miR-199a-5p介導的lncRNA ANRIL通過調節HIF-1α促進多發性骨髓瘤的惡性增殖*

蘇 靜

綿陽市中心醫院血液內科，四川綿陽 621000

多發性骨髓瘤(MM)是一種典型的血液系統惡性腫瘤，由單克隆漿細胞在骨髓微環境中異常積累引起[1]。主要特征為骨重塑嚴重失衡引起的骨病變[2]。MM是一種復雜的疾病，其潛在的分子機制尚未完全闡明，探索創新的治療策略對于有效治療MM患者至關重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是新發現的一類功能RNA分子，其長度超過200個核苷酸，幾乎不具有蛋白質編碼能力[3-4]。lncRNA在腫瘤發生、發展和分化中發揮著重要作用[5]。此外，lncRNA已被證明在人類癌癥中具有異常調節作用，可能作為癌癥促進因子或癌癥抑制因子發揮作用[6]。lncRNA ANRIL已在家族性黑色素瘤患者中被鑒定。有研究報道，lncRNA ANRIL過表達是幾種人類癌癥的危險因素。例如，沉默lncRNA ANRIL通過調節白細胞介素(IL)-33/生長刺激表達基因2(ST2)減少心肌細胞凋亡[7]。lncRNA ANRIL通過增強NF-κB信號通路促進胃癌進展[8]。lncRNA ANRIL通過調節自噬途徑中的微小RNA(miRNA)-99a和miRNA-449a促進血管生成和血栓形成[9]。最近有研究發現，miR-411-3p介導的lncRNA ANRIL通過調節低氧誘導因子-1α(HIF-1α)抑制MM的惡性增殖和腫瘤干細胞樣特性[10]，表明lncRNA ANRIL、HIF-1α和MM發展密切相關。另外有研究發現，在腫瘤發展中lncRNA ANRIL與miR-199a-5p、miR-199a-5p與HIF-1α具有靶向作用，但是在MM中，三者是否有聯系尚不明確，而且目前還沒有足夠的證據表明lncRNA ANRIL在MM細胞中的表達和功能。因此，本研究旨在探討lncRNA-ANRIL通過誘導HIF-1α對MM惡性增殖的影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 從本院選取55例MM患者為研究對象，均符合人民衛生出版社出版的《血液病診斷與鑒別診斷圖譜》中的診斷標準，同時選取55例健康志愿者作為對照。本研究經本院倫理委員會批準，所有受試者均知情同意。采集治療前MM患者與健康志愿者的外周靜脈血，離心后收集血漿。

1.2方法

1.2.1細胞培養及轉染 人MM細胞系U266從美國典藏培養中心(ATCC)獲得，在含有15%胎牛血清(美國Gibco)、1%谷氨酰胺和1%鏈霉素-青霉素(美國Invitrogen)的RPMI-1640培養基中培養，并置于37℃、5% CO2培養箱中。過表達對照載體(mimics NC)、miR-199a-5p過表達載體(miR-199a-5p mimics)、敲低對照載體(inhibitor NC)、miR-199a-5p敲低載體(miR-199a-5p inhibitor)、ANRIL陰性對照(si-NC)、ANRIL沉默載體(si-ANRIL)、HIF-1α沉默載體(si-HIF-1α)由中國廣東RiboBio公司合成。U266細胞(1×106個/孔)經Lipofectamine 2000試劑(美國Invitrogen)轉染后，接種于6孔板，收集轉染的細胞進行后續實驗。

1.2.2雙熒光素酶報告基因活性檢測 miRanda軟件預測lncRNA ANRIL與miR-199a-5p之間的結合位點。TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)用于預測miR-199a-5p的靶位點，用熒光素酶報告基因試驗驗證miR-199a-5p與lncRNA ANRIL或HIF-1α的結合。構建ANRIL野生型(wt-ANRIL)和突變型(mut-ANRIL)報告載體，并插入psiCHECK-2。構建HIF-1α野生型(wt-HIF-1α)和突變型(mut-HIF-1α)報告載體并插入psiCHECK-2。報告質粒(wt-ANRIL、mut-ANRIL、wt-HIF-1α、mut-HIF-1α)與mimics NC、miR-199a-5p mimics質粒用Lipofectamine 2000共轉染U266細胞48 h。最后，用雙熒光素酶報告系統試劑盒(Promega)檢測熒光素酶活性。

1.2.3流式細胞術測定細胞凋亡 使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(上海Beyotime Biotechnology)檢測U266細胞的凋亡。U266細胞轉染質粒后，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗，以2 000 r/min離心10 min。U266細胞重懸于結合緩沖液(500 μL)中，然后與Annexin V-FITC(5 μL)和碘化丙啶(10 μL)在25 ℃條件下孵育20 min。最后采用流式細胞儀(美國BD Biosciences)對凋亡細胞進行區分，計算凋亡率。

1.2.4細胞增殖活力測定 將U266細胞(5 000個/孔)接種于96孔板，培養過夜。轉染0 h和48 h后，添加10 μL CCK-8(日本Dojindo)到每個孔，與細胞孵育4 h。最后在450 nm波長下檢測吸光度。

1.2.5RNA提取、逆轉錄和qRT-PCR 所有的RNA均使用TRIzol試劑(美國Invitrogen)從血漿和細胞中提取，然后用PrimeScript RT試劑盒按照廠家說明書(日本Takara)將1 μg總RNA逆轉錄為cDNA。miRNA采用DNaseⅠ處理樣品，去除樣品中的gDNA。隨后使用miR-X miR第一鏈合成試劑盒(日本Takara)合成cDNA。最后，利用SYBR Premix Ex TaqⅡ(日本Takara)和羅氏LightCycler 480 PCR儀進行qRT-PCR反應。引物序列如下：lncRNA ANRIL-F 5′-GGACTACAGATGCACCACCAT-3′；lncRNA ANRIL-R 5′-TGAGCACTGTGTCCATAGCA-3′;miR-199a-5p-F 5′-GGCGCCCAGTGTTCAGACTAC-3′；miR-199a-5p-R 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；HIF-1α-F 5′-ACCTATGACCTGCTTGGTGC-3′;HIF-1α-R 5′-GGCTGTGTCGACTGAGGAAA-3′;GAPDH-F 5′-AAATCCCATCACCATCTTCCAG-3′;GAPDH-R 5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAGTTG-3′。

1.2.6Western blot U266細胞用預冷的PBS洗滌，用RIPA裂解緩沖液進行裂解。將等量的蛋白樣品通過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脫脂牛奶封閉1.5 h后，用一抗[抗caspase3(英國Abcam,ab32351)、抗caspase 9(英國Abcam，ab32539)、抗Bax(英國Abcam，ab32503)、抗Bcl-2(英國Abcam，ab32124)、抗GAPDH(英國Abcam，ab8485)]和辣根過氧化物酶結合的二抗孵育PVDF膜。用Pierce ECL Western blot(美國Thermo Scientific)觀察條帶。采用GAPDH作為內參。

2 結 果

2.1lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α在MM患者和健康志愿者血漿中的表達差異 MM患者血漿lncRNA ANRIL、HIF-1α表達高于健康志愿者(P<0.05)，MM患者血漿miR-199a-5p表達低于健康志愿者(P<0.05)。見圖1。

注：A為MM患者和健康志愿者血漿lncRNA ANRIL表達比較；B為MM患者和健康志愿者血漿miR-199a-5p表達比較；C為MM患者和健康志愿者血漿HIF-1α表達比較;**表示P<0.05。

2.2lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α三者之間的關系 生物信息學軟件預測了lncRNA ANRIL與miR-199a-5p、miR-199a-5p和HIF-1α之間的結合位點(圖2A、2B)。熒光素酶報告基因檢測顯示，與wt-ANRIL+mimics NC組相比，wt-ANRIL+miR-199a-5p mimics的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；mut-ANRIL+mimics NC組與mut-ANRIL+miR-199a-5p mimics組熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)(圖2C)；與wt-HIF-1α+mimics NC組相比，wt-HIF-1α+miR-199a-5p mimics組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；mut-HIF-1α+mimics NC組與mut-HIF-1α+miR-199a-5p mimics組熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05，圖2D)。進一步研究了lncRNA ANRIL對miR-199a-5p、HIF-1α表達的調控作用，發現與si-NC組相比，si-ANRIL組細胞內HIF-1α相對表達量明顯降低(P<0.05)，與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組細胞內HIF-1α相對表達量明顯升高(P<0.05)，表明lncRNA ANRIL表達對HIF-1α表達有正向調控作用，miR-199a-5p表達對HIF-1α表達有負向調控作用(圖2E)。

注：A為lncRNA ANRIL與miR-199a-5p之間的結合位點；B為miR-199a-5p和HIF-1α之間的結合位點；C為lncRNA ANRIL等雙熒光素酶活性檢測；D為HIF-1α等雙熒光素酶活性檢測；E為qRT-PCR分析HIF-1α mRNA相對表達水平;**表示P<0.05。

2.3lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α對U266細胞增殖活力的影響 分析圖3A可知，與si-NC組相比，si-ANRIL組和si-HIF-1α組U266細胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組U266細胞增殖活力明顯升高(P<0.05)。分析圖3B可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-ANRIL+mimics NC組U266細胞增殖活力明顯升高(P<0.05);pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組U266細胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組相比，pcDNA-ANRIL+miR-199a-5p mimics組U266細胞增殖活力明顯升高(P<0.05)。

注：A為CCK-8檢測分別下調lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α表達后對U266細胞增殖活力的影響；B為CCK-8檢測lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對U266細胞增殖活力的影響;**表示P<0.05。

2.4lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α對U266細胞凋亡的影響 分析圖4A、4B可知，與si-NC組相比，si-ANRIL組和si-HIF-1α組U266細胞凋亡率明顯上升(P<0.05)；與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組U266細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。分析圖4C、4D可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-ANRIL+mimics NC組U266細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組U266細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組相比，pcDNA-ANRIL+miR-199a-5p mimics組U266細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

注：A為流式細胞術檢測分別下調lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α表達后對U266細胞凋亡的影響；B為A中細胞凋亡率統計結果；C為流式細胞術檢測lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對U266細胞凋亡的影響；D為C中細胞凋亡率統計結果;**表示P<0.05。

2.5lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α對U266細胞內Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9蛋白相對表達量的影響 分析圖5A可知，與si-NC組相比，si-ANRIL和si-HIF-1α組細胞內Bax、caspase3和caspase9表達顯著上調(P<0.05)，Bcl-2表達顯著下調(P<0.05)；與inhibitor NC組相比，miR-199a-5p inhibitor組細胞內Bax、caspase3和caspase9表達顯著下調(P<0.05)，Bcl-2表達顯著上調(P<0.05)。分析圖5B可知，與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組相比，pcDNA-ANRIL+mimics NC組細胞內Bax、caspase3和caspase9表達顯著下調(P<0.05)，Bcl-2表達顯著上調(P<0.05)，pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組細胞內Bax、caspase3和caspase9表達顯著上調(P<0.05)，Bcl-2表達顯著下調(P<0.05)；與pcDNA-3.1(+)+miR-199a-5p mimics組相比，pcDNA-ANRIL+miR-199a-5p mimics組細胞內Bax、caspase3和caspase9表達顯著下調(P<0.05)，Bcl-2表達顯著上調(P<0.05)。

注：A為Western blot檢測分別下調lncRNA ANRIL、miR-199a-5p和HIF-1α表達后對Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9表達的影響;B為Western blot檢測lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9表達的影響。

2.6lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p對HIF-1α表達的影響 與對照組相比，過表達lncRNA ANRIL顯著促進了HIF-1α表達(P<0.05)，而miR-199a-5p mimics組與mimics NC組相比顯著抑制了HIF-1α表達(P<0.05)，和miR-199a-5p mimics組對比，lncRNA ANRIL過表達質粒和miR-199a-5p mimics同時轉染細胞后顯著促進了HIF-1α表達(P<0.05)。見圖6。

3 討 論

已有研究表明，lncRNA和miRNA的異常表達與MM的進展有關[9]。前期有研究發現，lncRNA PDIA3P、lncRNA MALAT-1、lncRNA TUG1等在MM患者血漿中呈高表達[11-12]，而miR-193a、miR-29b-3p、miR-610等呈低表達[13]。既往研究報道，lncRNA ANRIL在多種癌癥如視網膜母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌中可作為癌基因發揮作用[14-15]，而miR-199a-5p在多種癌癥如胃癌、膀胱癌、宮頸癌中可作為抑癌基因發揮功能[16]。因此，基于lncRNA ANRIL和miR-199a-5p在癌癥中的作用，筆者推測lncRNA ANRIL/miR-199a-5p軸可能參與調控MM發展。本研究發現，lncRNA ANRIL在MM患者血漿中呈高表達，而miR-199a-5p在MM患者血漿中表達下調。生物信息學軟件預測ANRIL與miR-199a-5p之間存在結合位點。熒光素酶報告基因檢測和轉染實驗進一步表明，miR-199a-5p是lncRNA ANRIL直接作用的靶點，在U266細胞中miR-199a-5p表達水平受到lncRNA ANRIL的負調控。本研究揭示了lncRNA ANRIL和miR-199a-5p在MM細胞中的靶調控關系，但其具體作用機制還需進一步研究。

越來越多的證據表明，lncRNA在MM中通過與miRNA競爭性結合發揮作用。例如，在MM中，lncRNA OIP5-AS1通過與miR-410競爭性結合促進細胞增殖[17]。lncRNA CCAT1通過與miR-181a-5p競爭性結合抑制MM細胞增殖并促進細胞凋亡[18]。因此，揭示lncRNA ANRIL/miR-199a-5p的潛在機制對于了解MM的惡性增殖具有重要意義。為了深入研究lncRNA ANRIL/miR-199a-5p的作用機制，本研究中將lncRNA ANRIL下調質粒、miR-199a-5p抑制劑或lncRNA ANRIL過表達質粒與miR-199a-5p模擬物共轉染U266細胞，觀察其對細胞增殖和凋亡的影響。結果發現，抑制lncRNA ANRIL表達可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，而抑制miR-199a-5p表達則會得到相反的結果。lncRNA ANRIL過表達質粒協同miR-199a-5p模擬物共轉染進一步促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。雖然lncRNA ANRIL/miR-199a-5p軸在神經元損傷中的調節作用已被報道[19]，但鮮有其他報道證實lncRNA ANRIL/miR-199a-5p軸在調節MM惡性增殖中的作用，這將為MM治療及復發防治提供理論指導。HIF-1α作為轉錄因子HIF-1的一個亞基，在缺氧反應時可受到疾病特異性miRNA的調控。例如，miR-199a通過調控HIF-1α/血管內皮生長因子(VEGF)信號通路對非小細胞肺癌大鼠產生影響[20]。miR-200c下調HIF-1α并抑制肺癌細胞的遷移。miR-199a-5p是一種疾病特異性miRNA，調控腫瘤中多種惡性生物學行為。根據以往的報道，miR-199a-5p和miR-495在肺癌UPR通路中靶向調控GRP78[21]。此外，通過靶向HIF-1α-GSK3β-mPTP軸，下調miR-199a-5p可減弱心肌細胞缺氧/復氧誘導的細胞毒性[22]。然而，miR-199a-5p在MM中的具體作用機制尚不清楚。根據生物信息學軟件的預測，HIF-1α是miR-199a-5p的一個潛在靶點。因此，miR-199a-5p可能通過靶向調控HIF-1α在MM中發揮作用。本研究結果顯示，HIF-1α在MM患者的血漿中呈高表達。熒光素酶報告基因檢測和轉染實驗進一步表明，HIF-1α是miR-199a-5p的靶點，在U266細胞中HIF-1α表達受miR-199a-5p的負調控。因此，本研究在U266細胞中發現miR-199a-5p對HIF-1α的靶調控作用。此外，HIF-1α表達下調明顯抑制了U266細胞的增殖，表明HIF-1α對U266細胞增殖具有明顯的促進作用。

綜上所述，本研究結果證實了MM患者血漿lncRNA ANRIL和HIF-1α表達上調，而miR-199a-5p表達下調。此外，lncRNA ANRIL通過miR-199a-5p調控HIF-1α表達，影響細胞增殖和凋亡。這提示lncRNA ANRIL/miR-199a-5p/HIF-1α軸可能作為治療MM的潛在靶點。