分散藍2BLN染料廢水脫色菌分離鑒定及特性研究*

王嶼森，范曉丹，張道虹，龔 毅，裴潤竹，劉 爽，周王旭，張博琳

(天津城建大學環境與市政工程學院，天津市水質科學與技術重點實驗室, 天津 300384)

近年，我國染料的年產量可以占到70%，位居世界首位[1-2]。染料廢水是難處理工業廢水之一，染料及其降解產物能夠產生具有誘變和致癌性質的劇毒芳香化合物[3-5]。而蒽醌染料是第二大類染料，在合成染料中占有重要的地位。蒽醌染料不僅結構復雜，難降解，還存在潛在的毒性，嚴重污染生態環境[6]。染料廢水的常規處理方法包括吸附、膜分離、好氧法厭氧法、化學氧化和高級氧化等。國內外以生物法為主，與物理、化學法相比，傳統生物法具有運行成本低、操作簡單、不會造成二次污染等優點[7-8]。近年來，人們致力于研發各種高效脫色菌株，利用其生物降解染料廢水中的污染物。已發現對染料廢水有降解作用的微生物，如細菌和真菌藻類等[9-10]，菌可通過自身的新陳代謝將染料降解中有毒物質[11]分解成小分子物質，大大降低了印染廢水的危害。

本研究從活性污泥中篩選對蒽醌分散藍2BLN染料廢水具有高效脫色能力的功能菌，研究影響其高效脫色的因素，探究其對蒽醌分散藍2BLN染料廢水的降解途徑。旨在為高效功能菌應用于處理分散藍2BLN染料廢水提供理論研究成果。

1 材料與方法

1.1 染料廢水

分散藍2BLN染料廢水：實驗室配制。

1.2 污泥馴化與菌種篩選

取天津市某污水處理廠的活性污泥，接種于含5 mg·L-1分散藍2BLN培養基中，30 ℃、轉速為150 r·min-1的條件下振蕩，梯度馴化。將馴化后的活性污泥經不同倍數(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8)稀釋后，取2 μL均勻的涂布于LB固體培養基上(含10 mg·L-1分散藍2BLN)，30 ℃條下靜置培養2 d，經過3～4分離純化后，得到一株對可降解蒽醌分散藍2BLN染料的高效功能菌，命名為GN-1。

1.3 培養基

LB固體培養基：蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂粉、氯化鈉、pH為7.0。

富集培養基：蛋白胨、酵母浸膏、氯化鈉、pH為7.0。

脫色培養基：蒽醌分散藍2BLN染料、葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉、三氯化鐵、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、無水氯化鈣、pH為7.0。

1.4 菌種鑒定

提取菌株基因組DNA作為模板，使用上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’和下游引物1492R：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’進行16SrDNA擴增、凝膠電泳和純化回收等步驟，將獲得的16rDNA序列通過BLAST程序與GenBank中核酸數據比對分析進行菌種鑒定。

1.5 菌種的脫色試驗

將菌株GN-1接種到200 mL液體培養基中，在30 ℃和轉速為150 r·min-1的條件下富集得到菌液，將20 mL菌液加入到180 mL脫色培養基中進行脫色試驗。30 ℃、pH=7、葡萄糖、蛋白胨為碳氮源條件下靜置培養，每隔2 h取上清液進行離心15 min，在538 nm處測離心后上清液吸光度，并依據下列公式計算脫色率。

(1)

式中：T為脫色率，%;A為復雜染料廢水初始吸光度;At為染料廢水反應后吸光度。

1.6 菌株GN-1對分散藍2BLN染料廢水脫色影響因素的研究

將20 mL富集后的菌株GN-1種子液接種到180 mL脫色養基中，研究不同碳氮源、溫度、pH值、分散藍2BLN染料廢水初始濃度、NaCl濃度以及菌種的接種量等因素，見表1所示，對菌株GN-1脫色能力的影響。

表1 脫色的影響因素

1.7 分析方法

1.7.1 紫外-可見光譜分析

將種子液按接種量為10%(V/V)接種于含60 mg·L-1分散藍2BLN的選擇培養基中，在30 ℃，150 r·min-1的培養箱中培養，隔一段時間從中取出4 mL，取離心后的上清液，用紫外—分光光度計在200～700 nm波長范圍內進行掃描，分析分散藍2BLN染料廢水的降解產物。

1.7.2 GC-MS分析

將處理后水樣和原水水樣固相萃取后按照一定條件進行GC-MS分析，分析分散藍2BLN染料廢水的降解產物。

2 結果的分析與討論

2.1 脫色菌株的鑒定

經分離、純化后得到菌株GN-1經染色后呈紅色，為革蘭式陰性菌，菌株GN-1的生理生化實驗結果，如表2所示。

表2 菌株GN-1的生理生化實驗結果

對菌株GN-1進行PCR擴增后測序，測得序列長13966bp，該序列與嗜水氣單胞菌屬(Aeromonashydrophila)的序列同源性較高,其登錄的序列號為MK007301.1，判斷該菌為嗜水氣單胞菌。

2.2 菌株GN-1脫色的影響因素

圖1 溫度對菌株GN -1脫色效果的影響

圖1是溫度對菌株GN-1脫色效果的影響，由圖1可得，在20～40 ℃對分散藍2BLN染料廢水的脫色率隨溫度的升高呈先升高后降低的變化趨勢。在20 ℃時，脫色率僅為40.9%，溫度在30～35 ℃時脫色效果顯著，脫色率都可達到80%以上，30 ℃時其脫色率高達85.29%，這是因為微生物的生物降解活性受溫度的影響[12]，溫度過低，抑制微生物的生長，使酶的活性降低，代謝效率下降，不利于菌株GN -1降解染料。當溫度40 ℃時脫色率明顯下降僅為30.19%，這是因為溫度的升高雖然可以增大酶的活性，但會加速菌株的老化和代謝衰退，因此菌株GN-1最適溫度為35 ℃，表明屬于嗜中溫菌。Bouraie等[13]在研究嗜水性氣單胞菌降解染料活性黑5時的實驗結果與本研究一致。

圖2 接種量對菌株GN -1脫色效果的影響

圖2是接種量對菌株GN -1脫色效果的影響。 由圖2可知，分散藍2BLN的脫色率與接種量呈正相關，當接種量為10%時，6 d脫色率為92%，接種量為20%時，僅4 d脫色率就高達96.27%，說明加大接種量可以縮短反應周期；當接種量大于10%時，4 d的接種量均達到80%以上，隨著反應時間的延長，脫色率并無明顯的增大，這是因為菌種濃度過大時，菌體之間相互競爭，導致菌株處于貧營養狀態，在一定程度上限制了菌株生長代謝，使得降解緩慢，由此可見當投加量大于10%時，脫色率增強的不明顯，所以從經濟效益角度考慮菌株GN-1的最佳接種量為10%。

圖3 鹽度值對菌株GN -1脫色效果的影響

圖3是鹽度對菌株GN-1脫色效果的影響，由圖3可見，當鹽度為1%時，脫色率達到最大值84.57%，當鹽度從3%～10%逐漸增大，分散藍2BLN的脫色率逐漸減小。這是由于鹽分過高，導致溶液中基質的傳輸速率下降，造成降解染料的關鍵性作用酶失活，能夠改變滲透壓，造成菌株脫水死亡，進而影響微生物對染料的降解。由此可以得出，菌株GN-1的鹽耐受性不是很好。

圖4是pH對菌株GN-1脫色效果的影響，由圖4可知，pH在2～10范圍時脫色率呈先增后減的趨勢，pH=2 時，脫色率僅為26.35%，菌株GN-1在pH=6～8時對分散藍2BLN染料廢水的脫色效果較好，可達70%以上。在pH為7時脫色率可達到83.83%，當pH值從7增加到10時脫色率快速下降，可知菌株GN-1最適pH為7。由此可知，菌株GN-1適合在弱酸、中性、弱堿性環境下降解分散藍2BLN染料廢水。據報道，克雷伯氏桿催產菌對活性黑5的脫色[15]以及StaphylococcusHominisSubsp.hominis DSM 20328對活性藍4的脫色[16]都表明菌株在中性條件能夠達到對染料更好的脫色率。

圖4 pH值對菌株GN -1脫色效果的影響

圖5和圖6是碳氮源對菌株GN-1脫色效果的影響，由圖5和圖6可見，以蛋白胨、葡萄糖為碳源時脫色率較高，均達到80%以上，而未投加碳源的脫色率僅為30.12%左右，此時分散藍2BLN對菌株GN-1的生長表現出一定的抑制作用，可知外加碳源可以明顯提高菌株GN-1的脫色能力，這表明菌株GN-1對分散藍2BLN通過共代謝的作用實現脫色。以亞硝酸鈉、蛋白胨作為氮源時脫色率都可達到80%以上，脫色效果明顯， 而以尿素為氮源時，脫色率最差，僅為61%。氮源對分散藍2BLN的脫色效果影響差別不是很大。

圖5 氮源對菌株N1脫色效果的影響

圖6 碳源對菌株N1脫色效果的影響

圖7是染料初始濃度對菌株 GN-1脫色效果的影響，從圖7中可知，染料初始濃度與脫色率呈負相關，染料濃度在20～60 mg/L時，脫色率均達到80%以上，而隨著染料濃度的遞增，脫色效果急速下降，當染料濃度為100 mg/L時，脫色率僅為27.08%，因為分散藍2BLN具有生物毒性，毒性隨濃度的增高而增大，且其代謝過程產生并積累的高濃度中間產物對微生物細胞也有一定的毒性，能過抑制微生物生長繁殖，降低了微生物生物量以及識別底物的相關性酶濃度的能力。

圖7 染料初始濃度對菌株GN-1脫色效果的影響

2.3 分散藍2BLN染料廢水的降解過程

本研究將高壓滅菌和未滅菌的種子液對分散藍2BLN的脫色效果進行比對，如圖8所示。高壓滅菌的種子液對分散藍2BLN的去除率呈現出現增加后減少的趨勢，且在2 d時出現拐點，其去除率主要由于吸附作用。而另一組未滅菌的實驗中，分散藍2BLN的去除率隨著反應時間的增加持續遞增，在反應10 d時，達到了100%的去除率。由此說明菌株GN-1對分散藍2BLN的降解主要以生物降解為主，也伴隨了前期的吸附作用，但是吸附的作用很小。

圖8 滅菌與未滅菌對分散藍去除率的影響

2.4 紫外-可見光譜分析

圖9是菌株GN-1降解分散藍2BLN染料廢水過程中的紫外-可見吸收光譜圖，由圖9可知，分散藍2BLN在最大波長625 nm處出現的吸收峰，隨著反應的進行逐漸降低，在10 d時基本消失，此現象是因為分散藍2BLN蒽醌鍵的斷裂，發色基團消失所導致。分散藍2BLN在238 nm(峰3)和280 nm(峰2)處的吸收峰也隨著反應時間的增加明顯降低，且在628 nm處發生了吸收峰的紫移，可能是因為-OH、-NH2等助色集團的脫落，導致發色基團上電子云密度下降所致；因此菌株GN-1對蒽醌分散藍的脫色主要是由于生物降解的作用。

圖9 紫外-可見吸收光譜圖

2.5 GC-MS分析

為進一步分析菌株GN-1降解分散藍2BLN的途徑，本研究采用了GC-MS對其不同時間段的降解產物進行分析，如表3所示，蒽醌分散藍2BLN的中間降解產物有N-(4-叔丁基苯基)(A)、鄰苯二甲酸二異丁酯(B)、N-2-(3,4-二羥苯基)-乙基甲胺(C)、2,3-二氫-1,3-二氧-1H-異吲哚-5-羧酸(D)、乙苯(E)、鄰二甲苯(F)、甲氧基乙酸甲酯(G)、3-amino-2,2,5,5-tetramethyl-1(H)。因而，推測菌株GN-1降解分散藍2BLN的途徑為共軛分散藍2BLN結構受到氧化酶的攻擊，導致了染料顯色基團斷裂，產生中間體A、B和C，化合物B通過氧化聚合轉化為D，再進一步轉化為G和H，化合物A和C分別轉化為E和F，最后化合物E、F、G和H發生環裂變和一系列的反應。

表3 分散藍2BLN降解中間產物(1)

續表3

3 結 論

(1)從活性污泥中馴化分離出分散藍2BLN染料廢水高效脫色菌GN-1，鑒定為嗜水氣單胞菌屬(Aeromonashydrophila)，將其命名為GN-1。

(2)菌株GN-1對分散藍2BLN的脫色存在共代謝作用，以葡萄糖和蛋白胨作為碳氮源時，可以顯著提高其脫色率；而鹽度與脫色率呈負相關，隨著鹽度增加直至10%時，脫色率僅為16.91%；pH和溫度的增加對菌株GN-1降解分散藍2BLN染料廢水呈現出先升高后降低的趨勢；加大接種量不僅可以增大脫色率，同時減短了反應周期；本研究最佳降解條件為：溫度為35 ℃；pH=7；鹽度1%；最佳接種量為10%。

(3)菌株GN-1對蒽醌分散藍2BLN的脫色以生物降解為主。共軛分散藍2BLN結構受到氧化酶的攻擊，導致了染料顯色基團斷裂，產生中間體氧化聚合轉化、環裂變反應。