P38MAPK、caspase-3在顱腦動脈瘤中的表達及與預后的關系

高 捷，沈小娟

(南通大學附屬如皋醫院，江蘇省如皋市人民醫院神經外科，江蘇 如皋 226500)

顱腦動脈瘤屬于臨床神經外科常見腦血管疾病之一，中國成年人患顱腦動脈瘤比例可達7.5%[1]。顱腦動脈瘤是導致蛛網膜下腔出血的首要原因，具有高致殘率和致死率[2]。目前關于顱內動脈瘤的病因及發病機制尚不完全清楚，已有研究發現顱內動脈瘤的形成、發展過程與其瘤壁血管平滑肌細胞凋亡有關[3]。絲裂原激活蛋白激酶p38(mitogen-activated protein kinase p38，P38MAPK)作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中重要一員，廣泛參與細胞增殖、分化及凋亡，并在細胞惡性化過程中起重要作用[4]。半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)是導致各種細胞凋亡的活性因子，其可能與顱腦動脈瘤的形成及發展有關[5]。但目前國內外關于P38MAPK和caspase-3在顱腦動脈瘤瘤壁中的表達研究甚少，因此本研究采用免疫組織化學法測定顱腦動脈瘤患者瘤壁中P38MAPK、caspase-3表達水平，分析二者表達與患者臨床病理特征的關系，并對影響患者預后的相關因素進行分析，以期進一步了解顱腦動脈瘤發生發展過程，為疾病的預后評估提供更多參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年3月—2020年3月在本院行開顱手術治療的顱腦動脈瘤患者30例作為觀察組，另選取同期在本院行開顱手術治療的顱外傷患者20例作為對照組。觀察組納入標準：①觀察組均為術后病理檢查確診為顱腦動脈瘤，且均為動脈瘤破裂患者；②均為成年人，且術前均經過數字減影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)檢查，術后經病理檢查確診；③臨床病理資料完整患者。排除標準：①行開顱手術前已接受過相應介入治療患者；②合并有其他嚴重顱內腦血管疾病患者；③有精神性疾病。對照組患者經CT及MRI證實為非血管性疾病，既往無高血壓、糖尿病及高脂血癥病史。兩組患者性別、年齡、飲酒、吸煙相比，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between two groups

本研究經本院道德倫理委員會批準通過，患者及家屬均同意參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1技術路線 根據納入標準和排除標準選取在本院進行開顱手術治療的顱腦動脈瘤患者30例(觀察組)及顱外傷患者20例(對照組)，觀察組患者術前經DSA檢查確診，術中留取30個動脈瘤瘤壁組織(每例患者1個)；對照組患者術前經CT及MRI證實為非血管性疾病，術中留取20個正常動脈血管壁組織(每例患者1個)；免疫組織化學染色法分別測定組織標本中P38MAPK和caspase-3表達情況，得出結果，整理文章。

通過查閱相關文獻，發現P38MAPK和caspase-3可能與顱腦動脈瘤的形成及發展有關，且二者在顱腦動脈瘤瘤壁組織中的表達研究甚少，因此本研究以P38MAPK和caspase-3作為觀察指標進行探討。

1.2.2實驗試劑及儀器 兔抗人P38MAPK抗體(貨號：PL0304502)購于深圳市豪地華拓生物科技有限公司，兔抗人caspase-3抗體(貨號：AF-0012)購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；免疫組織化學染色試劑盒(貨號：abs50018)購買于愛必信(上海)生物科技有限公司；DAB顯色劑購于上海嶸崴達實業有限公司。

生物顯微鏡ML51購自北京金達陽光科技有限公司；Leica RM2245輪轉式切片機購自埃克森(北京)科技有限公司。

1.2.3免疫組織化學染色 應用免疫組織化學染色法分別測定組織標本中P38MAPK和caspase-3表達情況，具體步驟如下：①用切片機將組織石蠟標本切成3～5 μm厚度的薄片，烘干備用；②切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；③加入修復液進行抗原熱修復；④PBS洗滌后滴加過氧化氫(H2O2)室溫孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性；⑤PBS洗滌后滴加1%牛血清白蛋白進行孵育30 min，以封閉非特異性結合位點；⑥滴加P38MAPK或caspase-3一抗，4 ℃孵育過夜；⑦PBS洗滌后滴加生物素標記的二抗，37 ℃孵育40 min；⑧PBS洗滌后常規DAB顯色，并蘇木素復染；⑨梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察拍照。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.4結果判定 免疫組織化學染色結果中P38MAPK和caspase-3陽性表達表現為出現棕黃色或棕褐色顆粒[6](圖1)。采用雙評分半定量法對陽性結果進行判定，即由著色細胞相對百分含量和染色強度共同決定，其中染色程度評分標準：無染色記0分，淺黃色記1分，黃褐色記2分，棕褐色記3分；著色細胞相對百分含量評分標準：<5%記0分，5%～25%記1分，25%～50%記2分，>50%記3分。每張切片隨機選擇5個高倍視野(×400)觀察，免疫組化結果由染色程度與著色細胞相對百分含量評分二者乘積得到，劃分如下：0～1分記為陰性(-)，2～9分記為陽性。其中陰性代表低表達，陽性代表高表達。

圖1 P38MAPK、caspase-3表達(免疫組織化學 ×400)

1.2.5隨訪 對顱腦動脈瘤患者出院后進行復查或電話隨訪，隨訪時間為12個月，末次隨訪時間截止2021年3月31日，死亡患者以死亡時間作為隨訪截止期。隨訪期間觀察記錄患者腫瘤復發、生存情況。采用GOS評分評估預后：1～3分為預后不良，4～5分為預后良好。

1.3統計學方法 應用SPSS 24.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；Spearman分析觀察組患者顱腦動脈瘤瘤壁組織中P38MAPK與caspase-3表達的相關性；COX回歸分析影響顱腦動脈瘤患者預后的因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組患者組織中P38MAPK、caspase-3表達情況 觀察組患者P38MAPK陽性表達率(60.00%)顯著高于對照組(10.00%)，差異有統計學意義(P<0.05)。觀察組患者caspase-3陽性表達率(33.33%)顯著低于對照組(80.00%)，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者組織中P38MAPK、caspase-3陽性表達情況Table 2 The positive expressions of P38MAPK and caspase-3 in the tissues of patients between two groups (例數，%)

2.2P38MAPK、caspase-3在顱腦動脈瘤瘤壁中表達與患者臨床病理特征的關系 不同年齡、性別﹑飲酒、吸煙、動脈瘤前循環、動脈瘤大小<10 mm、動脈瘤多發的顱腦動脈瘤瘤壁組織之間P38MAPK低表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，Hunt-hess分級Ⅰ～Ⅲ級的顱腦動脈瘤瘤壁組織P38MAPK低表達率與Hunt-hess分級Ⅳ～Ⅴ級比較，明顯較高(P<0.05)；不同年齡、性別﹑飲酒、吸煙、動脈瘤前循環、動脈瘤大小<10 mm、動脈瘤多發的顱腦動脈瘤瘤壁組織之間caspase-3高表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，Hunt-hess分級Ⅰ～Ⅲ級的顱腦動脈瘤瘤壁組織caspase-3高表達率與Hunt-hess分級Ⅳ～Ⅴ級比較，明顯較高(P<0.05)，見表3。

表3 P38MAPK、caspase-3在顱腦動脈瘤瘤壁中表達與患者臨床病理特征的關系Table 3 The relationship between the expression of P38MAPK and caspase-3 in the intracranial aneurysm wall and the clinicopathological characteristics of patients (例數，%)

2.3顱腦動脈瘤瘤壁中P38MAPK與caspase-3表達水平的相關性 Spearman分析結果顯示，顱腦動脈瘤瘤壁中P38MAPK與caspase-3表達水平呈顯著負相關(r=-0.513，P<0.05)，見表4。

表4 顱腦動脈瘤瘤壁中P38MAPK與caspase-3表達水平的相關性Table 4 Correlation between P38MAPK and caspase-3 expression levels in intracranial aneurysm wall (例數)

2.4影響顱腦動脈瘤患者預后的單因素和多因素COX回歸分析 應用COX風險回歸模型對影響顱腦動脈瘤患者預后的單因素和多因素進行分析，變量賦值見表5。單因素分析顯示，飲酒、Hunt-hess分級、動脈瘤大小、動脈瘤數目、P38MAPK和caspase-3異常表達都是影響顱腦動脈瘤患者預后的危險因素(P<0.05)。多因素分析顯示，Hunt-hess分級、P38MAPK高表達和caspase-3低表達是影響顱腦動脈瘤患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表6～7。

表5 變量賦值表Table 5 Variable assignment table

表6 影響顱腦動脈瘤患者預后的單因素COX回歸分析Table 6 Single COX regression analysis of factors affecting the prognosis of patients with intracranial aneurysm

表7 影響顱腦動脈瘤患者預后的多因素COX回歸分析Table 7 Multivariate COX regression analysis of factors affecting the prognosis of patients with intracranial aneurysm

3 討 論

顱內動脈瘤表現為動脈管壁出現病理性局部擴張致使腦血管異常膨出，血管破裂出血之前，大多數患者無明顯的臨床癥狀和體征，但80%～90%的動脈瘤患者是因破裂出血引起蛛網膜下腔出血才被發現，出血后會引起一系列癥狀如頭痛、意識障礙、血壓升高記憶力下降、失語等，嚴重危害患者生命健康。引起顱內動脈瘤形成的因素有很多，包括先天性因素如動脈發育不良、腔內壓力高及后天性因素如動脈硬化、感染、創傷等[7-8]，但目前關于該疾病的發生機制尚不十分清楚。

MAPK是一組廣泛存在于細胞內的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。P38MAPK可被細胞外不同的刺激如神經遞質、激素、細胞因子等激活，從而將信號從細胞表面傳遞至細胞核內部的特定部位，使細胞做出相應的應答反應；另外，其還可調節細胞生長、增殖、分化、凋亡等生理過程，也參與細胞惡性轉化等病理過程[9-10]。在人腦膠質瘤中，P38MAPK呈現高表達，且其表達水平與膠質瘤的病理級別相關，隨著病理級別升高，P38MAKP表達逐漸增強，說明P38MAKP蛋白異常表達可能參與膠質瘤的惡性進展，檢測其水平有助于判定顱內膠質瘤的病情[9]。研究發現，三羥基黃酮藥物可通過抑制P38MAPK信號傳導通路來有效抑制小鼠腹主動脈瘤發生、發展，說明P38MAPK與動脈瘤的形成及發展密切相關[11]。本研究發現，觀察組患者P38MAPK陽性表達率較對照組高，且在顱腦動脈瘤患者年齡、性別、飲酒、吸煙、動脈瘤位置、動脈瘤大小及數目組間差異無統計學意義，而在動脈瘤Hunt-hess分級組間差異有統計學意義，提示P38MAKP在顱腦動脈瘤患者瘤壁中高表達，可能參與動脈瘤形成、發展和破裂。caspase-3是一種蛋白酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用[12]。研究表明，caspase-3蛋白的異常表達與多種癌癥相關[13-14]。另有研究顯示，組織蛋白酶B可能通過啟動Caspase機制，誘導血管平滑肌細胞凋亡，從而導致顱內動脈瘤的形成與生長[15]。上述結果均提示caspase-3表達可能參與胃癌、肝癌及動脈瘤等腫瘤發生、發展。本研究發現，caspase-3蛋白在顱腦動脈瘤瘤壁組織中的陽性表達率顯著低于正常動脈血管壁組織，且其表達水平與患者動脈Hunt-hess分級有關，提示caspase-3在動脈瘤發生發展過程中可能發揮重要作用。進一步分析發現，觀察組患者顱腦動脈瘤瘤壁組織中P38MAPK與caspase-3表達水平呈顯著負相關，推測二者可能同時參與動脈瘤發生、發展進程，并發揮一定拮抗作用。另外，COX回歸分析表明，Hunt-hess分級高(Ⅳ～Ⅴ級)、P38MAPK高表達、caspase-3低表達均是影響顱腦動脈瘤患者預后的獨立危險因素，提示應重點關注該類人群的病情發展，防止動脈瘤進一步惡化。

綜上所述，顱腦動脈瘤患者瘤壁組織中P38MAPK高表達、caspase-3低表達，二者呈負相關，且二者表達水平與患者Hunt-hess分級有關，是影響患者預后的獨立危險因素，推測其可能參與顱腦動脈瘤形成、發展并影響預后，但具體作用機制還有待深入探究。另外，因該研究納入樣本量有限，結果可能存在一定偏移，后期應致力于擴大樣本量，以進一步提高研究結果的可靠性。