散結消癭顆粒對實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠氧化應激的干預作用研究

張杰，余躍，俞璐，楊濤濤，胡靜波，李藝萱

自身免疫性甲狀腺炎（EAT）又稱橋本甲狀腺炎（HT），是以甲狀腺特異性自身抗體為特征的一種最常見的自身免疫性疾病[1]，屬中醫癭病范疇。散結消癭顆粒是依據明代陳實功《外科正宗》“海藻玉壺湯”，經臨床辨證施治加減而成的有效驗方，保留了原方中主要藥味（海藻、半夏、川芎、夏枯草），具有化痰軟堅、理氣散結的功效。前期試驗進行了散結消癭顆粒提取工藝的優化[2]和體外抗氧化評價，發現散結消癭顆粒能有效抑制大鼠肝勻漿自發性脂質過氧化和紅細胞溶血，對鐵離子有較好的還原能力及羥自由基清除能力[3]。為進一步探究散結消癭顆粒治療EAT的體內氧化/抗氧化平衡調控機制，本研究構建EAT大鼠模型，觀察散結消癭顆粒對NADPH氧化酶亞基p22phox、gp91phox基因和蛋白表達、超氧化物歧化酶（SOD）/丙二醛（MDA）水平的干預作用，以期闡明散結消癭顆粒治療EAT的潛在作用機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF級SD大鼠（200±10）g 32只，雌雄各半，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養及試驗均在寧波大學實驗動物中心（SYXK[浙]2019-0005）進行和完成。藥品：散結消癭顆粒（浸膏）制備[2]：海藻、半夏、夏枯草藥材按處方比例提取2次，第一次加水12倍量，第二次加水10倍量，提取時間均為1.5 h，濾過，合并濾液，濃縮，備用；川芎按處方比例乙醇回流提取，60%乙醇8倍量，提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，濃縮，與上述藥物濃縮液混合，并濃縮至含生藥材2.7 g/ml。試劑和來源：豬甲狀腺球蛋白（PTg，酷爾化學科技有限公司），完全弗氏佐劑（CFA，Sigma公司），不完全弗氏佐劑（IFA，Sigma公司），TgAb酶聯免疫試劑盒（Thermo公司），TPOAb酶聯免疫試劑盒（Thermo公司），Anti-Gp91phox抗體（Abcam公司），Anti-P22phox抗體（GeneTex公司），Anti-GAPDH抗體（Proteintech公司），HRP標記的山羊抗兔抗體（碧云天生物技術有限公司），MDA和SOD測定試劑盒（均為南京建成生物工程研究所有限公司），Trizol（Invitrogen公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有限公司），PVDF轉印膜（Millipore公司）。

1.2 實驗儀器 小型垂直電泳系統（Bio-Rad），多功能酶標（SpectraMax iD5），多樣品組織研磨儀（凈信，Tissuelyser-24），冷凍離心機（Eppendorf，5424R），超靈敏多功能成像儀（GE，Amersham Imager 680UV）。

1.3 方法

1.3.1 EAT大鼠模型的建立[4]32只大鼠適應性飼養1周后，除8只留作正常組外其余大鼠造模，PTg用0.9氯化鈉注射液溶解，含量為2 mg/ml，與CFA按體積比1∶1混合，乳化成油包水乳劑，每只大鼠100g乳化的PTg多點皮下注射進行初次免疫，上述PTg溶液與IFA按體積比1∶1混合后于第2周進行加強免疫，以后每周加強免疫1次，共加強免疫4次。

1.3.2 實驗動物分組和給藥 正常組給予蒸餾水10ml/kg；模型組給予蒸餾水10 ml/kg；SJXY低劑量組給予散結消癭顆粒浸膏（相當于1倍處方量）4.9 g/kg；SJXY高劑量組給予散結消癭顆粒浸膏（相當于8倍處方量）39.2 g/kg。以上各組大鼠均在相同條件下飼養，從造模完成的24 h后按照上述劑量給藥，連續給藥5周。

1.3.3 標本采集 于實驗末次給藥6 h后，所有大鼠麻醉后心臟取血，用于檢測血清SOD活性、MDA含量，然后處死大鼠，解剖并迅速取出甲狀腺，pH 7.4 PBS研磨制備組織勻漿液，用于檢測甲狀腺組織p22phox、gp91phox基因和蛋白表達。

1.3.4 血液指標檢測 大鼠心臟取血，按照試劑盒操作說明測定各組血清SOD活性和MDA含量。

1.3.5 RT-PCR按照試劑盒說明書提取各組大鼠甲狀腺組織總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列：gp91phox上游引物5’-ACAAGGTTTATGACGATGAGCCTA-3’，下游引物5’-CACTGGCAGCAAGATCAGCA-3’，p22phox上 游 引 物5’-CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3’，下 游 引 物5’-TCAATGGGAGTCCACTGCTCAC-3’。

1.3.6 Western blot取大鼠雙側部分甲狀腺組織，加入RIPA裂解液勻漿，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉PVDF膜后分別加Anti-Gp91phox抗體（1∶2000）和Anti-P22phox抗體（1∶1000），4℃孵育過夜，TBST漂洗3次、每次10 min，加入HRP標記二抗（1∶1 000）、室溫1 h，ECL顯影、曝光，ImageJ灰度分析。

1.4 統計方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TgAb、TPOAb水平比較 模型組TgAb、TPOAb水平均高于正常組（均＜0.01），SJXY低劑量、高劑量組TgAb、TPOAb水平均低于模型組（均＜0.05）。SJXY高劑量組與低劑量組相比，TgAb、TPOAb水平均呈下降趨勢（均＜0.05）。見表1。

表1 各實驗組TgAb、TPOAb水平比較

2.2 SOD及MDA水平比較 模型組SOD活性降低，MDA含量升高，SOD/MDA水平低于正常組（＜0.01），SJXY高劑量組與模型組相比，SOD活性升高，MDA含量降低，SOD/MDA水平升高（均＜0.05），而SJXY低劑量組與模型組相比，SOD活性升高，MDA含量降低，SOD/MDA水平差異無統計學意義（＞0.05）。見表2。

表2 各實驗組SOD/MDA水平比較

2.3 p22phox及gp91phox基因水平比較 模型組p22phox、gp91phox基因水平均高于正常組（均＜0.01）。SJXY低劑量、高劑量組p22phox、gp91phox基因水平均低于模型組（均＜0.05）。SJXY高劑量組與低劑量組相比，p22phox、gp91phox基因水平均呈下降趨勢（均＜0.05）。見表3。

表3 各實驗組p22phox、gp91phox基因水平比較

2.4 p22phox及gp91phox蛋白表達比較 模型組p22phox、gp91phox蛋白表達均高于正常組（均＜0.01）。SJXY低劑量、高劑量組p22phox、gp91phox蛋白表達均低于模型組（均＜0.05）。SJXY高劑量組與低劑量組相比，p22phox、gp91phox蛋白表達均呈下降趨勢。見圖1。

圖1 各實驗組p22phox、gp91phox蛋白表達結果

3 討論

EAT發病機制涉及體液免疫和細胞免疫，但導致甲狀腺組織破壞的具體機制目前仍未闡明[5]，氧化應激在EAT發病機制中起著重要作用。TgAb、TPOAb作為破壞性抗體，引起甲狀腺組織損傷，活化的B和T細胞對抗TgAb、TPOAb在EAT中的作用，并通過NADPH氧化酶產生過量的活性氧，過多的活性氧引起氧化應激，進一步損傷甲狀腺組織[6-7]。另一方面，EAT患者后期出現甲狀腺功能減退，甲狀腺激素分泌減少，使EAT患者的抗氧化酶（如SOD）活性降低，抗氧化能力減弱[8]。也有研究報道EAT患者中脂質過氧化程度增加，MDA含量增高[9]。本研究中以TgAb、TPOAb作為甲狀腺組織損傷的重要標志物[10]，用來判斷EAT造模是否成功，SOD/MDA比值變化用來評價機體氧化應激狀態[11]。本研究結果顯示模型組TgAb、TPOAb水平均升高，表明造模成功，模型組中SOD含量下降，MDA含量升高，SOD/MDA顯著降低；這提示EAT大鼠外周血中存在明顯的氧化/抗氧化失衡。給予SJXY低劑量、高劑量干預后，TgAb、TPOAb水平均降低，且SJXY高劑量給藥還能顯著提升SOD/MDA水平，表明散結消癭顆粒能改善EAT大鼠氧化應激狀態。

NADPH氧化酶是體內活性氧的主要來源，有同源物NOX1-5和DUOX1-2，被統稱為NOX家族，gp91phox、p22phox為其共同的亞基，DUOX1-2主要分布在甲狀腺中，參與甲狀腺激素的合成[12]。多項研究表明，上調NADPH氧化酶，產生過多的活性氧，引發氧化應激反應，不僅會造成甲狀腺損傷[7]，還與體內多種疾病的發生發展相關[13-14]。最近也有研究報道NOX4介導的活性氧釋放參與甲狀腺癌變過程[15-16]。那么下調NADPH氧化酶活性，減少活性氧釋放，很可能成為減輕氧化應激損傷的有效干預手段。本研究中發現模型組大鼠甲狀腺p22phox、gp91phox基因和蛋白表達均顯著升高，這表明EAT大鼠甲狀腺組織中NADPH氧化酶活性增高，SJXY低劑量、高劑量干預后，兩組中p22phox、gp91phox基因和蛋白表達均明顯降低；這表明散結消癭顆粒能下調NADPH氧化酶活性，減少過多的活性氧產生，提示對NADPH氧化酶的活性調控很可能是散結消癭顆粒發揮藥效的靶點所在。

綜上所述，EAT大鼠體內存在明顯的氧化應激紊亂，散結消癭顆粒能通過下調甲狀腺組織NADPH氧化酶亞基p22phox、gp91phox基因和蛋白表達，減少活性氧產生，增加SOD/MDA水平，提升抗氧化能力，同時降低TgAb和TPOAb水平，減少甲狀腺組織損傷，起到很好的治療作用。