外周血單個核細胞中hsa_circ_0005836和miR-146b表達水平在肺結核診斷中的價值分析*

徐少華，黃江華，謝曉霞，楊 濤，何曉華，徐 輝

1.四川大學華西臨床醫學院，四川成都 610000；2.川北醫學院附屬三臺醫院/三臺縣人民醫院檢驗科，四川綿陽 621100;3.川北醫學院附屬三臺醫院/三臺縣人民醫院傳染病科，四川綿陽 621100

肺結核是由結核分枝桿菌侵入人體引發，發病率呈逐年升高趨勢，目前每年約有180萬人死于該病，是全球嚴重的公共衛生問題之一[1]。我國肺結核患者人數居全球第三位，由于肺結核的耐藥性與傳染性，我國肺結核疫情仍很嚴重，因此，對肺結核進行早期診斷并準確評估肺結核患者病情，對其進行及時有效的治療具有重要臨床意義[2]。環狀RNA(circRNA)是一種新型的非編碼RNA分子，廣泛表達于真核細胞中，因其具有結構穩定性、組織特異性，成為多種疾病診斷的理想生物標志物[3]。研究顯示，肺結核患者外周血單個核細胞(PBMCs)中circRNF10表達水平升高，有望作為肺結核診斷和療效監測的潛在生物標志物[4]。hsa_circ_0005836屬于circRNA的一種，其在肺結核患者PBMCs中的表達情況少有研究。微小RNA(miRNA)可調節炎性反應、免疫反應等，可參與支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺結核等多種肺部疾病的發病過程[5]，微小RNA-146b(miR-146b)為miRNA的一種，研究表明，miR-146b在甲狀腺乳頭狀癌患者外周血中表達顯著上調，與腫瘤的進展和患者預后不良有關[6]。miR-146b在肺結核患者PBMCs中表達的相關性尚不清楚。本研究旨在通過檢測肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b的表達情況，探討二者的相關性及其與肺結核的關系，為肺結核患者的早期診斷提供有效依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年7月至2021年6月川北醫學院附屬三臺醫院收治的肺結核患者85例作為肺結核組，其中男53例，女32例；年齡21～58歲，平均(41.20±11.50)歲。納入標準：(1)符合肺結核的診斷標準[7]；(2)首次確診為肺結核且未經任何治療；(3)肝、腎功能基本正常；(4)半年內未使用抗菌藥物及糖皮質激素者；(5)患者臨床資料完整。排除標準：(1)合并惡性腫瘤或支氣管擴張等其他呼吸系統疾病患者；(2)合并心、肝、腎功能不全者；(3)各種因素導致的自身免疫力低下或近期服用免疫抑制劑者；(4)患有嚴重精神疾病及語言障礙者。根據影像學肺部病灶顯示，<2個病灶患者48例，≥2個病灶患者37例；根據胸部CT顯示，肺部有空洞患者46例，肺部無空洞患者39例。選擇同期在醫院體檢的健康人員(無肺結核接觸史且肺部影像檢查正常)90例作為對照組，其中男50例，女40例；年齡26～65歲，平均(45.56±14.70)歲。肺結核組與對照組男女比例、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。本研究經川北醫學院附屬三臺醫院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較[n/n或或n(%)]

1.2試劑與儀器 逆轉錄試劑盒(批號IS59176，德國QIASGEN公司)；RNA提取試劑(Trizol，批號135402，美國Invitrogen公司)；Ficoll淋巴細胞分離液(批號IA-10771，北京冬璞泰和科技有限責任公司)；超低溫冰箱(型號DW86L388A，上海坤科儀器設備有限公司)；實時熒光定量PCR儀(型號Gentier96E，西安天隆科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1PBMCs分離及保存 肺結核組與對照組分別在抗結核治療前、體檢時采集清晨空腹靜脈血(3～5 mL)于EDTA抗凝管保存，使用Ficoll淋巴細胞分離液離心分離PBMCs，于-70 ℃冰箱保存備用。

1.3.2實時熒光定量PCR法檢測hsa_circ_0005836和miR-146b表達 采用實時熒光定量PCR法檢測PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b相對表達量。Trizol試劑提取總RNA，檢測濃度與純度后，逆轉錄合成cDNA，再進行PCR反應，反應條件：55 ℃預熱150 s；95 ℃預變性60 s；95 ℃變性15 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38個循環。采用2-ΔΔCt法計算hsa_circ_0005836和miR-146b相對表達量。hsa_circ_0005836(內參為GAPDH)和miR-146b(內參為U6)等引物由上海源葉生物科技有限公司合成。引物序列如下：hsa_circ_0005836上游引物為5′-ACTCATCCTTGAACCTTGC-3′，hsa_circ_0005836下游引物為5′-GGCATCTATGTACTTCAGGAC-3′；miR-146b上游引物為5′-GAGAACTGAATTCCATAGG-3′，miR-146b下游引物為5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；GAPDH上游引物為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，GAPDH下游引物為5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′；U6上游引物為5′-GCTTCGGCACATATACTAAAT-3′，U6下游引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2 結 果

2.1對照組和肺結核組PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達水平比較 肺結核組PBMCs中hsa_circ_0005836表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，miR-146b表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 對照組和肺結核組PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達水平比較

2.2肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達水平與臨床病理特征的關系 不同年齡、性別的肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與肺部病灶<2個的肺結核患者比較，肺部病灶≥2個的肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達水平顯著降低，miR-146b表達水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與肺部無空洞的肺結核患者比較，肺部有空洞的肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達水平顯著降低，miR-146b表達水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836、miR-146b表達與臨床病理特征的關系

2.3肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b表達水平的相關性 相關性分析顯示，肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b表達水平呈負相關(r=-0.692，P<0.05)。見圖1。

圖1 肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b表達水平的相關性

2.4ROC曲線分析hsa_circ_0005836與miR-146b對肺結核的診斷價值 hsa_circ_0005836診斷肺結核的曲線下面積(AUC)為0.868，靈敏度為87.06%，特異度為81.54%，截斷值為0.77；miR-146b診斷肺結核的AUC為0.839，靈敏度為83.53%，特異度為76.38%，截斷值為1.32；hsa_circ_0005836和miR-146b二者聯合診斷肺結核的AUC為0.896，靈敏度為88.35%，特異度為75.00%。見圖2。

圖2 hsa_circ_0005836與miR-146b診斷肺結核的ROC曲線

3 討 論

circRNA是一類單鏈閉合RNA分子，不受RNA外切酶影響，在真核生物中具有高度穩定性、豐富性和進化保守性。研究顯示，circRNA具有miRNA和“蛋白質海綿”的作用，在調節轉錄和剪接方面發揮著重要作用，與腫瘤等多種疾病的發生、發展過程密切相關[8-9]。CHENG等[10]研究表明，circRNA-012091調控的PPP1R13B通過內質網應激和自噬促進肺成纖維細胞的增殖和遷移，在矽肺肺纖維化的發展中起關鍵作用。circRNA在組織和外周血中均有表達，且具有良好的穩定性與特異性，可作為惡性腫瘤、神經系統疾病、心血管疾病、炎癥性疾病等多種疾病的診斷標志物[11-13]。多項研究顯示，多種circRNA在肺結核患者外周血中有表達，對肺結核的診斷具有一定價值[14-15]。黃自坤等[14]研究表明，肺結核患者血漿hsa_circ_0009024表達水平顯著升高，且與患者病情相關，可作為肺結核診斷和療效監測的潛在標志物。hsa_circ_0005836為circRNA的一種，ZHUANG等[15]通過高通量測序活動性肺結核患者PBMCs中circRNA的表達，發現hsa_circ_0005836表達顯著下調，提示hsa_circ_0005836可能成為肺結核的新型潛在生物標志物。本研究結果顯示，肺結核組患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達水平顯著低于對照組人員，且肺部病灶≥2個的肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達水平顯著低于肺部病灶<2個的肺結核患者，肺部有空洞的肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836表達水平顯著低于肺部無空洞的肺結核患者，提示hsa_circ_0005836可能與肺結核的發生、發展有關，可反映患者病情嚴重程度。

miRNA可參與細胞增殖、凋亡、代謝等多個生理和病理過程，與非小細胞肺癌、急性肺損傷、肺結核等肺部疾病的發生、發展密切相關，調控結核分枝桿菌感染后的免疫反應、炎癥因子釋放等過程[16-17]。miR-146b為miRNA的一種，是炎性反應調節因子，在先天免疫中具有重要作用，與多種疾病密切相關。研究顯示，急性ST段抬高型心肌梗死患者血漿中miR-146b表達水平升高，與肌酸激酶同工酶、心肌肌鈣蛋白I及冠脈造影評分呈正相關[18]。miR-146b的異常表達與肺部疾病的發生有關，ZHANG等[19]研究顯示，miR-146b可通過抑制髓樣分化因子88(MyD88)/核因子-κB(NF-κB)信號通路減輕小兒肺炎的炎癥損傷。在脂多糖(LPS)誘導的急性肺損傷的小鼠模型中，過表達的miR-146b可顯著減少LPS誘導的肺損傷、肺部炎癥、總細胞和中性粒細胞計數、促炎細胞因子和支氣管肺泡灌洗液中的趨化因子水平[20]。本研究結果顯示，肺結核組患者PBMCs中miR-146b表達水平顯著高于對照組人員，且肺部病灶≥2個和肺部有空洞的肺結核患者PBMCs中miR-146b表達水平較高，表明miR-146b可能成為評價肺結核患者病情的一項指標。

本研究還發現，肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836與miR-146b表達水平呈負相關(r=-0.692,P<0.05)，表明二者可能存在負向調控關系。因此，本研究推測hsa_circ_0005836通過靶向調控miR-146b的表達參與肺結核疾病的發生與發展，但具體作用機制有待結合基礎研究進一步證實。本研究通過進一步分析發現，hsa_circ_0005836、miR-146b聯合診斷肺結核的AUC為0.896，靈敏度為88.35%，特異度為75.00%，表明hsa_circ_0005836、miR-146b聯合檢測對肺結核具有一定診斷價值。

綜上所述，肺結核患者PBMCs中hsa_circ_0005836呈低表達，miR-146b呈高表達，二者呈負相關，均與患者病情有關，可能作為肺結核診斷的標志物，但是其具體作用機制及臨床實用價值仍需結合種族特異性、人群易感性、社會經濟狀況等因素做進一步系統研究。