百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽保護(hù)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎纖維化的機(jī)制探究

朱戈麗，李菊霜，喻業(yè)安，封寶紅，畢智敏，伍 軍

每年因慢性腎臟病發(fā)展為終末期腎病的患者數(shù)持續(xù)增加[1]。慢性腎臟病發(fā)病早期癥狀較為隱匿，且病情輕微，易被患者忽視，是終末期腎病發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)的原因[2]。腎纖維化是慢性腎臟病進(jìn)入終末期的主要病理基礎(chǔ)，且纖維化程度與腎功能水平密切相關(guān)[3]。故改善腎纖維化是降低終末期腎病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。據(jù)報(bào)道，百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽可明顯改善單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎纖維化[4]，但其潛在作用途徑尚不清楚。百令膠囊常作為天然蟲(chóng)草的代用品，具有保護(hù)肝腎功能、拮抗氧自由基的作用[5]。還原型谷胱甘肽可發(fā)揮抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用以減輕自由基損傷[6]。本研究從氧化應(yīng)激方面著手，探究百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽保護(hù)UUO模型大鼠腎纖維化的機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量220～260 g，8周齡，由武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO組、還原型谷胱甘肽組及百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽組(聯(lián)合組)，每組10只。

1.2UUO模型構(gòu)建[7]與給藥 各組大鼠禁食、禁水12 h，麻醉后于左側(cè)腹部偏下處切開(kāi)，逐層打開(kāi)腹腔，游離出跨過(guò)左側(cè)髂血管的左側(cè)輸尿管，除假手術(shù)組外的其他組大鼠于左側(cè)輸尿管腎盂結(jié)合處及向下1 cm處完全結(jié)扎，再逐層縫合關(guān)閉腹腔。于造模前1 d至術(shù)后第9日還原型谷胱甘肽組予還原型谷胱甘肽(重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H2010093)300 mg/kg灌胃，聯(lián)合組予百令膠囊(杭州中美華東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10910036)1.5 g/kg和還原型谷胱甘肽300 mg/kg灌胃，每日1次。假手術(shù)組和UUO組予等量生理鹽水。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法 給藥結(jié)束后，稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量，注射戊巴比妥麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血肌酐(Scr)和尿素(BUN)。剪取左側(cè)腎組織，稱(chēng)梗阻側(cè)腎臟濕重，計(jì)算腎臟指數(shù)[梗阻側(cè)腎臟濕重/體質(zhì)量×100%]。經(jīng)左側(cè)腎臟冠狀面剪取部分腎組織固定于甲醛溶液制備石蠟切片，分別行常規(guī)HE染色和Masson染色，觀(guān)察大鼠腎組織病理變化。剪取腎皮質(zhì)，混入預(yù)冷生理鹽水制備組織勻漿液，采用ELISA法檢測(cè)活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。剩余腎組織添加RIPA裂解液提取總蛋白，蛋白定量后行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉后分別添加兔抗Nrf2、Keap1多克隆抗體及小鼠抗β-actin單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜孵育，1︰1000稀釋?zhuān)琓BST洗膜5次，每次8 min，再加入二抗室溫孵育1 h，1︰5000稀釋?zhuān)琓BST洗膜5次，每次8 min，最后顯影曝光。掃描X線(xiàn)片條帶，使用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，目的蛋白與β-actin蛋白灰度值表示該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽對(duì)UUO大鼠腎功能的影響 與假手術(shù)組比較，UUO組血清Scr、BUN和梗阻側(cè)腎臟指數(shù)明顯升高(P<0.05)；與UUO組比較，還原型谷胱甘肽組和聯(lián)合組Scr、BUN和梗阻側(cè)腎臟指數(shù)明顯降低，且聯(lián)合組降低效果更顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽對(duì)UUO大鼠腎功能的影響

2.2百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽對(duì)UUO大鼠腎組織病理形態(tài)的影響 HE染色顯示，假手術(shù)組腎組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；UUO組腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞腫脹明顯，伴空泡征和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；還原型谷胱甘肽組和聯(lián)合組上述病理改變明顯減輕。Masson染色顯示，假手術(shù)組基本無(wú)藍(lán)色膠原纖維，UUO組腎間質(zhì)存在大量的藍(lán)色膠原纖維，還原型谷胱甘肽組和聯(lián)合組膠原纖維量明顯減少。

2.3百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽對(duì)UUO大鼠腎組織氧化應(yīng)激的影響 與假手術(shù)組比較，UUO組腎組織勻漿液中ROS和MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低(P<0.05)；與UUO組比較，還原型谷胱甘肽組和聯(lián)合組ROS和MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高，且聯(lián)合組改善效果優(yōu)于還原型谷胱甘肽組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽對(duì)UUO大鼠腎組織氧化應(yīng)激的影響

2.4百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽對(duì)UUO大鼠腎組織Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，UUO組腎組織中Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低，Keap1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與UUO組比較，還原型谷胱甘肽組和聯(lián)合組Nrf2蛋白表達(dá)明顯升高，Keap1蛋白表達(dá)明顯降低，且聯(lián)合組改善效果優(yōu)于還原型谷胱甘肽組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽對(duì)UUO大鼠腎組織Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前，慢性腎臟病的治療多采用多模式治療，包括應(yīng)用阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)、嚴(yán)格控制血壓血糖藥物等，但目前終末期腎病的逆轉(zhuǎn)效果仍十分有限[8]。故迫切需要更為有效的治療方法，減緩或阻止慢性腎臟病的進(jìn)展。尿路阻塞導(dǎo)致腎腫大，尿液聚集于腎盂或腎盞，腎結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性損傷，從而引起慢性腎功能障礙。隨著腎血流量、腎小球?yàn)V過(guò)率逐漸降低，腎實(shí)質(zhì)損傷也進(jìn)一步加重，腎小管萎縮和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，這將加速腎纖維化[9]。故UUO是研究腎纖維化的理想模式。本研究結(jié)果顯示，UUO大鼠梗阻側(cè)腎臟出現(xiàn)明顯水腫，腎小管間質(zhì)損傷嚴(yán)重，并伴明顯纖維化，腎功能也出現(xiàn)明顯障礙，提示UUO大鼠模型構(gòu)建成功。

百令膠囊可補(bǔ)肺腎、益精氣，常用于肺腎兩虛引起的咳嗽、氣喘、慢性腎功能不全的輔助治療[10-13]。于文會(huì)等[14]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用氯沙坦鉀片和百令膠囊治療慢性腎臟病可以改善患者腎功能，減輕腎小球硬化，延緩腎纖維化。還原型谷胱甘肽主要由肝臟合成，可與體內(nèi)過(guò)氧化物和自由基結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞中含巰基的蛋白質(zhì)和酶，可參與多種外源性、內(nèi)源性有毒物質(zhì)的減毒反應(yīng)[15-16]。許誠(chéng)楷等[17]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用還原型谷胱甘肽治療可顯著改善早期糖尿病慢性腎臟病患者免疫功能、氧化應(yīng)激水平，減少異常新生血管生成。百令膠囊加還原型谷胱甘肽含藥血清可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smad表達(dá),抑制腎纖維化[18]。本研究顯示，百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽治療后大鼠腎組織病理?yè)p傷和腎纖維化程度明顯減輕，腎功能也有明顯改善，與上述研究結(jié)果相符。

氧化應(yīng)激在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，過(guò)度分泌ROS可氧化或損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，致腎功能損傷[19-20]。本研究結(jié)果顯示，UUO大鼠ROS和MDA含量明顯升高，SOD含量明顯下降，經(jīng)百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽治療后，ROS和MDA含量明顯下降，SOD含量明顯升高，提示百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽可能通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平，改善UUO大鼠腎纖維化。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，而Keap1是Nrf2特異性受體，正常狀態(tài)下Nrf2與Keap1形成聚合物處于無(wú)活性狀態(tài)，氧化應(yīng)激刺激下聚合物解離啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)元件[21]。大量研究顯示，調(diào)控Nrf2/Keap1信號(hào)通路，可能是改善腎損傷的潛在作用途徑[22]。本研究UUO大鼠腎組織中Nrf2表達(dá)下調(diào)，Keap1表達(dá)上調(diào)，給予百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽干預(yù)后Nrf2表達(dá)上調(diào)，Keap1表達(dá)下調(diào)，提示百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽可能通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1信號(hào)通路，降低氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮對(duì)UUO大鼠腎纖維化保護(hù)作用。

綜上，百令膠囊聯(lián)合還原型谷胱甘肽可明顯減輕UUO大鼠腎纖維化，可能與通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/Keap1信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。