，一共7枚囊胚，鑒定到4個純合。查閱文獻后也證實了這一想法[18]，數據顯示CSF-1R基因敲除純合子表現出骨骼、感官和生殖異常與在破骨細胞、巨噬細胞和腦小膠質細胞中的嚴重缺陷有關。這一部分實驗數據提示下一步可以嘗試構建組織特異性的條件性基因雙鏈插入小鼠模型，用于基于人源化模型的特異性開放式藥物篩選。