肝細胞生長因子與肺纖維化發生發展相關性的研究進展

李青原 馮同 鄭鵬城 王波 李萬成

肺纖維化 (pulmonary fibrosis, PF) 是一種治療選擇有限的慢性、進行性、肺間質性纖維化疾病，它是多種異質性間質性肺疾病的終末階段。肺纖維化的特征是肺泡上皮細胞的反復損傷和眾多信號通路被異常激活，通過多種機制，肺泡上皮細胞、肌成纖維細胞、巨噬細胞和成纖維細胞的代謝組學異常導致異常的膠原合成和氣道重塑[1]。隨著全球老齡化人口的迅速增加，肺纖維化發病率和患病率都在增加，患者被診斷時的中位數年齡為 66 歲，診斷后平均生存期為 2～4 年[2]。盡管過去對PF發病機制進行了廣泛的研究，但它的潛在機制仍然知之甚少。肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是一種多肽生長因子，具有多種生物學效應，既往的研究表明，HGF具有抗纖維化作用[3]，在這篇文章中，我們概述了HGF相關生物學效應及在肺纖維化疾病治療中的潛在作用。

肝細胞生長因子概述

一、HGF結構及特點

20世紀80年代早期，科學家在肝切除大鼠血清中發現一種激素樣物質，其具有刺激培養肝細胞DNA合成的能力，能促進肝細胞生長，進而將該激素類物質稱為肝細胞生長因子[4]。HGF是由二硫鍵連接組成的異二聚體，在細胞外可被蛋白酶水解為2條鏈：69 kDa的α(重鏈)和34 kDa的β(輕鏈)[5]；HGF由間充質細胞以前體形式(proHGF)產生，在正常組織中檢測到的HGF分子主要是單鏈非活性的proHGF，proHGF主要通過肝細胞生長因子激活因子(hepatocyte growth factor activitor,HGFAC)和細胞II型跨膜絲氨酸蛋白酶(type II trans-membrane serine proteases,TTSP)轉換為具有活性的HGF[6]。

二、HGF受體結構及特點

HGF與其特異受體間充質上皮轉化因子(mesenchymal-epithelial transition factor,c-Met)結合促進多效性信號傳導，c-Met是一種酪氨酸激酶跨膜受體，由一個50 kDa的細胞外亞基，通過二硫鍵連接到一條145kDa 的鏈上，該受體在平滑肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞等多種細胞上表達[7]。活性HGF與c-Met結合，會誘導激酶結構域激活環中Y1234/Y1235 殘基磷酸化，隨后通過在羧基末端Y1249 和 Y1356 的磷酸化，形成蛋白結合區來接受配體蛋白并轉導下游信號通路，相關配體蛋白如 GRB2、SOS、RAS、RAF、MEK 或 ERK[8-9]。

三、HGF/c-Met生物學功能

HGF/c-Met信號主要通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/細胞外信號調節激酶(extracellular signal—regulated kinase,ERK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(The phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)、核因子κB(unclear factor of kappaB,NF-kB)和轉錄激活因子3/5(signal transducer and activator of transcription 3/5,STAT3/5)信號通路從細胞膜傳遞到細胞核(圖1)，這些信號通路，影響多種生物學活動，包括組織細胞形態發生、增殖、存活、血管生成、運動和侵襲，HGF/c-Met控制系統對生理條件下的發育和內環境穩定起至關重要的作用[10-11]，研究發現，HGF/c-Met系統還具有抑制纖維化和抗腫瘤等多種功能(圖2)[12]。在抗纖維化過程中，盡管HGF表達和分泌的確切機制尚不清楚，但過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)已被證明具有轉錄調節HGF基因啟動子的能力[13]。

圖1 HGF信號傳導通路

圖2 HGF保護組織器官相關機制

肝細胞生長因子抗肺纖維化機制

一、HGF調控免疫反應

肺損傷的初始免疫炎癥反應觸發被認為是肺纖維化最有可能原因。在有關的潛在觸發因素(危險因素)包括接觸煙草煙霧、病毒感染、職業/環境接觸無機材料(金屬、木材和硅塵)和無機塵埃以及空氣污染刺激下，I型肺泡上皮細胞(I alveolar epithelial cells,AECI)和AEC層產生破壞，肺組織損傷后，生長因子、基質因子和細胞外基質驅動的信號，共同激活多種修復途徑，同時啟動肺泡上皮-間充質細胞轉化、促纖維化細胞因子(如趨化因子、蛋白酶、TGF-β)釋放導致炎性細胞募集、成纖維細胞增殖和細胞外基質擴張，最終導致組織纖維化[14-15]。

1 HGF和上皮間質轉化 最近的研究表明，上皮-間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是肺纖維化發病的關鍵因素[16]。EMT是指上皮細胞通過特定的過程轉化為間質細胞的生物學過程。在EMT過程中，上皮細胞極性、細胞間粘附和上皮標記物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達降低，同時細胞遷移能力、α-平滑肌細胞肌動蛋白(Smooth muscle actin-α,α-SMA)表達增加，研究表明肺泡上皮細胞經過EMT可轉化為肌成纖維細胞，并可能增加細胞外基質的沉積[17-18]，EMT在肺、肝、腎等組織臟器纖維化過程中發揮著重要作用，TGF-β1誘導的EMT參與了肺纖維化的發病機制[19-20]。 Wei Junjun等[21]發現TGF-β1是腎細胞EMT的促動因子，可抑制HGF的表達。然而，間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)通過增加 HGF 水平和降低TGF-β1水平來阻止EMT進展，HGF是MSCs 抗纖維化的關鍵因素之一。 Yu Mina等[22]在高濃度葡萄糖環境中培養人腹膜間皮細胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)，發現將HPMC暴露在高葡萄糖中，會導致抗纖維化細胞因子、HGF表達減少，外源性給予HGF治療導致了可以阻斷高葡萄糖誘導的EMT，改善腹膜纖維化，預防EMT過程可預防組織纖維化發生發展。

2 HGF與轉化生長因子-β1 轉化生長因子-β1((transforming growth factor beta1,TGF-β1)是組織(肺、腎、肝和心臟)纖維化的關鍵介質，主要通過激活其下游Smad信號而導致纖維瘢痕組織形成。不同的TGF-β信號傳導通路在纖維形成中發揮不同的作用。大量研究表明，TGF-β1/Smad通路失調是組織纖維化的重要致病機制。Smad2和Smad3是促進TGF-β1介導的組織纖維化的兩個主要下游調節器，在參與TGF-β1介導的纖維化中發揮重要影響[23]。Shibnath Ghatak在研究小鼠肺纖維化模型中發現，HGF通過干擾 TGF-β1 信號傳導來抑制TGF-β1刺激的膠原蛋白Ⅰ和α-SMA的表達,有效緩解小鼠肺纖維化，證實了HGF/c-Met通路在間質性肺病的發病機制中的重要作用[24]。Lan Yingwei等[25]通過移植制瘤素 M 預處理的間充質干細胞，改善了博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠的纖維化程度，證實機制與通過HGF的旁分泌作用減輕肺纖維化有關，如果敲除HGF基因，會消除間充質干細胞對 TGF-β1 誘導的纖維蛋白過表達的抑制作用。Yi Xin 等[26]發現，HGF是肺、腎和肝纖維化過程中的一種抗纖維化因子，增加心肌成纖維細胞中HGF水平會減弱TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞增殖、轉化和分泌功能，HGF是TGF-β1調節心臟成纖維細胞轉化的負調節因子。

3 HGF與細胞外基質 在肺纖維化過程中，成纖維細胞和肌成纖維細胞進行性增殖，以及細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的廣泛沉積為纖維化發生發展過程中的重要特征。肌成纖維細胞在ECM沉積中起關鍵作用，TGF-β1是一種主要的促肌成纖維細胞的分化因子[27]。有研究顯示，在博萊霉素處理的肺纖維化小鼠模型中，間質肌成纖維細胞上發現c-Met表達，從博萊霉素處理的小鼠肺分離的肌成纖維細胞培養中，HGF增加了肌成纖維細胞凋亡。Shinya Mizuno等[28]由此確定HGF是誘導肌成纖維細胞凋亡和ECM降解的關鍵因子，而在纖維化肺中激活HGF/c-Met系統，可能是減輕肺纖維化進展的一個靶點。Cui Qingbo等[29]在研究大鼠的跟腱損傷模型中發現，肌成纖維細胞分化和ECM沉積都是肌腱瘢痕形成的重要組成部分，通過對大鼠損傷的跟腱局部注射 HGF(每只小鼠 2ng·μL-1)，組織學結果顯示 HGF 改善了大鼠手術切口引起的紊亂的膠原纖維，HGF可抑制 TGF-β1 誘導的肌成纖維細胞分化和 ECM 沉積。現在有充分的證據表明，HGF在各種器官的實質修復和保護中起著至關重要的作用。在肺部急性損傷時，HGF是一種有效的再生和細胞保護因子。通過早期HGF保護預防對肺實質的破壞，進而可阻斷后續的纖維化發展[30]。

二、HGF與結締組織生長因子

結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是人體組織中廣泛存在的一種多功能、富含半胱氨酸的肝素結合蛋白，分子量為38 kDa。CTGF協同上調生長因子，如TGF-β和胰島素樣生長因子1，通過調節成纖維細胞分泌和維持細胞外基質誘導纖維化，因此，CTGF是抑制成纖維細胞聚集誘導的更為特異的靶點[31-32]。Ilia Atanelishvili等人研究發現，對硬皮病肺成纖維細胞進行HGF處理，可減少組織中膠原蛋白、結締組織生長因子和α-SMA沉積，并提出HGF受體 MET 的一個小片段，是一種名為“M10”的肽，具有很強的抗纖維化特性[33]。Chen Jianquan等人通過研究TGF-β1和HGF調節人心房成纖維細胞中CTGF的表達，發現慢性心房顫動(chronic atrial fibrillation,CAF)患者組CTGF蛋白含量高于竇性心律(sinus rhythm,SR)組，CAF組患者左心房直徑更大、心房成纖維細胞中CTGF mRNA表達更高，TGF-β1和HGF通過上調mRNA和下調蛋白調節人心房成纖維細胞CTGF的表達，促進或抑制心房纖維化[34]。因此，抑制CTGF產生和激活的相關藥物，可能是預防或減輕肺纖維化進展的可行策略。

三、HGF與炎癥介質

肺纖維化的主要原因是炎癥細胞浸潤，大量的活性氧產生，導致急性炎癥進一步發展為肺損傷,NF-κB是一個多功能轉錄因子家族，它可調節大量與炎癥反應、細胞增殖和凋亡控制相關基因的轉錄，NF-κB信號在肺纖維化的治療中起重要作用[35]。研究顯示，HGF可以結合其受體c-MET來調節NF-κB信號，Ying Pang等人對實驗組大鼠用HGF治療2周，通過Western blot分析測定不同組大鼠肺中IκBα和NF-κBp65表達的相對水平，結果發現HGF顯著上調肺動脈高壓大鼠肺內IκBα和下調NF-κBp65的表達，通過減弱NF-κB信號，抑制實驗組大鼠肺內的炎癥反應[36]。Cheng Guiming等人[37]證實HGF是一種多功能抗纖維化因子，他們實驗研究發現，經過HGF治療后，血漿腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、白細胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)炎性因子濃度水平顯著降低，降低了參與NF-κB信號通路的促炎基因的表達水平，同時阻斷了實驗小鼠腎細胞中活化NF-κBp65的核輸入，HGF通過調節NF-κB信號通路顯著改善小鼠模型中II型糖尿病引起的腎衰竭。Cleide G da Silva等發現在人腎近端腎小管上皮細胞中，炎癥會誘導NF-κB 依賴性蛋白 A20的產生，產生的A20蛋白會抑制NF-κB 活化進而抑制炎癥反應，HGF會增加腎近端腎小管上皮細胞中的 A20 mRNA 和蛋白質水平，通過NF-κB 信號抑制炎癥反應[38]。

肝細胞生長因子在肺纖維化疾病診療進展

據報道，急性呼吸窘迫綜合征和肺炎患者切除的肺組織，在進行各種生物標志物檢測時顯示HGF水平升高。結節病可能并發肺纖維化。因此，HGF 可被視為一種新的生物標志物，用于識別早期具有較高肺纖維化風險的患者[39]。在特發性肺纖維化患者支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)的多重蛋白分析中，HGF具有組織損傷修復功能，IPF組BAL中HGF水平較對照組升高[40]。Hyung J.Chun等通過研究SARS-CoV-2感染后急性后遺癥中肺功能受損的免疫纖維化驅動因素，發現HGF通過誘導抗炎和抗氧化基因表達，促進急性肺損傷后的肺泡上皮和內皮修復，HGF是一種與急性中性粒細胞激活、纖維化信號傳導和肺泡上皮修復相關的血清標志物[41]。Matthieu Perreau等[42]在COVID-19感染后47名患者免疫學標記物中發現，HGF和C-X-C基序趨化因子配體13(C-X-C motif chemokine ligand 13，CXCL13)組合是患者隨訪期間死亡率的最佳預測因子。HGF是一種具有抗炎特性的多效性細胞因子，在肺組織修復中起著基礎性作用，CXCL13是一種與肺纖維化相關并調節B細胞成熟的促炎性趨化因子。HGF-R2019冠狀病毒疾病是對抗CXC13的細胞因子，防止COVID-19肺纖維化的最主要的反調節機制。

結語與展望

迄今為止，肺纖維化發生病因和機制尚未完全闡明，目前PF治療方式仍然很局限，且不能根本改善PF患者病情。肝細胞生長因子作為人體內一種保護性因子，具有多種生物活性。大量研究表明HGF可以通過調控炎癥因子、TGF-β信號通路、EMT、ECM降解等途徑改善組織纖維化。有臨床實驗證實，對已發生肺纖維化四名矽肺患者進行每周靜脈注射MSCs/HGF治療，6個月后患者咳嗽、胸悶癥狀和肺功能明顯改善，在12個月的隨訪期間，CT掃描顯示肺結節和網狀結節病變部分吸收[43]，但HGF用于臨床治療肺纖維化還需要進一步研究。