白術、茯苓和珍珠不同配比的美白功能評價*

黃惠珠，惲 昊，溫博棟，張海容

(1 廣州華商職業學院健康醫學院，廣東 廣州 511399；2 廣州威溶特醫藥科技有限公司，廣東 廣州 510670；3 廣州華商學院，廣東 廣州 511399)

近年來，隨著大家對皮膚表面審美要求的提高，美白類化妝品受到越來越多東方女性的青睞。除此之外，在西方國家，美白產品被應用于無規律色素過度沉著的預防和治療中，如老年斑、雀斑等[1]。美白產品以抑制黑色素生成為主要途徑，黑色素生物合成的關鍵限速酶是酪氨酸酶，抑制酪氨酸酶的含量可以有效地限制黑色素的合成。隨著人們對美白類化妝品的質量和安全的日益重視，探尋合適的酪氨酸酶抑制劑在美白化妝品的研究開發中具有重要作用和良好的前景。

眾多研究表明，中藥作為現代化妝品中的原料，以其來源于大自然、對皮膚作用溫和、往往兼具營養和藥效雙重作用、使用安全放心等特點，在追崇安全、綠色、健康的時代中，越來越受到廣大消費者的青瞇[1]。

美白藥物的篩選實驗最常用的是酪氨酸酶活性抑制實驗，其方法成熟，結果可靠[2]。筆者尋經問典，從古人的智慧與經驗中，針對黑色素沉淀的皮膚問題，找尋合適的中藥加以配伍并進行體外藥效評價。以往研究發現，白術、茯苓、珍珠均對酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，但三藥配伍對酪氨酸酶活性的抑制作用未曾被報導，故本研究針對三藥配伍的不同配比進行體外研究，利用酪氨酸酶活性抑制實驗，觀察白術-茯苓-珍珠三藥配伍的美白功效，為后期中藥美白化妝品的開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

維生素C(色譜純，O19EB100374),上海源葉生物科技有限公司；α-熊果苷(色譜純，Y07D6C7197),上海源葉生物科技有限公司；酪氨酸酶(25 kU，E815BD0304)，生工生物工程(上海)股份有限公司；酪氨酸酶活性檢測試劑盒(1012109282)南京碧波生物科技發展有限公司；乙醇為分析純級，用水為純水；白術、珍珠、茯苓飲片,購于廣東瑞年大藥房，由張海容教授進行性狀鑒定,符合《中華人民共和國藥典》規定的基源。

1.2 儀器設備

722型可見分光光度計,上海解譜儀器有限公司;BSA224S型萬分之一電子天平,北京賽多利斯天平有限公司;KQ3200DE型超聲清洗儀,昆山市超聲儀器公司。

1.3 供試液的制備

本次實驗共設2個陽性對照組(維生素C、α-熊果苷)、9個樣品組，分別為白術組、茯苓組、珍珠組、白術-茯苓-珍珠6個不同配比組1:1:1、1:2:1、1:3:1、2:2:1、2:4:1、2:6:1。

維生素C、α-熊果苷分別加純水配制成濃度為4 mg/mL的供試液；白術、茯苓、珍珠飲片粉碎，過80目篩后備用。按比例稱取各組樣品，單藥組各稱1.0 g、配比組按比例(比例1即稱取相應藥材粉末1.0 g，比例2即稱取相應藥材粉末2.0 g，以此類推)進行稱量。分別選用三種不同極性的溶劑(純水、75%乙醇、無水乙醇)進行提取超聲提取，物料比為1:15,超聲30 min后過濾，濾渣再按上述方法進行提取，合并2次濾液，制成33.33 mg/mL的供試液原液，原液稀釋成10 mg/mL作為酪氨酸酶抑制試驗測試液。

1.4 溶液配制

酪氨酸酶溶液：25 kU酪氨酸酶粉末加入純水12.5 mL，配制成2000 U/mL。酪氨酸酶活性抑制試驗所需要的其他溶液，按照酪氨酸酶活性檢測試劑盒說明書要求進行配制。

1.5 酪氨酸酶活性抑制實驗

(1)待測液按照以下設置進行加樣，置于5 mL離心管中備用。空白組：50 μL純水+50μL酪氨酸酶溶液；陽性對照組：50 μL維生素C溶液+50 μL酪氨酸酶溶液、50 μL α-熊果苷溶液+50 μL酪氨酸酶溶液；純水提取組：50 μL供試液+50 μL酪氨酸酶溶液；75%乙醇提取組：50 μL供試液+50 μL酪氨酸酶溶液；無水乙醇提取組：50 μL供試液+50 μL酪氨酸酶溶液。

(2)按照試劑盒的使用方法進行檢測。分光光度計預熱30 min后，調節波長至475 nm，純水調零，往上述待測液中加入900 μL試劑一(主要成分是能與酪氨酸酶反應的底物)，立即開始計時，測定10 s(總時間)時475 nm處的吸光值；置于常溫下繼續反應180 s，測定190 s(總時間)時475 nm處的吸光值；每組供試液測試5次進行數據分析。酪氨酸酶的抑制率按照以下公式計算：

式中：A為空白組10 s(總時間)時475 nm處的吸光值；B為空白組190 s(總時間)時475 nm處的吸光值；C為供試液組10 s(總時間)時475 nm處的吸光值；D為供試液組10 s(總時間)時475 nm處的吸光值。

2 結 果

陽性對照組(維生素C、α-熊果苷)、9個樣品組，分別用純水、75%乙醇、無水乙醇提取后所得供試液，合計30組供試液對酪氨酸酶活性抑制率的結果，見表1所示。

表1 不同溶劑下樣品組對酪氨酸酶活性的抑制率比較

從表1可得，與空白對照組相比，陽性對照組、純水提取組、75%乙醇提取組、無水乙醇提取組所有供試液均對酪氨酸酶活性有抑制作用(p<0.01)。其中，維生素C組抑制率高達96.57%，α-熊果苷也達到57.67%。

純水提取組中除白術組以外，其他組的抑制率均高于α-熊果苷對照組。但均低于維生素C對照組的抑制水平。其中抑制率最佳的是白術-茯苓-珍珠(2:6:1)組(81.46%)，其次為白術-茯苓-珍珠(1:3:1)組(79.41%)。

75%乙醇提取的9個樣品組的抑制率均高于α-熊果苷對照組，除白術-茯苓-珍珠(2:6:1)組的抑制率略高于維生素C對照組外，其余均低于維生素C對照組的抑制水平。其中抑制率最佳的是白術-茯苓-珍珠(2:6:1)組(97.14%)，其次為白術-茯苓-珍珠(2:4:1)組(92.85%)，白術-茯苓-珍珠(1:3:1)組(90.56%)。

無水乙醇提取組的9個樣品組的抑制率均高于α-熊果苷對照組，但均低于維生素C對照組的抑制水平。抑制率最佳的是白術-茯苓-珍珠(2:6:1)組(88.56%)，其次為白術-茯苓-珍珠(1:3:1)組(82.28%)。

樣品組相同原料、相同配比、不同提取溶劑的情況下，酪氨酸酶抑制率存在一定的差異,抑制率從高到低為75%乙醇提取組>無水乙醇提取組>純水提取組。

3 討 論

皮膚正常所呈現的顏色是多種生物色素不同分布共同作用的結果，與光線折射以及皮膚厚度也有一定的關系，通常情況下黑色素在其中起主要作用[3]。酪氨酸酶是一種含銅離子的金屬酶，屬于多酚氧化酶，是在動植物及微生物體內廣泛存在的酶，是黑色素生成過程中一系列化學反應的限速酶。許多化妝品美白劑可以通過抑制酪氨酸酶的活性來抑制黑色素生成，從而發揮美白肌膚的作用[4]。酪氨酸酶活性抑制試驗是美白功效評價的經典實驗，酪氨酸酶底物如單酚類底物酪氨酸或雙酚類底物左旋多巴(levodopa, L-DOPA)可在酪氨酸酶的催化下生成多巴色素，多巴色素具有一定的吸光性，可通過測定吸光度來評估酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶抑制劑可抑制酪氨酸酶的活性，從而減少多巴色素的生成。因此，根據多巴色素含量的多少可評估酪氨酸酶的活性，從而推算出待測物對酪氨酸酶的抑制率[5]。運用分光光度計或酶標儀直接測定吸光度進行酪氨酸酶抑制劑篩選的方法，操作簡單，因此廣泛用于中藥提取物中酪氨酸酶抑制劑的初步篩選或已知成分對酪氨酸酶抑制能力的驗證。

本次研究運用超聲提取法，利用空化效應、機械效應和熱效應。當達到一定能量的超聲波作用于介質，介質被撕裂成很多小空穴，在一系列動力學過程產生空化效應，超聲空化會產生巨大的壓力，使整個生物體破裂瞬間完成，縮短了破碎時間，同時超聲波產生的振動作用加強了胞內物質的釋放、擴散和溶解，從而顯著提高提取效率[6]。維生素C又被稱為L-抗壞血酸，對皮膚有很多有益的作用，包括抗氧化、抗衰老和美白作用。醫學研究表明人類不能合成維生素C，大量口服皮膚中維生素C對皮膚中含量的增加也是極其有限，因此維生素C局部應用是增加皮膚濃度的唯一辦法，維生素C也成為美白化妝品的添加成分之一[6]。熊果苷是一種從熊果植物中分離的天然多酚，抑制黑色素的生成，可以促進B16黑色素瘤細胞凋亡，研究結果表明熊果苷可以作為皮膚美白的有效成分之一[7]。熊果苷具有兩種異構體，包括α-熊果苷和β-熊果苷，研究表明α-熊果苷的功效是天然熊果苷的10倍[8]。因此，本次實驗研究選取維生素C和α-熊果苷作為陽性對照。根據本次研究的結果可以看出，陽性對照組維生素C與α-熊果苷在相同濃度(4 mg/mL)下維生素 C 的抑制作用更強，與張國哲的實驗結果[2]類似。

經文獻記載，白術中含有的活性成分白術多酚對細胞內黑色素合成和酪氨酸酶活性均有不同的抑制作用[9]，茯苓的有效成分總三萜和茯苓新酸A對酪氨酸酶均呈現明顯的抑制作用，對小鼠黑色素瘤細胞存在一定的細胞毒性[10]，珍珠提取物富含的多肽成分可以在保證細胞安全生長的基礎上抑制黑色素的生成，并且在高濃度下通過抑制酪氨酸酶控制細胞內黑色素的含量[11],上述三種藥物均對酪氨酸酶的活性有一定的抑制作用。本研究中，不同溶劑提取的單體組白術、茯苓、珍珠對酪氨酸酶的活性均有較強的抑制作用，與張建華、沈喆鸞、楊安全等的實驗結果[6,11-13]類似。在同等濃度下，不同溶劑提取的單體組抑制率從高到低依次為茯苓>珍珠>白術，說明同濃度下茯苓對酪氨酸酶的活性抑制作用最強，美白效果最佳。

在三藥的不同配比組中，珍珠的量固定為1，一是因為珍珠相對于前兩者來說價格較高，二是珍珠在超聲提取的工藝下，對酪氨酸酶活性的抑制作用不如白術和茯苓。三藥的不同配比在固定白術和珍珠為1時，隨著茯苓的量占比的提高，抑制率也隨著變高。這和石成方[14]、鄧燕[15]、王雪梅[16]的結果相一致，高濃度的茯苓提取物對酪氨酸酶的活性的抑制率更高。三藥的不同配比在固定白術和珍珠為2:1時，發現其比白術和珍珠為1:1時的抑制率更高，這是因為白術提取物的高中低三個濃度對酪氨酸酶活性均有抑制作用，且高濃度抑制作用最強，美白效果更佳[17]。

綜合表1的結果，可以看出三藥6個不同配比的不同溶劑提取物，抑制率最佳的配比均為白術-茯苓-珍珠2:6:1，其次為純水提取組1:3:1,75%乙醇提取組2:4:1，無水乙醇提取組1:3:1。水提法適用于提取水溶性的成分，醇提法適用于提取有機成分，樣品組在同原料、同配比、不同提取溶劑的情況下，酪氨酸酶抑制率從高到低為75%乙醇提取組>無水乙醇提取組>純水提取組，可能是三藥的美白成分除總三萜類、多酚、多肽等有機有效成分之外，還有一部分為水溶性成分，在75%乙醇中的有效成分總溶解度更高所致。

三藥的6個不同配比組和單體組相比，除了1:1:1這一配比外，其他配比均高于任一單體組，說明三藥配伍對酪氨酸酶活性的抑制作用更強，其中以75%乙醇提取組2:6:1最佳，與陽性對照組維生素C無顯著性差異，且效果更佳。

4 結 論

通過對白術、茯苓、珍珠及三藥的6個不同配比組分別用純水提取、75%乙醇提取、無水乙醇提取后所得的溶液進行酪氨酸酶抑制率的測定，組間對比后可知75%乙醇提取的白術-茯苓-珍珠2:6:1配比組對酪氨酸酶的抑制率最高，美白效果最佳。

據調查顯示：80%的亞洲女性希望自己的肌膚白皙瑩潤，70%的歐美女性利用功能性美白產品來減輕或消除色斑[4,18]。權威市場研究公司尼爾森分析指出，在中國護膚品市場，有近30%的化妝品屬于美白類產品[19]。

維生素C作為天然活性成分,具有很高的抗氧化性能,以及具有美白祛斑、強健肌膚、促進膠原蛋白合成等功效,廣泛應用于護膚領域。維生素C具有穩定性差,對溫度、光、氧、金屬離子等具有很強的敏感性且其皮膚吸收能力差等缺陷,限制了維生素C的功效發揮[20]。

雖然α-熊果苷高濃度對酪氨酸酶活性抑制率能達到90%以上(受濃度的影響)，且在非紫外光條件下(日照光)使用較為安全，但α-熊果苷的化學合成尚未有高效立體專一性的合成方法，目前主要是酶合成法和生物轉化法，故價格昂貴(4000～8000元/kg)[21-23]。并且α-熊果苷的使用環境有所限制，故筆者認為來源更廣、更廉價、效果更優(相較于濃度為4 mg/mL的α-熊果苷)的白術-茯苓-珍珠組合更具市場優勢。將來可將此配方制成適宜的劑型，并進行透皮吸收、皮膚致敏等方面的研究，為進一步開發成美白產品提供實驗支持。