湖北省漢族人群MTHFRC677T 基因多態性分析

代依林，劉璐，丁文成，紀騰

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院1.婦產科；2.藥學部，武漢 430030)

葉酸是一種水溶性維生素，在DNA合成、修復及甲基化過程中起著重要的作用，人體不能自行合成，只能通過外界攝入。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝的關鍵酶，可催化5，10-亞甲基四氫葉酸成為5-甲基四氫葉酸，為DNA和蛋白質提供甲基供體。研究報道MTHFR基因第677位堿基對上的丙氨酸替代纈氨酸突變，影響血漿同型半胱氨酸(Hcy)的代謝，導致同型半胱氨酸血癥[1-2]。MTHFR C677T 基因多態性與多種臨床疾病有關，包括心血管疾病、癌癥、 妊娠不良結局及胎兒發育異常、男性不育等[3-4]。因此，MTHFR C677T篩查對于降低遺傳缺陷、提高出生人口素質以及從遺傳學角度為國家制定公共衛生政策提供數據支持具有重要意義。筆者在本研究通過對湖北省漢族人群中MTHFR C677T基因多態性分布進行特征性研究，了解該省漢族人群的遺傳特點，評估其葉酸代謝能力，為其制定個體化的葉酸補充方案提供依據。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2016年1月—2018年1月來我院進行健康體檢或常規孕期體檢的湖北省漢族人群(依據身份證籍貫及民族信息為標準進行納入)，排除腦梗死、高血壓、糖尿病、冠心病患者及重復就診對象(通過就診卡號以及身份證號進行篩選)。其中納入男1756例，年齡20～72 歲，平均年齡(31.7±6.2)歲；女10 074例，年齡18～60歲，平均年齡(29.6±4.83)歲。無重復納入的研究對象。本研究通過本院倫理委員會審查同意(批準文號：TJ-IRB20220659)。

1.2主要儀器及試劑 PCR擴增儀(型號：T100，美國伯樂)、 BaiO?BE-2.0生物芯片識讀儀(型號：BSE01011，上海百傲科技股份有限公司)、BaiO?e-Hyb 全自動雜交儀(型號：BSE03011，上海百傲科技股份有限公司)；MTHFR C677T 基因檢測試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)、血液DNA提取試劑盒(QIAGEN，貨號：51104)。

1.3檢測方法

1.3.1DNA提取 檢查對象均通過肘靜脈(肘正中靜脈或貴要靜脈)采集靜脈血(無需空腹)2 mL，置于EDTA抗凝管中。按人血液DNA提取試劑盒說明書要求，提取200 μL抗凝血基因組DNA作為后續擴增模板。

1.3.2DNA擴增 應用MTHFR C677T 基因檢測試劑盒進行常規PCR擴增。反應體系：MTHFR 22 μL，DNA模板1 μL，反應液A 2 μL，共25 μL；反應條件：預處理50 ℃ 5 min，預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 25 s，退火56 ℃ 25 s，延伸72 ℃ 25 s，其中變性、退火、延伸三個步驟共循環35次，最后延伸72 ℃ 5 min。

1.3.3基因檢測 應用MTHFR C677T 基因檢測試劑盒中提供的雜交顯色試劑盒，取DNA擴增產物10 μL，加入到雜交緩沖液190 μL。在全自動雜交儀上完成雜交，在生物芯片識讀儀上讀取MTHFR基因芯片結果，應用配套基因芯片圖像分析軟件V2.0分析基因芯片結果。

1.4統計學方法 采用SPSS 22.0版統計軟件進行分析，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。對基因頻率在人群中的分布進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。

2 結果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 結果見表1。本研究納入湖北省漢族人群的MTHFR C677T基因型頻率沒有出現波動，未出現遺傳漂變，群體處于遺傳平衡狀態，MTHFR C677T基因多態性分布符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.851，P>0.05)，提示納入樣本具有區域群體代表性。

表1 湖北省漢族人群MTHFR C677T基因Hardy-Weinberg遺傳平衡分析

2.2湖北省漢族人群不同性別組MTHFR基因多態性分布 結果見表2和表3。結果顯示，MTHFRC677TT基因型在男性中占比更高，但差異無統計學意義(χ2=5.711，P=0.056)。MTHFRC677位點上等位基因頻率，男性和女性之間差異無統計學意義(χ2=2.711，P=0.10)。

表2 湖北省漢族人群MTHFR C677T位點基因型頻率分布

表3 湖北省漢族人群MTHFR C677T位點等位基因頻率分布

2.3湖北省漢族人群各年齡組MTHFR基因多態性分布 結果見表4。以年齡分組后，各年齡層基因型構成存在差異，但差異無統計學意義(χ2=16.591，P=0.166)。在≤45歲，CT型為優勢基因，在各年齡段分層里無明顯差別，表4顯示，>45歲CC型頻率最高，但>45歲各基因型構成與≤45歲比較差異無統計學意義(χ2=2.140，P=0.343)。表5與表6所示，按性別分組后重新分層，發現在男性中各年齡段中均是以CT型為優勢基因型，最高可達53.66%(χ2=10.695，P=0.555)；在女性中發現，各年齡層基因型構成存在差異，但差異無統計學意義(χ2=19.306，P=0.081)，但≤45歲CT基因型頻率最高，>45歲為CC基因型頻率最高，差異有統計學意義(χ2=6.819，P=0.033)。

表4 湖北省漢族人群各年齡層MTHFR C677T位點基因型頻率分布

表5 湖北省漢族女性各年齡層MTHFR C677T位點基因型頻率分布

2.4湖北省漢族人群與其他省份(或市)漢族人群MTHFR基因型頻率分布比較 參照“1.1”項納排標準，納入云南省2476例、河南省2652例、浙江省1896例、北京市3945例、吉林省833例、廣東省13 336例。湖北省漢族人群MTHFR C677T位點基因型分布與云南省[5]、河南省[6]、浙江省[7]、北京市[8]、吉林省[9]、廣東省[10]等地區之間比較差異有統計學意義，其中純合突變基因型(TT)頻率高于云南省、浙江省、廣東省，低于河南省、吉林省、北京市(P<0.05)(表7)。湖北省人群的 MTHFR C677T 突變等位基因頻率高于云南省、浙江省、廣東省，低于河南省和吉林省和北京市(P<0.05)，見表8。

表6 湖北省漢族男性各年齡層MTHFR C677T位點基因型頻數和頻率分布

表7 不同省份(或市)漢族人群MTHFR C677T位點基因型頻率分布

3 討論

葉酸是一種水溶性B族維生素，是細胞增殖、組織修復、機體發育過程中不可或缺的重要物質[11]。葉酸不能在人體內自行合成，需從外界攝取。MTHFR是葉酸代謝過程的關鍵酶，催化5，10-亞甲基四氫葉酸成為5-甲基四氫葉酸，為一系列生命活動提供甲基供體。編碼MTHFR的基因位于染色體1p36.3，共有12個外顯子，mRNA全長7150 bp，共編碼氨基酸657個[12]。其中，MTHFR 基因677位點存在多態性，當該位點突變(C677T)時，引起MTHFR酶活性降低，抑制血漿內同型半胱氨酸代謝，導致低葉酸血癥和高同型半胱氨酸血癥，從而引起心血管疾病、腦卒中[13]、婦科疾病[14]、胎兒生長受限[15]等一系列臨床疾病。

表8 不同省份(或市)漢族人群MTHFR C677T位點等位基因頻率分布

本研究結果顯示，湖北省人群MTHFRC677位點上基因型頻率以CT最高，CC次之，TT最低；其中不同性別MTHFRC677位點上CC、CT、TT基因型頻率也有差異，TT基因型在男性中占比更高，但差異無統計學意義。以年齡分組后可以看出，在45歲以下，CT為優勢基因型，在各年齡段分層里無明顯差別，>45歲雖然CC型頻率最高，但各基因型構成頻率與≤45歲比較差異無統計學意義。再按性別分組后重新分層，發現在男性各年齡段中均是以CT為優勢基因型，最高可達53.66%；在女性中發現，各年齡層基因型構成存在差異，但差異無統計學意義(P=0.081)，但≤45歲CT基因型頻率最高，>45歲為CC基因型頻率最高，其差異具有統計學意義(P=0.033)。不同地區基因型頻率和等位基因頻率也有差異，湖北省人群純合突變基因型(TT)頻率高于云南省、浙江省、廣東省，低于河南省、吉林省、北京市，差異有統計學意義(P<0.05)；T基因頻率高于云南省、浙江省、廣東省，低于河南省、吉林省和北京市，差異具有統計學意義(P<0.05)。該差異和我國葉酸缺乏的趨勢分布大體一致。以上結果為以后針對不同年齡、不同性別的需要補充葉酸的患者制定個性化葉酸補充方案提供新依據。

一般人群葉酸補充的有效且安全劑量為 0.4～1.0 mg·d-1[16]，體內代謝葉酸同時受多種因素影響，根據以上統計結果，補充葉酸時，需考慮MTHFR C677T基因型的差異，TT基因型漢族人群可平衡膳食改善葉酸營養狀況，在安全劑量內適當增加補充葉酸劑量，以及延長補充葉酸的時間；同時也需考慮所在地域(生活方式、飲食習慣等)影響。本研究中列出的北方三省TT基因型頻率以及T基因頻率均高于南方三省，應在適合本地區飲食習慣的基礎上增加富含葉酸的食物，如綠葉蔬菜、動物肝臟、豆制品等。不同的年齡及不同性別的人群也應分類補充葉酸，育齡期婦女備孕期間可進行葉酸的合理補充以達到優生優育的目的，老年人補充葉酸也可一定程度地降低心血管事件發生概率。綜上所述，補充葉酸應做到個性化補充，充分發揮補充葉酸的作用。

湖北省漢族人群MTHFR基因多態性分布具有明顯的地區特異性，>50%的人群存在不同程度的葉酸代謝障礙，并且不同年齡、不同性別葉酸代謝水平也表現出一定的差異性，因此一般人群常規劑量0.4 mg·d-1不能滿足大部分人群的生理需求，所以在補充葉酸時，應充分考慮MTHFR基因多態性的影響。針對葉酸代謝障礙的高風險人群，根據其基因型、性別、年齡、臨床表現，以及日常飲食結構、生活習慣等特點制定個性化的葉酸補充方案，從而達到減少相關疾病的發病風險、降低遺傳缺陷、提高出生人口素質的目的。