不同等級濃香型大曲微生物群落結構與理化性質的比較分析

向港興，陳瑩琪，沈 毅，王 西，張亞東，羅惠波,3，黃 丹,3,*

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 自貢 643000；2.四川郎酒股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.釀酒生物技術及應用重點實驗室，四川 自貢 643000）

大曲作為中國白酒釀造過程中物系、酶系及其菌系的重要載體，為白酒發酵過程提供了豐富的微生物類群、功能酶及其風味物質，保證了糖化和發酵作用同時進行。而酒曲的質量是影響白酒風味品質的重要因素，目前行業內對大曲的質量評價還是多依賴于傳統感官指標和一些理化指標，且主要依據感官指標；大曲的感官評價包括外觀、斷面和香味，理化指標則有發酵力、糖化力、液化力、水分、酸度、淀粉含量等，從而將大曲分為多個等級。

近年來，學者針對大曲的質量指標也進行了相關研究，如炊偉強等對瀘州老窖大曲感官特征與微生物、理化指標和生化性能進行了關聯研究，研究表明優級大曲的液化酶、糖化酶、蛋白酶活力以及水分、酸度均高于普級大曲；且優級大曲的細菌、芽孢桿菌、霉菌、酵母菌和各生化性能也高于普級大曲，但是淀粉含量則低于普級大曲。明紅梅等對大曲的傳統感官評價指標以及生理生化（糖化力、液化力、發酵力、酯化力、酸度、淀粉、水分）評價指標進行了比較分析，結果發現傳統感官質量評價結果和理化指標評價結果均有一定差異。閆宗科等對鳳型大曲的感官評定與理化指標及培養工藝進行了分析，結果發現大曲的感官質量與理化指標之間有一定相關性。目前，微生物對大曲質量影響的研究還較少，沒有較為深入地研究微生物與大曲質量間的關系。本研究對生產上常用的優級曲和一級曲兩種大曲進行分析，利用高通量測序技術比較兩種等級大曲的微生物群落結構差異，并對大曲理化指標進行測定，分析其與微生物之間的相關性，以期發現影響大曲質量的微生物因素，為完善大曲評價指標，建立統一的大曲質量評價標準提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

兩種等級的大曲樣品取自四川瀘州某酒廠。各種等級樣品隨機取3 個樣本作為平行樣，分別測定大曲理化指標并提取DNA。大曲樣品的等級評定從外觀、斷面和香味3 個方面進行評價（表1）。

表1 優級曲和一級曲感官特征Table 1 Sensory characteristics of superior grade and first grade of Daqu

1.1.2 試劑

氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、可溶性淀粉、己酸、無水乙醇、葡萄糖（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；硫酸、鹽酸、冰醋酸（均為分析純）成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

Vortex-M旋渦混勻儀 上海滬析實業有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學儀器有限公司；智城恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；Illumina MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲質量指標的測定

大曲生化、理化指標的檢測參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

1.3.2 樣品總DNA提取

采用Omega.D5625-00土壤DNA提取試劑盒提取樣品中的總DNA，提取步驟參考試劑盒說明方法。

1.3.3 PCR擴增

經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，均滿足測序要求，細菌16S rRNA基因引物使用338F/806R（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’/5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），真菌引物使用ITS1F/ITS2R（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’/5’GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。

擴增程序：95 ℃預變性3 min，27 次循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃穩定延伸10 min，最后在10 ℃直到反應停止。

細菌擴增體系：4 μL 5×Fast緩沖液，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL上游引物（5 μmol/L），0.8 μL下游引物（5 μmol/L），0.4 μL FastDNA聚合酶，0.2 μL牛血清白蛋白，10 ng模板DNA ，ddHO補足至20 μL；真菌擴增體系：2 μL 10×Fast緩沖液，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL上游引物（5 μmol/L），0.8 μL下游引物（5 μmol/L），0.2 μL r聚合酶，0.2 μL牛血清白蛋白，10 ng模板DNA，ddHO補足至20 μL。

1.3.4 Illumina MiSeq測序

利用Illumina公司的NovaSeq PE250平臺對細菌和真菌序列進行測序分析（上海美吉生物醫藥科技有限公司），原始數據上傳至NCBI SRA數據庫。

1.4 數據處理

利用IBM SPSS Statistics 26和Microsoft Office Excel 2010對理化性質進行數據處理及分析；微生物群落結構分析基于美吉生物云平臺進行繪制稀釋曲線和堆積柱狀圖等。

2 結果與分析

2.1 不同等級大曲微生物群落結構多樣性分析

利用Illumina MiSeq平臺對優級曲和一級曲兩組曲樣的微生物群落進行測序分析，對各樣本優化后共得到了1 451 173 條有效細菌序列（平均每個樣本有120 931 條細菌序列）和1 453 187 條有效真菌序列（平均每個樣本有121 099 條有效真菌序列）。利用各樣本在不同測序深度時的微生物Sobs指數構建稀釋曲線（圖1），隨著測序深度的增加，曲線趨于平緩，表明測序量充足，能夠覆蓋所有樣本中的微生物群落。

用標準化的序列進行多樣性分析，得到了細菌和真菌的多樣性指數見表2。總體來說，優級曲中的物種豐富度和多樣性均高于一級曲，且所有大曲中細菌物種的豐富度和多樣性普遍高于真菌物種。從這個結果也可得出，大曲中細菌微生物類群比真菌微生物類群更加豐富，并且高質量大曲相比于低質量大曲有更加豐富的微生物區系。

圖1 細菌（a）和真菌（b）稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of bacterial (a) and fungal diversity (b)

表2 不同大曲微生物群落α多樣性指數Table 2 α-Diversity indexes of microbial communities in different grades of Daqu

2.2 不同等級大曲微生物群落結構分析

通過Illumina MiSeq測序技術對曲樣的細菌和真菌物種進行分析，得到屬水平上的物種組成情況。在屬水平上，根據平均相對豐度，將樣品中相對豐度小于0.01的物種歸為一類（others），如圖2a所示，優級曲和一級曲兩組曲樣中優勢細菌屬為高溫放線菌屬（）、魏斯氏菌屬（）、乳酸桿菌屬（）、克羅彭斯特菌屬（），這與其他學者的研究結果較為一致。

圖2 不同等級大曲細菌（a）和真菌（b）群落在屬水平的組成情況Fig. 2 Microbial community composition in different grades of Daqu at the genus level

其中高溫放線菌屬的相對豐度最高，是樣品中的第一優勢菌屬，在優級曲和一級曲中占比分別為21.17%和30.23%。高溫放線菌屬是大曲中重要的核心功能細菌微生物，在多種香型白酒釀造大曲中均大量存在，有較強的耐高溫特性，能夠適應大曲高溫的發酵環境，具有產高溫淀粉酶、蛋白酶和脫氫酶等能力。魏斯氏菌屬在兩組大曲中的相對豐度分別為13.48%和12.60%，屬于乳酸細菌，能夠代謝產乳酸、乙酸等有機酸類物質，有助于乳酸乙酯的生成和酒體風味的形成，是大曲和白酒釀造過程中的主要微生物之一。乳酸桿菌屬在兩組大曲中占比為11.35%和7.83%，也是白酒釀造過程中的重要功能微生物，具有較強的耐酸性，能夠產生乳酸和乳酸乙酯等多種代謝物質，對酒體中酸類和酯類等風味物質的協調有著重要作用；也有研究發現，窖泥中的微生物更傾向于代謝乳酸來產己酸，因此大曲中魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬等產乳酸的微生物，在進入窖池之后的后期代謝活動可能有利于己酸的生成，對濃香型白酒的主體香味物質己酸乙酯的生成有重要作用。克羅彭斯特菌屬是一級曲中第二大優勢菌屬，相對豐度占比為14.54%，而在優級曲中占比則相對較低低，為4.19%，在劉婷等對不同環境條件下生產的特香性大曲之間的差異研究中，發現克羅彭斯特菌屬為其中主要的細菌屬；任愛容等研究茅臺鎮不同主釀區醬香型大曲發現該菌屬也為優勢菌屬，結合研究報道，該菌屬在多種香型白酒釀造大曲均為優勢菌屬，有研究推測其可能與大曲的產香機理有著緊密的聯系，但是其在白酒釀造過程中的具體作用報道較少，還有待進一步的研究。其他報道中為優勢菌屬的芽孢桿菌屬（）在兩組曲樣中占比僅為2.33%和1.17%；葡萄球菌屬（）占比為4.58%和2.34%，在兩組大曲中占比均不高。芽孢桿菌屬是大曲中重要的功能微生物，能夠產淀粉酶和蛋白酶等多種酶類，與酯類、吡嗪、芳香族類、有機酸等白酒中重要風味物質的生成有緊密聯系，并且有助于減少白酒中的異雜味，以提升白酒的風味品質，在白酒釀造過程中發揮重要作用。葡萄球菌屬在自然環境中廣泛存在，但是對其在白酒釀造過程中發揮的作用還未明確。在本研究中，兩組曲樣也檢出了一定量的泛菌屬（），分別為2.23%和3.12%，有研究表明該菌屬在大曲發酵開始階段只在曲房空氣中大量存在，也有研究發現該菌屬為醬香型大曲中的優勢菌屬。而未分類奈瑟球菌科（unclassified_f__Neisseriaceae）在優級曲中占比較高，為3.80%，在一級曲中占比則低于1%，有研究表明其具有產脂肪酸的功能。

由圖2b可知，兩組大曲中真菌物種種類少于細菌，其中嗜熱真菌屬（）、未分類曲霉科（unclassified_f__Aspergillaceae）、嗜熱子囊菌屬（）為兩組樣品中占比較高的優勢物種。在優級曲和一級曲兩組曲樣中嗜熱真菌屬相對豐度為34.22%和44.14%，嗜熱子囊菌屬相對豐度為32.87%和8.42%，嗜熱真菌屬和嗜熱子囊菌屬是白酒釀造過程中重要的真菌微生物，已被多次報道在白酒釀造大曲和酒醅中大量存在，該類真菌產生的纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶等酶類具有較高的熱穩定性和活力，能夠降解代謝原料中的大分子多糖和蛋白質，對白酒釀造過程中微生物的生長繁殖和生香物質的產生有促進作用。霉菌中未分類曲霉科相對豐度分別為20.58%和36.95%，曲霉屬（）在優級曲中相對豐度較高為5.37%，一級曲中相對豐度則為1.18%，根霉屬（）在優級曲組中相對豐度為1.11%，而在一級曲中則低于1%，霉菌是大曲中重要的功能真菌微生物，能產糖化酶、液化酶、酯化酶等多種酶類，有利于大曲原料的降解發酵，被視作糖化降解動力的主要來源，其生長代謝繁殖情況也在一定程度上反映了大曲的質量特征。在一級曲中、相對豐度高于優級曲，分別為2.50%和1.29%，在優級曲中則低于1%。在本研究中，酵母在兩組樣品中的相對豐度均很低，除了屬于酵母目的、unclassified_p__Ascomycota、，其余如伊薩酵母屬（）、假絲酵母屬（）、絲孢酵母菌屬（）、復膜孢酵母屬（），雖然也可以在樣品中被檢測出，但是其相對豐度均低于1%，酵母菌是白酒釀造過程中產酒產香的主要微生物，但是在濃香型大曲中酵母菌的相對豐度較低，研究表明，在大曲發酵前期由于溫度較低，酵母菌大量生長繁殖，隨著發酵溫度逐漸升高，其他耐熱真菌、霉菌開始大量繁殖，酵母菌的生長則受到抑制，優勢地位逐漸被取代。

通過對兩組大曲在屬水平的微生物群落結構比較發現，曲樣中優勢細菌微生物種類和相對豐度差異不大，其中不同的是一級曲中克羅彭斯特菌屬遠高于優級曲樣品，而優級曲樣品中未分類奈瑟球菌科則明顯高于一級曲。對于真菌微生物而言，兩組大曲中的優勢真菌物種沒有明顯差異，但是不同大曲中優勢真菌物種相對豐度有較大差異；在優級曲中嗜熱子囊菌屬和曲霉屬遠高于一級曲樣品，未分類曲霉科則是一級曲高于優級曲。由此可以看出，兩種等級的大曲中優勢微生物物種一致，但是相對豐度有著一定差異，細菌優勢微生物中克羅彭斯特菌屬和真菌優勢微生物中的嗜熱子囊菌屬和霉菌均有較大的差異，這可能也是導致大曲質量存在差異的原因。

2.3 不同等級大曲差異微生物分析

為了進一步分析不同等級大曲微生物的差異，利用LEfSe分析解析兩組大曲中的差異微生物，并結合Wilcoxon秩和檢驗對兩組樣品的差異微生物的相對豐度進行評估，獲得優級曲和一級曲中具有顯著差異的物種，兩組大曲中細菌差異微生物結果如圖3所示。

圖3 細菌LEfSe多級物種層級樹圖（a）、LDA柱形圖（b）和兩組比較秩和檢驗條形圖（c）Fig. 3 Bacterial LEfSe multi-level species hierarchical tree diagram (a),LDA histogram (b), and bar graph of rank sum test between two groups (c)

從圖3a、b可以看出，在屬水平兩組大曲中共檢測出9 種差異微生物，線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞3，其中優級曲中差異物種為泰氏菌屬（）、腸球菌屬（）、乳球菌屬（）、、嗜蛋白菌屬（）、紅球菌屬（）、變形桿菌屬（），一級曲中差異微生物為沙雷氏菌屬（）、g__unclassified_c__Alphaproteobacteria。且優級曲的紅球菌屬、變形桿菌屬、乳球菌屬、嗜蛋白菌屬、腸球菌屬的相對豐度顯著高于一級曲（＜0.05）（圖3c）。一級曲中的沙雷氏菌屬極顯著高于優級曲（＜0.01），雖然其并未在白酒釀造中體現出功能，但有可能通過微生物的相互作用影響大曲微生物菌群結構；g__unclassified_c__Alphaproteobacteria菌屬顯著高于優級曲。兩組大曲差異細菌微生物中乳球菌屬雖然相對豐度低于1%，但是具有水解蛋白和產生特征風味物質的能力，被廣泛應用于發酵乳制品中（干酪、酸奶、酸奶油），雖然在白酒釀造過程中的研究報道較少，但是其產酯、酸、酮等風味物質的能力在白酒釀造過程中發揮的作用也值得關注。

圖4為兩組曲樣中真菌物種LEfSe分析和差異顯著性檢驗結果，可知在屬水平上，兩組大曲中檢測出差異物種共有9 種（LDA＞3）。其中優級曲差異微生物為嗜熱子囊菌屬（）、g__unclassified_p__Ascomycota、根霉屬（）、假絲酵母屬（）、；一級曲中的差異微生物為耐干霉菌屬（）、、、未分類曲霉科（g__unclassified_f__Aspergillaceae）。優級曲中的嗜熱子囊菌屬、g__unclassified_p__Ascomycota、根霉屬、假絲酵母屬、相對豐度均顯著高于一級曲，而一級曲中的耐干霉菌屬、未分類曲霉科的相對豐度顯著高于優級曲。

圖4 真菌LEfSe多級物種層級樹圖（a）、LDA柱形圖（b）和兩組比較秩和檢驗條形圖（c）Fig. 4 Fungal LEfSe multi-level species hierarchical tree diagram (a),LDA histogram (b), and bar graph of rank sum test between two groups (c)

兩組大曲中的差異微生物分析結果表明，細菌差異微生物均是樣品中相對豐度較低的一類物種，除了乳球菌屬，其他微生物在白酒釀造過程中的功能暫未見報道；而真菌差異微生物不同的是，其中嗜熱子囊菌屬、未分類曲霉科是樣品中的優勢真菌物種，且大部分差異真菌微生物均在白酒釀造過程中發揮重要的作用，如嗜熱子囊菌屬、未分類曲霉科、根霉屬、假絲酵母屬等。因此可以推測，正是這些真菌微生物，特別是嗜熱子囊菌屬、未分類曲霉科在制曲過程中大量生長繁殖，并產生各種代謝產物，最終導致了大曲質量之間的差異。

2.4 不同等級大曲理化、生化指標的差異

大曲理化指標如水分、酸度等在一定程度上能夠很好地反映出大曲的質量，也是目前大曲質量評價的重要指標，生化指標則反映大曲中酶系的功能組成以及微生物的生長繁殖情況。利用SPSS軟件采用單因素方差分析，比較兩種等級大曲的理化指標差異，分析結果見表3。

表3 不同大曲樣理化性質Table 3 Physicochemical properties of different grades of Daqu

從表3可以看出，兩組曲樣的水分、總酸含量、pH值均有顯著差異，大曲中水分含量主要受到曲房溫度、濕度以及微生物生長特別是絲狀微生物的影響，而較低水分含量不利于微生物的生長代謝活動，兩組大曲的水分均低于13%，其中優級曲水分顯著低于一級曲；總酸含量是微生物生長過程中代謝產酸以及脂肪、淀粉和蛋白質降解生成酸類物質的總和，能夠在一定程度上表征大曲發酵過程中微生物的生長代謝情況，優級曲的總酸含量顯著高于一級曲，pH值則顯著低于一級曲，且兩組總酸含量均在0.9～1.3 mmol/10 g之間，達到了一級曲質量標準。糖化力和液化力大小反映了大曲中糖化酶和液化酶的酶活力大小，其主要由霉菌和芽孢桿菌產生，有研究表明絲狀真菌能夠提高大曲的糖化力，其中優級曲液化力大小、糖化力大小均顯著低于一級曲（＜0.05）。酯化力反映了大曲中酯化酶催化酸類和醇類物質生成酯類化合物能力的大小，發酵力則是體現了大曲中微生物發酵產酒的能力，也在一定程度上反映了微生物的生長代謝情況。可知，優級曲的酯化力顯著高于一級曲樣品，發酵力也大于一級曲，但是沒有顯著差異。

2.5 大曲理化指標與微生物的相關性分析

為了進一步解析大曲理化指標與微生物之間的關系，利用冗余分析（redundancy analysis，RDA）兩者之間的相關性。由于很多理化因子之間存在著較強的共線性關系，因此首先通過方差膨脹因子（variance inflation factor，VIF）分析，篩選去除共線性較強（VIF＞10）的理化因子，最終保留了酸度、pH值和發酵力作為重要理化變量用于后續的RDA。

圖5 細菌（a）、真菌（b）與理化指標的RDAFig. 5 Redundancy analysis of bacteria (a) and fungi (b) versus physicochemical indicators

圖5展示了大曲微生物中相對豐度前10的細菌和真菌物種與大曲理化指標之間的關系。細菌中的魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬和真菌中的嗜熱子囊菌屬與pH值和發酵力呈正相關，魏斯氏菌屬、乳酸桿菌屬等這類產酸微生物在大曲中大量存在，可能也是導致優級曲pH值顯著低于一級曲的原因，而高溫放線菌屬、克羅彭斯特菌屬與pH值呈負相關，可能的原因是這兩類微生物都屬于放線菌，更適應于在中性或微堿性的環境中生存，因此在一級曲中這兩類微生物的相對豐度均遠高于優級曲；而對大曲發酵力而言，由于不管是酵母菌的乙醇發酵還是細菌乙醇發酵，乙醇的產生都是通過丙酮酸脫羧成乙醛后被還原為乙醇，即乙醇和CO具有伴生關系，因此大曲發酵力是以大曲中微生物產CO的量表征。但是，在發酵力測定條件下，大曲微生物仍然存在有氧呼吸，即微生物存在三羧酸循環代謝途徑，該過程盡管沒有乙醇的合成，但卻存在CO生成。同時，異性乳酸或同型乳酸發酵條件下也會有CO的生成。因此分析結果顯示這幾類微生物與發酵力呈正相關，并不意味這幾類微生物與乙醇的合成呈正相關。

3 結 論

對優級曲和一級曲兩種等級大曲的微生物群落結構與理化指標進行了比較分析，并結合數理分析法研究了微生物與理化指標之間的關系。通過對兩種等級大曲的微生物群落結構進行分析，結果表明兩種大曲的優勢物種基本一致，但是物種間的相對豐度有較大差異；經LEfSe分析并結合Wilcoxon秩和檢驗，結果發現兩種等級的大曲之間的細菌差異微生物均為樣品中的低豐度物種，而真菌差異微生物中的、未分類曲霉科為大曲中優勢物種，且相對豐度具有顯著差異；理化分析結果表明，兩種等級的大曲理化性質除了發酵力外均有顯著差異，結合RDA發現乳酸桿菌屬、魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬與總酸含量和發酵力呈正相關。這些結果說明了不同等級大曲的優勢微生物相對豐度存在較大差異，且理化指標之間也存在顯著差異，特別是嗜熱子囊菌屬和未分類曲霉科在兩種等級大曲中的相對豐度差異顯著，與大曲的理化性質息息相關，而大曲中這些優勢真菌微生物的顯著差異可能就是影響大曲質量的重要微生物因素。前述結論表述了對大曲質量有重要影響的微生物類群，為進一步完善大曲評價指標，建立濃香型大曲質量評價標準提供了理論參考。