胸苷激酶1磁微?；瘜W發光檢測方法的建立和性能評估

劉鳳林，郭金雙，2，柴 謙，楊 陽，孫秋艷

（1.山東省食品藥品審評查驗中心，山東 濟南 250022；2.中國科學院福建物質結構研究所結構化學國家重點實驗室，福建 福州 350002 ；3. 山東省菏澤市單縣中心醫院，山東 菏澤 274399）

胸苷激酶1（thymidine kinase 1, TK1）是細胞增殖周期中嘧啶補救合成途徑的關鍵酶之一，是一種新的細胞增殖特異性標志物，可用于評估細胞分裂增殖周期，在腫瘤的早期篩查、腫瘤分期評估、治療效果監測和預后評價中的作用日益受到關注[1-2]。TK1 水平檢測在乳腺癌、肺癌、胃癌等惡性實體瘤監測方面的應用價值較高[3-4]。作為一種優選評估腫瘤細胞增殖速率的標志物，TK1 在健康人血清中的含量極微或檢測不到，但其在惡性腫瘤患者體內會隨著腫瘤細胞的急劇增殖而升高[5-7]。因此，建立一種高效靈敏、簡便快捷的TK1 檢測方法具有很重要的現實意義。

化 學 發 光 免 疫 分 析( Chemiluminescence immunoassay，CLIA) 是將化學發光技術與免疫分析方法相結合的一種新型分析方法，其具有高靈敏度、強特異性、操作簡便快捷等優點，在多個檢測領域得到了廣泛應用[8-9]。目前，尚未有TK1 磁微?；瘜W發光檢測方法的報道。本實驗使用TK1 抗體-磁微粒偶聯物結合并分離TK1 蛋白，TK1 配對抗體- 吖啶酯發光劑發光，建立了一種TK1 磁微粒化學發光檢測方法，為TK1 的高靈敏度、強特異性、準確檢測提供一種新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羧基磁微粒（貨號MS04C）購自南京瑞貝西生物科技有限公司；TK1 抗體對（CABT-16288MH&CABT-L869） 購 于 美 國Creative Diagnostics（CD）公司；重組人胸苷激酶1 抗原（8180-TK）購自美國R&D 公司；吖啶酯（貨號A690047）購自生工生物工程（上海）有限公司；1- 乙基-（3- 二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，貨號22980）、N- 羥基磺基琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）購自美國Sigma 公司?；瘜W發光檢測儀購自重慶科斯邁生物科技有限公司（型號：SMART500S）。發光底物（含激發液和預激發液，貨號：6E23-82 和6C55-82）購自雅培公司。

1.2 抗TK1 包被抗體-磁微粒偶聯物的制備

羧基磁微粒采用EDC/sulfo-NHS 方法活化，然后與抗TK1 抗體偶聯。具體步驟為：將羧基磁微粒用磁微粒緩沖液（0.05 M 嗎啉磺酸，pH 6.0）洗滌3 次（200 μL/ 次），加入等量的EDC 和sulfo-NHS，37℃條件下振蕩活化25 min ；借助磁力架用磁微粒緩沖液洗滌2 次后（200 μL/ 次），加入抗TK1 抗體（用磁微粒緩沖液稀釋至0.5 mg/mL），抗體與磁珠的質量比為1:10，室溫振蕩偶聯5 h。用封閉緩沖液（0.05 M Tris、0.5% 酪 蛋 白、0.05% Triton X-100、0.5%Proclin300）于37℃封閉磁微粒1.5 h 后，用磁微粒緩 沖 液 洗 滌2 次（200 μL/ 次）。將TK1 抗 體- 磁微粒偶聯物用磁微粒稀釋液（0.05 M Tris、1% 氯化鈉、2%BSA、4% 海藻糖、0.05% Triton X-100、0.5%Proclin300）稀釋至0.5 mg/mL（抗體濃度），儲存在4℃冰箱中。

1.3 抗TK1 標記抗體-吖啶酯發光劑的制備

選擇TK1 配對抗體與吖啶酯偶聯，制備TK1 配對抗體- 吖啶酯發光劑。具體步驟：按照3:1 的質量比，將TK1 配對抗體與吖啶酯混合，在37℃條件下振蕩反應30 min，加入終濃度0.5% 賴氨酸終止反應。用0.1 M PBS 進行透析，以去除未結合的吖啶酯。經Sephadex G50 凝膠層析純化后，收集具有高發光強度的產物。將純化的TK1 配對抗體-吖啶酯發光劑用發光物稀釋液（0.01 M PBS、1%氯化鈉、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05% Triton X-100、0.5% Proclin300）稀釋至0.05 mg/mL（抗體濃度），儲存于4℃冰箱中備用。

1.4 磁微粒化學發光法檢測步驟

取50 μL TK1 抗體-磁微粒（20 μg/mL），加入50 μL 的TK1 標準品或血清樣本和100 μL TK1 配對抗體-吖啶酯發光劑，在37℃下溫育反應20 min，用磁鐵吸引磁微粒及其磁微粒偶聯物至試管底部，使用洗滌緩沖液（PBS+0.05% Tween 20）輕輕洗滌試管以去除游離物質。然后分別加入100 μL 的發光底物，檢測發光值。上述檢測步驟均在化學發光檢測儀中全自動化進行，無需人工操作，發光值與樣本中的TK1濃度呈正相關。

1.5 方法學評價

1.5.1 標準曲線繪制 本研究設計的TK1 檢測試劑盒溯源程序采用化學發光免疫分析法，目前TK1 暫無國家標準品，故校準品溯源到使用校準品稀釋液（0.01 M PBS、2% 海藻糖、0.2% 酪蛋白、0.5% 組氨酸、0.5%Proclin300）稀釋TK1 抗原，通過溯源到對比試劑盒（已獲證發光試劑）一級校準品，偏差控制在±10% 以內。通過多次反復實驗，標準曲線繪制為：制備重組TK1蛋白標準品的系列濃度（0 pmol/L、1.25 pmol/L、2.5 pmol/L、5 pmol/L、10 pmol/L、20 pmol/L、40 pmol/L），采用本方法檢測各標曲濃度對應的發光光度值，繪制標準曲線。每個濃度測定3 個復孔，采用雙對數數學模型（Log-Logit）進行標準曲線的擬合。

1.5.2 稀釋線性檢測 按照CLSI EP6-A2，將接近標曲線性范圍上限的高值樣本稀釋不低于5 個梯度至接近該方法的線性下限，每個濃度重復測定三次。用最小二乘法將測定的結果和對應稀釋比例進行線性擬合，并計算兩者之間的相互關系，得出線性相關系數R。

1.5.3 靈敏度評估 根據CLSI EP17-A2，準備五份接近0 值的臨床樣本或健康人血清樣本，用本研究的試劑進行檢測，每個樣本重復檢測3 次，連續檢測4 d，得到所有樣本的發光均值和標準差；準備五份濃度范圍在LoB 1 ～4 倍之間的血清樣本，每天檢測4 次，間隔超過2 h，每次檢測重復進行3 次，共進行5 d ；依據EP17-A2 文件的方法和公式進行數據處理和分析，計算得到空白限（LoB）、檢測限（LoD）、功能靈敏度（FS）。

1.5.4 準確度評估 根據EP09 文件對檢測試劑的加標回收率進行評估，方法是：將已知濃度的TK1 蛋白標準品加入基質血清中，且加入的高值樣本體積占比不超過總體積的10%，制備成加標濃度的血清樣本，使用本方法重復檢測3 次，計算高濃度樣本、加標濃度樣本和基質濃度樣本這3 個樣本的測定平均值、SD、變異系數（CV）、加標回收率，以評價該方法的準確度和重復性。根據公式〔加標回收率=（測定濃度-基質濃度）/ 加標濃度×100%）〕計算加標回收率。

1.5.5 精密度（重復性）評估 采用TK1 的試劑，按照CLSI EP05-A3，檢測高、中、低三個濃度水平的TK1 校準品，不同濃度標本每天上午和下午各檢測2次，每次檢測重復進行2 次，兩次檢測的時間間隔不低于2 h，連續測定20 d，分別計算各濃度樣本的分析內精密度、分析間精密度及總不精密度。

1.6 干擾實驗

本次評估采用了三種常見的血清干擾物質，分別是血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素，將一定濃度的干擾物分別加入高濃度TK1 和低濃度TK1 的血清待測樣本中，設為干擾物質樣本，加入的干擾物的體積不超過總體積的5%，對照組同時添加相同體積的PBS 作為對照樣本，然后對兩組樣本分別進行測試，每個濃度檢測3 次，并根據公式〔干擾率=（干擾物質樣本的測定濃度- 對照組樣本的測定濃度）/ 對照組樣本的測定濃度×100%〕計算得到干擾率。

1.7 特異性評估

用本方法同時檢測TK1 標準品（30 pmol/L）、人血清白蛋白（100 ng/mL）、纖維蛋白原（100 ng/mL）、癌胚抗原（CEA）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），以評估本方法的特異性。上述幾個蛋白均為人血清中常見的蛋白。

1.8 穩定性評估

將制備的試劑盒置于37℃下7 d，進行加速穩定性試驗。觀察試劑盒的物理外觀，對其檢測靈敏度、準確度、重復性、特異性等指標進行測定，以評估該檢測方法的穩定性。靈敏度、準確度、重復性、特異性檢測方法同上。

1.9 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析。結果以mean±SD 表示，采用GraphPad Prism 5 軟件計算標準曲線方程。

2 結果

2.1 方法建立的條件優化

采用單因素測試及多因素交叉測試篩選得到了最優的抗體對、重組抗原、磁珠與抗體最優標記比例、吖啶酯與抗體最優標記比例、基礎緩沖液、校準品、反應體系以及篩選不同需求對應的血清樣本。反復優化及驗證得到的反應體系是：樣本上樣量50 μL，磁珠標記抗體上樣量50 μL，吖啶酯標記抗體上樣量100 μL；反應步驟為一步法，反應時間為20 min；相應最優緩沖液配方為：磁微粒稀釋液：0.05 M Tris、1% 氯化鈉、2%BSA、4% 海藻糖、0.05% Triton X-100、0.5%Proclin300 ；發光物稀釋液：0.01 M PBS、1% 氯化鈉、0.5% 酪蛋白、4% 海藻糖、0.05% Triton X-100、0.5% Proclin300 ；校準品或質控品稀釋液：0.01 M PBS、2% 海藻糖、0.2% 酪蛋白、0.5% 組氨酸、0.5%Proclin300。

2.2 方法學性能評估

2.2.1 標準曲線 以TK1 標準品系列濃度的Log10 值為橫坐標，其對應的化學發光值的Log10 值為縱坐標，建立四參數擬合數學模型，其擬合的標準曲線方程為：Y=（6.77662-3.45135）/ ﹝ 1+（X/1.63798)(-1.37946）﹞ +3.45135，R=0.99869，如圖1 所示。TK1 濃度在1.25 ～40 pmol/L 范圍內時，本檢測方法具有良好的劑量-反應效應。

圖1 TK1 的標準曲線

2.2.2 線性范圍評估 將45 pmol/L（接近線性上限）濃度水平的血清樣本逐級稀釋至接近線性下限的濃度1.4 pmol/L，對所得三次結果取均值，并與理論值以最小二乘法進行線性擬合，得出對應的線性相關系數R（如表1 結果所示）。在1.5 ～45 pmol/L 范圍內，得出相關系數R 為0.997（不低于0.9900），故本研究建立的方法設定的線性范圍1.25 ～40 pmol/L 是符合要求的。

表1 TK1 稀釋線性檢測數據（pmol/L）

2.2.3 靈敏度評估 依據CLSI EP17-A2 的要求，本方法的靈敏度測試評估的結果為：LOB 0.70 pmol/L；LOD 1.02 pmol/L；FS 1.50 pmol/L。

2.2.4 準確度評估 在線性范圍內，選擇高、中、低5個濃度系列的血清樣本，用較低含量的陰性血清作為基質濃度，按照比例1:9 進行稀釋，制備成加標回收樣品，回收率在90% ～110% 視為符合要求。如表2所示，五個濃度覆蓋從低到高的濃度，數據顯示：加標回收率在99.24%～106.91%之間，均在10%以內，說明該TK1 磁微粒化學發光法檢測血清樣本中TK1的濃度具有較高的準確度。

表2 TK1 磁微?；瘜W發光檢測試劑加標回收率檢測結果

2.2.5 精密度評估 根據CLSI EP05-A3 文件，對高濃度水平、中濃度水平和低濃度水平的三個標本的各80份檢測數據進行分析（結果如表3 所示）。三個濃度水平的分析內精密度在1.02% ～2.82% 范圍內，分析間精密度在3.12% ～5.35% 范圍內，總不精密度在6.30% ～8.12% 范圍內?？梢?，分析內和分析間精密度均低于6%，總不精密度低于9%。

表3 TK1 磁微粒化學發光試劑精密度測試結果分析

2.3 干擾實驗

分別將不同濃度的膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白加入2 份待測標本中作為干擾標本，同時以添加相同體積的體系緩沖液作為基礎標本，根據公式計算得到干擾率，根據表4 的結果分析可以看出，三種干擾物質（膽紅素、甘油三酯和血紅蛋白）在不同濃度情況下對高濃度TK1 水平和低濃度TK1 水平兩份樣本影響效果不一致，膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白濃度分別不高于30 Umol/L、1.5 mmol/L、2.5 g/L 時，各濃度干擾率均不超過10%，即干擾物在上述三個濃度的情況下，未見明顯干擾。

表4 干擾試劑對TK1 磁微?；瘜W發光試劑檢測影響的測試結果

2.4 特異性實驗

用本方法制備的試劑盒重復檢測30 pmol/L TK1 標準品3 次，得到的平均濃度為31.54 pmol/L；人血清白蛋白、纖維蛋白原、CEA、IL-6 和TNF-α 的檢測值分別為1.49 pmol/L、1.31 pmol/L、1.20 pmol/L，1.45 pmol/L和1.14 pmol/L，交叉反應率均不大于2%，如表5 所示，表明該檢測方法對TK1 檢測的特異性較好。

表5 特異性實驗結果

2.5 穩定性實驗

將本方法制備的試劑盒置于37 ℃下7 d，進行加速熱穩定性實驗。7 d 后，使用TK1 標準品、基質血清等進行靈敏度、準確度、重復性和特異性等檢測，靈敏度、加標回收率、批內CV、批間CV 和交叉反應率均未有顯著性改變，表明該方法制備的試劑盒穩定性較好，可長期保存使用。

3 討論

化學發光作為一種檢測技術經歷了不斷的演變。傳統的化學發光免疫分析方法雖然能夠滿足一般需求，但是對于基質復雜或濃度極低的樣本，存在著特異性不足、背景干擾、檢測靈敏度不夠等問題。因此，降低背景干擾值、提高檢測靈敏度和特異性一直是眾多實驗室研究的重點[10]。近幾年，基于磁性微粒子及金納米粒子的化學發光免疫分析的研究越來越多，在快速分離與高靈敏度上有了很大的突破[11-12]。本方法選擇磁微粒作為反應載體，實現了降低背景干擾、增強檢測靈敏度的目的。本TK1 化學發光免疫反應的原理：將TK1 抗體偶聯在磁微粒表面，在待測抗原與固定在磁微粒表面上的抗體發生免疫反應后，在外加磁場的作用下免疫復合物被分離出來，然后加入發光底物TK1 配對抗體- 吖啶脂發光劑，通過檢測發光信號強弱來計算TK1 的濃度。磁微?；瘜W發光檢測方法已有文獻報告。鄭國金等[13]建立了一種管式磁性微粒子化學發光免疫分析法測定人尿液中的雌三醇的方法，該方法具有很高的靈敏度、穩定性和重現性。葉春蕾等[14]建立了一種基于微粒子化學發光免疫分析的人血清脂聯素檢測方法。多種磁微?；瘜W發光檢測方法的建立，說明了此方法在基質復雜的血清樣本檢測中具有明顯優勢，發展前景較好。

TK1 是細胞增殖周期依賴性標志物，定位于染色體17q23.2 q25 上，其活性在G1/S 期增加，在S 期/G2 期達到峰值，在G2/ 有絲分裂期開始下降，在處于非有絲分裂期的細胞中幾乎不存在[1,15]。在過度無序增殖的惡性腫瘤細胞中，TK1 水平極高并大量釋放到血液中。因此，組織或血清中TK1 的活性或含量可直觀地反映細胞的增殖水平。研究發現，TK1 在血液中比較穩定，在-20℃以下環境中可穩定保存5 年以上，檢測血清中TK1 活性/ 含量可準確地反映其在細胞中的真實水平[16-18]。TK1 臨床檢測的演變經歷了一個復雜的過程。上世紀80 年代，血清TK1 活性檢測方法被建立，主要用于白血病、霍奇金/ 非霍奇金淋巴瘤的治療評價和預后監測。但有研究發現，TK1 活性檢測并不適用于實體瘤患者的監測評估，僅對血液系統腫瘤的評估效果較好[19]。后來，血清TK1 水平的檢測得到了醫學界的關注。有研究發現，不僅在血液系統腫瘤（白血病、淋巴癌等）的評估中，在實體瘤如乳腺癌、胃癌、肺癌等監測評估方面，TK1 水平檢測均明顯優于其活性的檢測，這個現象的發現大大促進了血清TK1 水平檢測的發展，提高了TK1 檢測方法研究的熱度[3,4,20]。目前，免疫印跡增強化學發光法廣泛應用于臨床血清TK1 水平的測定，其具有高靈敏度、高特異性等優勢。隨著磁微粒化學發光法在臨床血清樣本檢測中獲得廣泛認可，將這種新型的檢測技術應用于血清TK1 水平的檢測中引起了本文研究者的興趣。

本研究建立了一種管式磁性微粒子化學發光免疫分析法，用來測定人血清中TK1 的水平，通過分別制備TK1 抗體- 磁微粒偶聯物和TK1 配對抗體- 吖啶脂偶聯物，建立了定量檢測TK1 的新方法。該方法對血清中TK1 的檢測靈敏度為：LOB 0.70 pmol/L；LOD 1.02 pmol/L；FS 1.50 pmol/L，線性范圍為1.25 ～40 pmol/L，可以滿足臨床樣本中對TK1 的定量檢測需要，無須稀釋；加標回收率為99.24% ～106.91%，在-10% ～10% 范圍內，符合要求；方法精密度：分析內精密度為1.02% ～2.82%，分析間精密度為3.12% ～5.35%，總不精密度為6.30% ～8.12%，分析內和分析間精密度均低于6%，總不精密度低于9%。樣本中三種干擾物在膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白濃度 分 別 不 高 于30 Umol/L、1.5 mmol/L、2.5 g/L 時，干擾率均低于10%，未見明顯干擾，基本不影響檢測結果。該檢測方法的特異性較好（與血清中常見蛋白的交叉反應率均低于2%），試劑在37℃下可穩定保存7 d 以上（等同于4℃下可穩定保存12 個月以上）。對該檢測試劑的靈敏度、準確度、重復性、特異性、穩定性等性能進行評價可知，其可滿足臨床對血清TK1 水平檢測的需求。

綜上所述，TK1 磁微粒化學發光檢測作為一種全自動快速的檢測方法，具有高靈敏度、高準確度、高精密度、強特異性、強穩定性等優點，可為臨床TK1水平的檢測提供一種新的技術手段，在惡性腫瘤的早期診斷、療效評估以及預后監控等方面可發揮重要的作用。