表觀擴散系數值評估較低級別膠質瘤IDH-1突變狀態和瘤細胞增殖活性的價值

劉顯旺，柯曉艾，周青，李昇霖，鄧娟，薛彩強，黃曉宇，孫秋，周俊林

作者單位：蘭州大學第二醫院放射科，蘭州大學第二臨床醫學院，甘肅省醫學影像重點實驗室，醫學影像人工智能甘肅省國際科技合作基地，蘭州 730030

較低級別膠質瘤（lower-grade gliomas, LGG）包括世界衛生組織（World Health Organization,WHO）定義的Ⅱ～Ⅲ級的膠質瘤，約占所有成人顱內原發性中樞神經系統腫瘤的22%[1-3]，與WHO Ⅳ級的高級別膠質瘤相比，LGG 生長相對緩慢，但存在惡變風險[4]。異檸檬酸脫氫酶-1（isocitrate dehydrogenase 1, IDH-1）突變狀態是影響LGG 預后的重要因素，IDH-1 突變型膠質瘤對放化療更為敏感，預后常優于IDH-1野生型膠質瘤[5-6]，有研究[7]表明LGG患者IDH-1突變率高達70%。Ki-67 增殖指數常用于評估細胞增殖活性，與腫瘤惡性程度密切相關[8]。因此，術前準確評估LGG IDH-1 突變狀態和Ki-67 增殖指數，對于患者治療方案的制訂及預后評估具有重要意義。常規MRI對LGG IDH-1突變狀態和瘤細胞增殖活性的評估價值有限，擴散加權成像（diffusion weighted imaging,DWI）主要用于反映細胞內外水分子的運動情況，并可以通過表觀擴散系數（apparent diffusion coefficient,ADC）值進行定量評估，已廣泛應用于腦腫瘤的分級、鑒別及預后評估之中[9-11]。但鮮有研究使用ADC 值預測LGG IDH-1突變狀態，并評估其與Ki-67增殖指數間的關系。本研究旨在探討ADC值在評估LGG IDH-1突變狀態和瘤細胞增殖活性標記物Ki-67 增殖指數中的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年1月至2021年10月蘭州大學第二醫院經病理證實的LGG 患者病例。納入標準：（1）經手術病理證實為LGG，有明確的IDH-1 突變狀態和Ki-67增殖指數測定結果；（2）術前2周行頭顱T1WI、T2WI和DWI序列掃描。排除標準：（1）近期接受放、化療等干預措施；（2）MRI 圖像質量差，不能滿足ADC 值測量需要。最終共納入44例LGG患者，其中IDH-1突變型24 例，男14 例，女10 例，年齡29～66（46.54±9.15）歲；IDH-1 野生型20 例，男9 例，女11 例，年齡11～72（44.30±16.90）歲。本研究經蘭州大學第二醫院倫理委員會批準，免除受試者知情同意，批準文號：2020A-070。

1.2 掃描儀器與參數

MR檢查采用SiemensVerio 3.0 T超導掃描儀，患者取仰臥位，32 通道頭線圈。快速自旋回波（turbo spin echo, TSE）-T1WI掃描參數：TR 250 ms，TE 2.48 ms，FOV 22 cm×22 cm，矩陣256×256，層厚5 mm，層間距1.0 mm；TSE-T2WI 掃描參數：TR 4000 ms，TE 96 ms，FOV 22 cm×22 cm，矩陣256×256，層厚5 mm，層間距1.0 mm；平面回波（echo planar, EP）-DWI 掃描參數：TR 4500 ms，TE 102 ms，層厚5 mm，層間距1.0 mm，矩陣256×256，b值分別為0、1000 s/mm2。

1.3 圖像分析和ADC值測量

DWI 原始圖像傳入ADW 4.6 工作站后自動生成ADC 圖像，由2 名具有10 年以上神經影像診斷經驗的副主任醫師對所有圖像采用雙盲法進行閱片。避開壞死、囊變和出血區，于腫瘤實性成分進行ADC 值的測量，連續測量2～3 個層面，每個測量層面上放置8～12 個大小為15～20 mm2的感興趣區（region of interest, ROI），所有ROI 中最低的ADC 值即為ADCmin值，所有ADC 值的平均值即為ADCmean值，同時測量對側鏡像正常腦白質的ADC 值，以計算相對最小ADC 值（rADCmin=ADCmin/正常腦白質ADC）和相對平均ADC 值（rADCmean=ADCmean/正常腦白質ADC）。將兩名醫師測量的ADC值取均值后作為最終結果。

1.4 病理學檢查

所有腫瘤標本經手術切除后行HE染色后進行病理學分級，同時進行免疫組織化學染色以測定其IDH-1 突變狀態和Ki-67 增殖指數。IDH-1 突變檢測：聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）擴增測序。Ki-67 增殖指數：使用單克隆小鼠抗人Ki-67 抗體進行Ki-67 蛋白的免疫組化染色后，在瘤細胞染色密度最高的區域計數1000 個細胞的染色情況，Ki-67 增殖指數為陽性細胞數/總細胞計數，計數3 次，計算平均值作為最終測量結果。

1.5 統計學方法

采用MedCalc軟件進行統計學分析，P＜0.05認為差異有統計學意義。計量資料經正態分布檢驗后用均數±標準差表示，并使用獨立樣本t檢驗進行組間差異性比較。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線評估各ADC值對LGG IDH-1突變狀態的評估效能。同時，采用Pearson 相關分析評估LGG ADCmin、ADCmean、rADCmin和rADCmean與Ki-67增殖指數間的相關性。

2 結果

2.1 IDH-1 突變型與IDH-1 野生型組間ADC 值比較及ROC曲線分析

LGG IDH-1 突變 型組的ADCmin、ADCmean、rADCmin和rADCmean值均高于IDH-1 野生型組，組間差異具有統計學意義（P均＜0.05），見表1、圖1。ROC 結果顯示各ADC 值均能對 IDH-1 突變型和IDH-1 野生型LGG進行有效區分，其中，rADCmin鑒別效能最佳，以0.978 為最佳截止值，相應的AUC、敏感度、特異度、準確度、陽性預測值和陰性預測值分別為0.838、80.00%、83.33%、81.82%、80.00%和83.30%，見表2、圖2。IDH-1 突變型和IDH-1 野生型LGG 典型病例見圖3 和圖4.

圖1 箱 式 圖 顯 示LGG IDH-1 突 變 型 組 的ADCmin、ADCmean、rADCmin、rADCmean 均 分 別 大 于IDH-1 野 生 型 組。 圖 2 ADCmin、ADCmean、rADCmin、rADCmean預測LGG IDH-1 突變狀態的ROC 曲線，rADCmin預測效能最佳，AUC 值為0.838。LGG：較低級別膠質瘤；IDH-1：異檸檬酸脫氫酶-1；ADCmin：最小表觀擴散系數；ADCmean：平均表觀擴散系數；rADCmin：相對最小表觀擴散系數；rADCmean：相對平均表觀擴散系數；ROC：受試者工作特征；AUC：曲線下面積。Fig.1 Box plots showing that ADCmin,ADCmean,rADCmin,and rADCmean in the LGG IDH-1 mutant group were all greater than those in the IDH-1 wild-type group, respectively. Fig. 2 ROC curves of ADCmin, ADCmean, rADCmin, and rADCmean for predicting LGG IDH-1 mutation status, and rADCmin had the best predictive efficacy with an AUC value of 0.838. ADCmin: minimum apparent diffusion coefficient; ADCmean: mean apparent diffusion coefficient;rADCmin: relative minimum apparent diffusion coefficient; rADCmean: relative mean apparent diffusion coefficient; LGG: lower grade glioma; IDH-1:isocitrate dehydrogenase 1;ROC:receiver operating characteristic;AUC:area under the curve.

表1 IDH-1突變型與IDH-1野生型LGG組間ADC值比較Tab.1 Comparison of ADC values between IDH-1 mutant and IDH-1 wild-type LGG groups

表2 ADC值預測LGG IDH-1突變狀態的ROC曲線分析Tab.2 ROC curve analysis of ADC values in predicting LGG IDH-1 mutation status

圖3 男，40 歲，LGG（WHO Ⅲ級，IDH-1 突變型）。3A～3D：左側顳葉混雜信號占位，呈囊實性改變，與周圍組織分界欠清晰，并可見輕度水腫，實性成分DWI 呈高信號，ADC 呈 低 信 號，ADCmin=0.879×10-3 mm2/s，ADCmean=0.931×10-3 mm2/s，rADCmin=1.204，rADCmean=1.274；3E：病理圖示瘤細胞呈彌漫性排列，胞漿嗜酸，核漿比增大，可見異型核細胞及核分裂象（HE×100）；3F：免疫組化圖示腫瘤細胞增殖活躍，Ki-67 增殖指數約為45%（HC ×400）。LGG：較低級別膠質瘤；IDH-1：異檸檬酸脫氫酶-1；DWI：擴散加權成像；ADC：表觀擴散系數；ADCmin：最小表觀擴散系數；ADCmean：平均表觀擴散系數；rADCmin：相對最小表觀擴散系數；rADCmean：相對平均表觀擴散系數。Fig.3 Male,40 years old,LGG(WHO class Ⅲ,IDH-1 mutant type).3A-3D:A mixed-signal mass in the left temporal lobe,showing cystic and solid changes,the boundary with the surrounding tissue is not clear,with mild edema,the solid component is a high signal on DWI,and ADC is a low signal,ADCmin=0.879×10-3 mm2/s,ADCmean=0.931×10-3 mm2/s, rADCmin=1.204, rADCmean=1.274; 3E:The tumor cells are diffusely arranged on the pathology, with eosinophilic cytoplasm, increased nuclear-to-cytoplasmic ratio, and atypical nuclear cells can be seen and mitotic figures (HE ×100); 3F: Immunohistochemistry shows that tumor cells proliferate actively, and the Ki-67 proliferation index is about 45% (HC ×400). LGG: lower grade glioma; IDH-1: isocitrate dehydrogenase 1; DWI: diffusion weighted imaging; ADC: apparent diffusion coefficient; ADCmin: minimum apparent diffusion coefficient; ADCmean: mean apparent diffusion coefficient; rADCmin: relative minimum apparent diffusion coefficient;rADCmean:relative mean apparent diffusion coefficient.

圖4 男，58 歲，LGG（WHO Ⅲ級，IDH-1 野 生型）。4A～4D:右側顳葉混雜信號占位，呈囊實性改變，與周圍組織分界不清，并可見明顯水腫，病灶實性成分DWI 呈高 信 號，ADC 呈 低 信 號，ADCmin=0.571×10-3mm2/s，ADCmean=0.685×10-3mm2/s，rADCmin=0.837，rADCmean=1.004；4E：病理圖示瘤細胞排列密集，核漿比增大，核深染，異型性明顯，核分裂象多見（HE ×100）；4F：基因測序圖示為IDH-1野生型。LGG：較低級別膠質瘤；IDH-1：異檸檬酸脫氫酶-1；DWI：擴散加權成像；ADC：表觀擴散系數；ADCmin：最小表觀擴散系數；ADCmean：平均表觀擴散系數；rADCmin：相對最小表觀擴散系數；rADCmean：相對平均表觀擴散系數。Fig.4 Male,58 years old,LGG(WHO grade Ⅲ,IDH-1 wild type). 4A-4D:A mixed-signal mass in the right temporal lobe, showing cystic and solid changes, the boundary with the surrounding tissue is not clear, with obvious edema, the solid component is a high signal on DWI, and ADC is a low signal,ADCmin=0.571×10-3 mm2/s,ADCmean=0.685×10-3 mm2/s, rADCmin=0.837,and rADCmean=1.004; 4E: The pathological image shows that the tumor cells are densely arranged, the nucleocytoplasmic ratio is increased, the nucleus is hyperchromatic, the atypia is obvious, and mitoses are common (HE ×100); 4F: The gene sequencing image shows IDH-1 wild type. LGG: lower grade glioma;IDH-1: isocitrate dehydrogenase 1; DWI: diffusion weighted imaging; ADC: apparent diffusion coefficient; ADCmin: minimum apparent diffusion coefficient;ADCmean:mean apparent diffusion coefficient;rADCmin:relative minimum apparent diffusion coefficient;rADCmean:relative mean apparent diffusion coefficient.

2.2 ADC值與Ki-67增殖指數的相關性分析

LGG ADCmin、ADCmean、rADCmin和rADCmean與Ki-67 增殖指數間均呈不同程度的負相關關系（r=-0.552、-0.590、-0.532、-0.579，P均＜0.05），即 隨 著Ki-67 增殖指數的增加，各ADC 值均呈逐漸減低的趨勢，見圖5。

圖5 相關性線性熱圖示LGG ADCmin、ADCmean、rADCmin、rADCmean均與Ki-67增殖指數呈不同程度的負相關關系，相關系數r分別為-0.552、-0.590、-0.532、-0.579。LGG：較低級別膠質瘤；ADCmin：最小表觀擴散系數；ADCmean：平均表觀擴散系數；rADCmin：相對最小表觀擴散系數；rADCmean：相對平均表觀擴散系數。Fig. 5 Correlation linear heat map showing LGG ADCmin, ADCmean, rADCmin, and rADCmean all showed different degrees of negative correlation with Ki-67 proliferation index, with correlation coefficients r of -0.552, -0.590, -0.532, and -0.579, respectively. LGG: lower grade glioma; ADCmin: minimum apparent diffusion coefficient;ADCmean: mean apparent diffusion coefficient; rADCmin: relative minimum apparent diffusion coefficient; rADCmean: relative average apparent diffusion coefficient.

3 討論

IDH-1 突變狀態和Ki-67 增殖指數與LGG 患者預后密切相關[12-13]。本研究比較了IDH-1 野生型LGG 和IDH-1 突變型LGG 間ADC 值差異，并進一步分析了LGG ADC 值與Ki-67 增殖指數間的關系，結果表明ADC 值可用于術前評估LGG IDH-1 突變狀態，且與Ki-67 增殖指數間呈負相關關系，提示ADC 值在LGG術前評估中具有重要價值。據我們所知，這是第一個使用ADC 值評估LGG IDH-1 突變狀態，并探討其與Ki-67增殖指數間關系的研究。

3.1 IDH-1 突變型與IDH-1 野生型組間ADC 值的對比分析

DWI 作為MRI 功能成像手段之一，主要通過反映組織結構中細胞內外水分子運動的變化情況來提供有關腫瘤微環境的信息，并能以ADC值的形式進行簡單有效的量化評估[14-15]。ADC 值大小與腫瘤血管生成、細胞增殖活性、細胞密度等因素密切相關[16-18]。既往研究[15-17,19]表明，腫瘤侵襲性較強時，腫瘤新生血管增多，腫瘤細胞增殖活性明顯增加引起腫瘤細胞數目增多，腫瘤細胞相對缺氧引起的細胞毒性水腫也會導致細胞體積的增大，細胞數目和體積增加的同時，還伴隨異形核增多、核漿比例增大等改變，多種因素綜合作用，減少了水分子內外運動的空間，限制了水分子的擴散運動，最終導致ADC 值的降低。IDH-1野生型LGG異質性較強，腫瘤細胞代謝旺盛，新生腫瘤血管數目增多，豐富的血供及營養物質的輸送，極大提高了LGG 腫瘤細胞的增殖能力，也導致了IDH-1 野生型LGG 具有更強的侵襲性，與IDH-1 突變型LGG 相比，IDH-1 野生型LGG 腫瘤細胞數目、密度及核異型性明顯增加，使得細胞內外的水分子擴散程度受到明顯限制，因此表現為比IDH-1 突變型LGG 更低的ADC 值[20-21]。本研究結果顯示LGG IDH-1 突變型的ADCmin、ADCmean均顯著高于IDH-1 野生型，與既往研究結果相一致[22-23]。Villanueva-Meye等[24]對比78 例IDH-1突變型和22例IDH-1野生型彌漫性膠質瘤ADC值間差異后發現，IDH-1 野生型的最小ADC 值、平均ADC值均顯著低于IDH-1突變型，與本研究結果相仿。本研究還發現ADCmin在評估LGG IDH-1 突變狀態時的效能優于ADCmean，AUC 值達0.829，推測原因可能是由于ADCmin值測量區域代表腫瘤組織內腫瘤細胞最密集、增殖最活躍的區域，能最真實客觀地反映腫瘤的惡性程度，從而最大程度地減少腫瘤異質性所導致的腫瘤組織成分分布不均勻對所測ADC 值的干擾。此外，為消除不同患者個體間生理差異對測量ADC值的影響，本研究引入相對ADC值的概念，對測量的ADC值進行標準化處理，即用所測病灶的ADC值和對側鏡像正常腦白質的ADC 值的比值來表示，ROC 分析結果顯示，rADCmin和rADCmean的評估效能分別優于ADCmin和ADCmean，且在所有ADC 值中，rADCmin具有最佳的評估效能，其區分IDH-1 突變型和IDH-1 野生型LGG 的AUC、敏感度、特異度、準確度、陽性預測值和陰性預測值分 別 為0.838、80.00%、83.33%、81.82%、80.00% 和83.30%，這與Tan等[25]使用不同ADC 值評估彌漫性星型細胞瘤IDH-1 突變狀態的研究相一致。以上結果或表明，ADCmin值，特別是標準化處理后的rADCmin值能更真實可靠地反映腫瘤的病理生理學特點，或更有利于腦膠質瘤的綜合性評估。

3.2 LGG ADC值與Ki-67增殖指數表達的相關性分析

Ki-67是一種參與細胞周期及DNA合成的核內蛋白，存在于細胞增殖周期中的G1、S和G2期，而在G0期和靜止細胞中表達水平較低[26-27]，Ki-67增殖指數是常被用于評估Ki-67表達水平的定量參數，主要用于反映細胞增殖活性，與瘤細胞增殖情況和腫瘤惡性程度密切相關，在評估腫瘤侵襲性及患者預后等方面具有重要意義[28-29]。相關研究[30-32]表明，Ki-67增殖指數隨著腫瘤惡性程度及侵襲性的增加而增加，且與ADC值間存在負相關性。IDH-1野生型LGG的細胞增殖能力高于IDH-1 突變型LGG，表現為較高水平的Ki-67 增殖指數和較低的ADC 值[19-20]。本研究結果顯示LGG 的ADCmin、ADCmean、rADCmin、rADCmean和Ki-67 增殖指數均呈不同程度的負相關關系，與既往文獻報道一致[9,28]。Ki-67 增殖指數高水平表達時，提示腫瘤細胞增殖活性強、瘤細胞增殖活躍，從而引起腫瘤細胞數目和體積的增加，密集排列的腫瘤細胞減少了細胞內外水分子的活動空間，最終導致水分子的擴散運動受到限制，而ADC值主要是對細胞內外水分子擴散情況的量化反映，ADC值與Ki-67增殖指數間的負相關關系，與腫瘤細胞增殖時的病理生理學改變相吻合。Gihr等[19]分析26例低級別膠質瘤ADC 值與Ki-67 增殖指數間的關系后發現兩者之間呈顯著的負相關關系，與本研究結果相一致。因此LGG 患者可以通過MR 檢查獲得的ADC 值，在預測腫瘤IDH-1 突變狀態的同時，進一步分析腫瘤Ki-67增殖指數表達水平，以對腫瘤惡性程度進行更全面的評估。綜上，本研究結果在進一步驗證ADC 值與Ki-67 增殖指數間關系的同時，更說明了ADC 值是評估LGG IDH-1 突變狀態時較為可靠的量化參數。

3.3 本研究的局限性

本研究存在一定的局限性。首先，本研究為單中心的回顧性研究，納入的患者量相對較小；其次，進行ADC 值測量時選擇的ROI 可能存在肉眼難以分辨的微囊變區域，從而影響最終測量值的準確性，并且ADC 值測量區域未能與Ki-67 增殖指數計數區域保持完全一致。未來將擴大樣本量、聯合多個中心，開展進一步的研究。

綜上所述，本研究結果表明ADC值可用于術前評估LGG IDH-1突變狀態和瘤細胞增殖活性，為患者臨床治療方案制訂和預后評估提供參考依據。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。