蜂蜜中抗生素殘留的檢測方法研究進展

馬永強，張絲瑤，遇世友，王 鑫，黎晨晨

（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150028）

蜂蜜是蜜蜂從植物花蜜或蜜露中提取的一種可以應用于食品、藥品或化妝品的天然產品。蜂蜜中除含有糖類物質外，還富含多種營養成分，如蛋白質、礦物質、生物活性酶、氨基酸、維生素等。其不僅能夠起到調節機體生理機能、促進消化、潤腸通便等作用，還具有抗氧化性、抗菌性等多種藥理特性，對人體健康有諸多益處。隨著蜂產品逐漸受到人們的廣泛關注，其質量安全問題也得到了更多的重視。在養蜂過程中，蜜蜂若患有腐臭病或敗血病則會降低蜂蜜的產量和質量，因此，蜂農經常使用抗生素來預防和治療蜜蜂的疾病。

抗生素一般是指微生物或由高等動物、植物在生理代謝活動中產生的一種具有抗病原體等生物活性的次級代謝物。養蜂業中常用的抗生素包括四環素類、喹諾酮類、硝基咪唑類、磺胺類、氯霉素等。由于抗生素在蜜蜂內代謝不完全，使得在應用抗生素治療蜜蜂疾病的同時，也會影響蜂蜜的食品安全質量，并且會對人體造成過敏性反應、細菌耐藥性、菌群失調等危害。因此研究蜂蜜中抗生素殘留的快速、高效、靈敏的檢測方法具有重要的意義。

目前，色譜技術在檢測蜂蜜抗生素殘留方面應用較多，色譜法具有檢測范圍廣、靈敏度高、檢出率高等優點，但其儀器十分昂貴，檢測成本較高。為了提高檢測效率，降低檢測成本，近年來，在蜂蜜抗生素的殘留檢測領域，更多研究者關注于對高效液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法的改進，以及新型檢測方法的研發，例如傳感器法、免疫分析法等。本文介紹了蜂蜜中抗生素的殘留現狀及檢測方法，為蜂蜜中抗生素殘留的后續檢測研究提供理論參考。

1 蜂蜜中抗生素殘留現狀概述

1.1 四環素類

四環素類抗生素（Tetracyclines，TCs）是廣譜抗生素中應用較多的一類，包含四環素、土霉素、金霉素等多個種類。它可以治療因革蘭氏陽性和陰性細菌、螺旋體、立克次體等引起的疾病。因其治療效果強、吸收好、毒性低、價格低廉，在養蜂過程中，蜂農常用其治療蜜蜂幼蟲腐臭病。GB 31650-2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中規定了不同食品中土霉素、四環素、金霉素的最大殘留限量，其中肉為200 μg/kg，奶為100 μg/kg，蛋為400 μg/kg，而未對蜂蜜中四環素類有限量要求。有研究對2014～2020 年不同地區的近4 萬個蜂蜜樣品進行抽檢，檢測結果表明蜂蜜中TCs 檢出率雖逐年下降，但仍存在TCs 可檢出的樣品。TCs 經人體攝入后，殘留的藥物會沉積在骨骼及牙齒組織內導致牙齒變黃，另外，TCs 會富集在肝臟中對人體造成嚴重的危害，攝入量過大甚至會對食用者的生命安全造成威脅。因此，不僅需要加大對于蜂蜜中TCs 的檢測力度，還需要注重其檢測技術及檢出含量。

1.2 喹諾酮類

喹諾酮類抗生素（Quinolones，QNs）是一種被廣泛使用的合成廣譜抗生素，包括諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星等。它通過破壞拓撲異構酶IV 和DNA 回旋酶來抑制細菌DNA 復制，從而快速殺滅厭氧菌、分枝桿菌等細菌。QNs 因具有良好的吸收效果及廣譜抗菌活性被應用于蜜蜂疾病的治療。當殘留在蜂蜜中的 QNs 被人體攝入后，對腸道、中樞神經系統、泌尿系統和肝腎等會產生危害及毒性。根據NY/T 5030-2016《無公害農產品獸藥使用準則》規定，諾氟沙星、氧氟沙星為不得使用的藥物。但蜂蜜中喹諾酮類抗生素殘留檢出及超標情況也時有發生，有研究對不同種類、不同品牌的50 種蜂蜜進行檢測，其中有3 種蜂蜜檢出諾氟沙星。2019 年廣東省市場監督管理局對蜂蜜樣品進行抽檢，結果顯示有5 個批次的蜂蜜均檢測出QNs 殘留。

1.3 硝基咪唑類

硝基咪唑類抗生素（Nitromidazoles，NMZs）是對分枝桿菌、厭氧菌等多種生物具備廣譜抗菌活性的硝基雜環化合物。硝基咪唑類抗生素具有致畸、致癌、致突變作用，根據 GB 31650-2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》以及NY/T 5030-2016《無公害農產品獸藥使用準則》可知，甲硝唑、地美硝唑允許做治療用，但不得在動物性食品中檢出。但仍有部分蜂農為了預防和治療蜜蜂孢子蟲病和阿米巴蟲病違法使用甲硝唑、地美硝唑等硝基咪唑類物質。有研究分別對江蘇省162 份蜂蜜樣品以及山東省170 份蜂蜜樣品中甲硝唑的殘留情況進行液相色譜串聯質譜法測定，結果表明，蜂蜜中仍然存在甲硝唑殘留的情況，檢出范圍分別達到1.15～18.80 μg/kg、N.D.～60.20 μg/kg。雖然NMZs 在動物體內代謝迅速，但其代謝產物仍具有危害健康的潛能。若在食物中存在過多藥物殘留，不僅會造成食品安全隱患，還會危害人體自身健康。

1.4 磺胺類

磺胺類抗生素（sulfonamides，SAs）是相對穩定的一類人工合成的廣譜抑菌劑，在蜜蜂養殖過程中可用于防治蜜蜂感染美國菌病、歐洲菌病等。例如磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺吡啶等物質具有較強的毒性，若食用含有過量磺胺類抗生素的蜂蜜，會造成人體免疫力降低、影響骨髓造血功能、損害泌尿系統、損壞腎臟等危害。根據GB 31650-2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》可知，磺胺類物質在蜂蜜中的最大殘留限量為100 ug/kg。有研究對浙江省125 批次的蜂蜜樣品進行抽樣檢測，其中有21 種蜂蜜樣品檢出磺胺類抗生素殘留，檢出率達1.6%。還有研究者通過其建立的高效液相色譜法對8 種蜂蜜樣品進行檢測，發現其中1 份蜂蜜樣品磺胺類抗生素殘留量達到1.03 mg/kg，說明目前存在SAs 超標的問題。該類物質在人體內代謝進程緩慢，如在蜂蜜中殘留過量，其帶來的毒理風險對蜂產品消費者是一種潛在的危害。

1.5 氯霉素

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一種具有優良抑菌性能的廣譜抗生素，因其價格低廉且對治療動物因革蘭氏陽性和革蘭氏陰性球菌而感染的疾病有良好的效果而被廣泛應用。但由于CAP 對人體健康存在一定危害，長期服用或者過量服用氯霉素會造成再生障礙性貧血、灰嬰綜合癥、粒狀白細胞缺乏等問題。2002 年歐盟在我國進口的蜂蜜中檢出氯霉素并且暫停了中國出產的蜂蜜進入到歐盟市場，雖然在2004 年歐盟解除了對中國蜂蜜進口的禁令，但這一事件不僅對我國造成了一定的經濟損失，還嚴重影響了我國蜂蜜行業的國際聲譽。自此我國加大了對蜂蜜中氯霉素的檢測和監察力度，2015～2018 年國家食品安全監督抽檢了不同產地、不同生產企業的蜂蜜，在抽檢的2279 批次蜂蜜中，檢出不合格樣品為41 批次，其中氯霉素抽檢不合格達27 批次，其檢出范圍為0.20～2.08 μg/kg，根據NY/T 5030-2016《無公害農產品獸藥使用準則》可知，氯霉素為食品動物禁用及動物性食品中不得檢出的獸藥，抽檢結果說明蜂蜜中CAP 超標的現象仍然存在，對于其檢測監察還要引起高度重視。

2 蜂蜜中抗生物殘留的檢測方法

2.1 色譜法

目前，國標中對于蜂蜜殘留的四環素類、喹諾酮類、硝基咪唑類等抗生素均有色譜檢測方法，但每種國標方法只針對于一類抗生素進行檢測，研究者通過在國標方法的基礎上進行改進，從而達到同時檢測蜂蜜中多種抗生素殘留的目的。

2.1.1 高效液相色譜法 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）利用高壓輸液系統，使有機溶劑等液體流動相通過裝置泵進入帶有固定相的色譜柱當中，待柱中的各成分分離出來，而后檢測器對其進行檢測分析。HPLC 檢測范圍較廣，靈敏度、檢出率均較高。

魏貞貞等通過在蜂蜜樣品中加入酸與甲醇溶液配成的萃取液提取抗生素，經離心、過膜后再加入內標物，以甲醇和草酸為液體流動相，采用C色譜柱進行分離，通過帶有紫外二級陣列檢測器的高效液相色譜儀進行檢測。結果表明四環素、土霉素、甲硝唑三種抗生素的檢出限為0.07～0.08 μg/g，以10、20、50 μg/g 3 個添加水平做加標回收試驗，其樣品回收率為82.4%～93.7%，RSD＜3.5%。此方法對于三種抗生素的回收率及分離效果均較好，但抗生素萃取液的pH 以及添加量都會對提取效果產生影響，并且該方法同時檢測的抗生素種類也相對較少。盧坤等以乙腈和磷酸水溶液為流動相，通過PCX 固相萃取小柱對蜂蜜中抗生素進行提取，通過C色譜柱及雙波長紫外檢測模式對蜂蜜中15 種抗生素殘留進行同時檢測。研究結果顯示在0.2～20.0 mg/L 范圍內被檢測的15 種抗生素線性關系良好，檢出限為9.70～12.54 μg/kg，分別添加0.05、0.20、0.50 mg/kg 3 個水平進行加標回收試驗，樣品回收率可達60%～105%，RSD＜7.0%。利用固相萃取小柱可以代替步驟繁雜的液液萃取方法，并且在去除干擾物質的同時對抗生素的提取效率也較高。該方法可以實現對多種抗生素進行同時測定且分離能力較好，可適用于殘留抗生素種類繁多的樣品檢測中。

液相色譜的優勢在于其高效的分離能力，但物質的結構特征難以確定，在樣品檢測中可能出現假陽性現象。對于蜂蜜這種基質復雜的物質進行檢測時，一般需要借助質譜技術對目標物進行定性，從而更加有效地分析抗生素殘留情況。

2.1.2 高效液相色譜串聯質譜法 高效液相色譜串聯質譜法（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）是利用液相色譜對待測組分進行分離，再通過質譜進行檢測，其結合了色譜的高分離性能及質譜的定性功能，將兩者的優勢形成互補，進而提高了檢測結果的準確性。同時，液質聯用法在很大程度上能夠降低檢測過程中的干擾因素，增強其分離能力，從而提高檢測的靈敏度。

張中印等以甲酸銨、甲酸復合溶液和甲醇作為流動相，利用目前應用較多的QuEChERS（Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,and Safe）前處理方法，選用N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C）作為吸附劑對蜂蜜進行處理，采用C色譜柱進行分離，通過HPLC-MS/MS 對蜂蜜中14 種喹諾酮類物質含量進行測定。實驗結果顯示，在動態多反應監測模式下，對于14 種抗生素的檢測均具有較高的選擇性，不同蜂蜜樣品中的抗生素平均基質效應在-75.0%～29.2%之間，且該方法不存在殘留效應，其檢測限為0.45～2.58 ng/g，定量限（LOQ）為1.51～8.59 ng/g，分別以14 種抗生素的LOQ、3 倍LOQ及10 倍LOQ 為3 個水平添加量做加標回收實驗，回收率可達81.2%～108.3%。蜂蜜的樣品前處理會影響檢測中的基質效應，從而會對檢測結果造成一定影響。QuEChERS 方法是近年來應用較多的一種前處理技術，它具有價格低廉、處理快速、簡便等優點，其一般選擇PSA 及C18 等傳統吸附劑對樣品進行前處理，基于對QuEChERS 方法的改進，Xu 等選擇氧化鋅（ZnO）作為蜂蜜樣品前處理的吸附劑來降低基質帶來的干擾，利用液質聯用法檢測蜂蜜樣品中林可酰胺類和大環內酯類15 種抗生素的殘留。研究顯示，ZnO 比傳統吸附劑的吸附性能更好，檢測限為0.24～0.68 μg/kg，定量限為0.80～2.27 μg/kg，以5.0、10.0、20.0 μg/kg 3 個水平做加標回收試驗，其回收率為81.3%～99.0%，RSD＜9.18%，并且將本實驗的研究方法應用到實際蜂蜜檢測中發現有林可霉素殘留。該方法利用氧化鋅這種新型吸附劑替代傳統吸附劑對蜂蜜樣品進行前處理，其對抗生素檢測限及精密度方面表現出更加良好的性能。在液質聯用方法的基礎上，Baeza 等采用分子印跡聚合物（MISPE）與液質法相結合的方式來識別和定量蜂蜜中6 種磺胺類抗生素，研究以磺胺喹惡啉為模板合成了磺胺類分子印跡聚合物，并將其裝入固相萃取空柱中，制備出磺胺類分子印跡固相萃取柱，通過其對蜂蜜中的抗生素進行提取。以乙腈、甲酸水溶液為流動相，采用HR-ODS 色譜柱進行分離，研究結果表明，在1、10、20 μg/kg 3 個添加水平下其加標回收率在84.3%～104.7%之間，檢測限可達0.1～4.2 μg/kg，定量限為0.2～4.4 μg/kg，RSD＜11.6%。傳統的固相萃取柱一般以硅膠等為填料，對目標抗生素無法進行特異性識別，而此方法的分子印跡聚合物能夠有選擇性的識別目標抗生素，其檢測限較低，準確度及精密度較好。

蜂蜜中抗生素殘留的濃度通常處于微量水平，其對于檢測技術的要求也較高。目前，HPLCMS/MS 大多采用多反應監測模式檢測抗生素，因為其僅采集特定的子離子質譜信號，基質干擾被大幅度降低，在對蜂蜜中抗生素進行檢測時，相比于高效液相色譜法，其檢測的靈敏度、準確度也較高，但質譜儀器價格昂貴，對于流動相要求嚴格，因此在廣泛應用方面還存在一定阻礙。

2.2 傳感器法

2.2.1 納米材料電化學傳感器 納米材料因具備許多的物理化學特性且擁有巨大的發展潛力和經濟影響，在工業、農業等各個領域受到了廣泛的關注。金屬基無機納米材料包括納米金屬元素和納米金屬氧化物等，由于其具有優良的電子傳輸能力，因此經常被用于食品檢測、醫藥等許多領域中。碳基納米材料由于其化學穩定性較好、機械強度高等特點也得到了廣泛應用。

金屬納米粒子導電性強，但通常需要用特定的載體材料進行固定來提高自身的穩定性，而碳基納米材料導電性能較弱但穩定性優異，是構建納米復合材料的理想載體，目前，對于金屬與碳基納米材料進行復合應用的研究越來越多。Mani 等利用二硫化鉬納米片（MoS）及多壁碳納米管（f-MWCNTs），通過水熱合成法制備了MoS/f-MWCNTs 納米復合材料，再將其滴涂在玻碳電極表面，利用構建的電化學傳感器檢測氯霉素。結果顯示，納米復合膜修飾電極在0.08～1392 μmol/L 濃度范圍內與氯霉素呈線性響應，檢測限為0.015 μmol/L。將其應用于蜂蜜中氯霉素的檢測，將蜂蜜溶于磷酸緩沖液后分別加入適量5 及10 μmol/L 的CAP 標準樣品，經旋渦、離心、過濾后進行檢測，其回收率可達96.2%～97.0%。該方法選用的MoS/fMWCNTs 納米復合材料具有良好的電化學性能，經過復合材料修飾后的電極對氯霉素能夠起到優良的電催化效應，并且具備應用于蜂蜜中抗生素檢測的可行性。Yi 等將鈀納米顆粒（Pd NPs）與氧化石墨烯（RGO）進行復合（如圖1），利用RGO/Pd NPs 納米復合材料修飾玻碳電極（GCE）檢測氯霉素并將其應用于蜂蜜樣品的檢測。研究結果表明其檢測限為0.05 μmol/L，檢測靈敏度高。并且實驗在同一電極連續測量10 次CAP 的過程中峰值電流變化較小，相對標準偏差較低，證明RGO/Pd NPs/GCE 具有較好的重復性。在對蜂蜜樣品的檢測中，利用磷酸緩沖溶液適當稀釋蜂蜜樣品，再分別加入0.2、0.5、0.8 μmol/L 的CAP 進行檢測，其回收率為87.0%～97.0%，RSD＜4.1%。該研究的材料制備過程簡單快速，構建的電化學傳感器具有良好的準確性和精密度，金屬材料與碳基納米材料的結合使用提高了該傳感器的導電性能及催化性能。

圖1 RGO/Pd NPs 納米復合材料的合成過程示意圖[50]Fig.1 Schematic diagram of synthetic procedures of RGO/PdNPs nanocomposite[50]

將金屬與碳基納米材料進行復合構建電化學傳感器是一種改善電導率和電化學穩定性的高效途徑。大多數蜂蜜中抗生素的殘留量較小，對于傳感器的檢測限要求較高，通過制備不同類型的納米復合材料，構建出操作簡單、檢測靈敏的電化學傳感器應用于蜂蜜中抗生素的檢測是未來的研究重點之一，并且納米材料之間會產生某種協同作用，對于其相互作用的過程目前并沒有完全深入研究，因此在納米材料電化學傳感器方面的研究還需進一步加深。

2.2.2 分子印跡聚合物電化學傳感器 分子印跡聚合物（MIPs）是一種仿生合成的材料，能夠選擇性地附著到目標分子上，將MIPs 組裝到電極表面制備而得的傳感器即為分子印跡聚合物電化學傳感器。MIPs 不僅制備過程簡單、價格相對較低，并且對于其目標分子具有高度選擇性，在檢測、定量等方面具有突出的特性。分子印跡聚合物電化學傳感器響應速度快且檢測靈敏度高，因此可以應用于蜂蜜中抗生素殘留的檢測。

MIPs 大多不具備導電性，將MIPs 和量子點結合應用到傳感器的制備可實現信號傳遞，提高傳感器的檢測靈敏度。Chullasat 等將分子印跡聚合物包覆在量子點（MIP-QDs）上，采用MIP-QDs 作為探針測定阿莫西林的含量并應用于蜂蜜樣品的測定。結果顯示隨著阿莫西林濃度的增加，其發光強度降低，其檢測限和定量限分別為0.14 和0.46 μg/L。并且采用MIP-QDs 和HPLC 法對提取的樣品溶液進行分析對比，實驗表明其建立的方法與高效液相色譜法一致，可用于食品中微量阿莫西林的測定。將本研究建立的方法用于檢測蜂蜜樣品，在蜂蜜中添加1.0、10、20、50 μg/L 4 種不同濃度的阿莫西林，其回收率為86%～98.5%，RSD＜4.8%。張慧潔等以CAP為模板分子，以沉淀法制備CAP 分子印跡聚合物（CAP-MIPs），將摻雜氮硫的碳量子點與MIPs 相結合，采用熒光分析法考察0.001～60 μmol/L 濃度的CAP 對分子印跡聚合物的熒光猝滅作用，隨著 CAP濃度遞增，其熒光強度逐漸降低，結果顯示其方法檢出限為6×10μmol/L。在對蜂蜜樣品進行檢測時，在蜂蜜中加入甲醇，經渦旋、超聲、離心后取上清液加入磷酸緩沖溶液，分別加入1.0、3.0、5.0 μg/g的CAP 進行熒光光譜分析，結果表明其加標回收率為90.0%～98.2%，RSD＜5.1%。二者的研究表明將MIPs 與量子點相結合作為一種光致發光探針用于熒光光譜法分析，其操作簡單、設備成本低，將其結合使用制備得到的傳感器可用于選擇性測定蜂蜜中的抗生素含量。Bougrini 等以四環素（TC）為模板分子，利用修飾 p-氨基巰基酚的金納米顆粒作為載體，電聚合制備了一種用于檢測蜂蜜中四環素的分子印跡傳感器（如圖2）。實驗以鐵氰酸鹽為氧化還原探針，用線性掃描伏安法對電化學傳感器進行了表征，研究表明該傳感器的線性范圍為2.24×10～22.4 nmol/L，檢出限為2.2×10nmol/L。利用該方法測定蜂蜜樣品中四環素的含量，分別添加8.65、11.65 mol/L 的四環素標準品溶液，其加標回收率為101.8%～106.0%，RSD＜8.3%。該研究將納米顆粒與MIPs 進行結合，通過改進MIPs 的制備提高了傳感器的導電性及催化活性，對蜂蜜樣品中四環素進行測定時，其檢測靈敏度也有所提高。

圖2 基于金納米粒子的四環素分子印跡傳感器示意圖[62]Fig.2 Schematic diagram of tetracycline molecularly imprinted sensor based on AuNPs[62]

分子印跡聚合物因其高效、準確、能有效分離復雜樣品組分和成本低的特點在食品檢測分析領域不斷擴展應用。未來還需不斷改進制備MIPs 的技術手段，完善MIPs 的選擇性識別理論體系，使其在蜂蜜中抗生素殘留檢測方面發揮重要作用。

2.2.3 核酸適配體傳感器 核酸適配體（aptamer，Apt）是由單鏈DNA、寡核苷酸RNA 或短肽組成的配體，其穩定的三維結構能夠特異性地識別靶標，它們在附著方式上類似于不同類型的抗體，核酸適配體傳感器是將二者的識別和結合作用轉化為光學、電化學等檢測信號，利用其可以直接識別和捕獲目標，從而建立靈敏、快捷的檢測方法，適用于蜂蜜樣品快速、小型的現場檢測。

核酸適配體和納米材料的復合應用因能放大響應信號、顯著提高檢測精準度而受到越來越多的關注。唐亞利通過構建出基于氧化石墨烯-核酸適配體傳感器用于檢測蜂蜜中四環素的殘留。將一定量的核酸適配體溶液與氧化石墨烯混合，通過加入不同濃度的四環素進行孵育、離心，取上清液測定其吸光度值。結果顯示，該傳感器的四環素檢測限為1.0×10ng/mL，線性范圍為0.002～20 ng/mL。在對蜂蜜樣品進行檢測時，在蜂蜜中分別加入0.001、0.01、0.1 mg/kg 3 個水平的四環素標準品，再通過添加Mcllvaine 緩沖溶液、三氯乙酸去除樣品中的金屬離子，經渦旋、離心、稀釋后測定其樣品回收率達82.5%～117%。Liu 等制備了基于石墨烯-三維結構納米金復合材料（GR-3D Au）和核酸適配體-Au NPs-辣根過氧化物酶納米探針構建了一種用于檢測土霉素（OTC）的電化學核酸適配體傳感器（如圖3），并利用該傳感器對蜂蜜中的OTC 進行檢測，結果顯示，該傳感器的檢測限可達4.98×10g/L。二者的研究表明，在蜂蜜樣品的檢測中，所構建的核酸適配體傳感器通過傳遞出可定量處理的光、電信號使其能夠對蜂蜜中抗生素殘留進行快速分析檢測，并且檢測的成本較低、靈敏度較高。

圖3 用于土霉素檢測的核酸適配體傳感器示意圖[69]Fig.3 Schematic of the aptasensor for the detection of OTC[69]

核酸適配體與抗體相比具有穩定性好、生物相容性好、易于合成、價格便宜且標記相對容易等優點。核酸適配體可以被應用于蜂蜜樣品中抗生素的檢測，但是核酸適配體傳感器易受到蜂蜜中其他基質的干擾，對于如何避免物質所帶來的干擾和保持傳感器的穩定性、靈敏度等問題還需要進一步研究。

2.2.4 免疫傳感器 免疫傳感器是一種基于抗原分子識別的傳感器。由于抗體和特定物質或相應抗原的特異性結合使免疫傳感器具備了獨特的選擇性和較高的靈敏度。隨著傳感器技術的快速發展，為了改善免疫傳感器的檢測性能，提高其傳感效率，有研究將納米材料與免疫傳感器相結合使用，使其在食品檢測領域逐漸得到了更多研究者的認可。

Cervera 等開發了一種基于高頻石英晶體微天平（HFF-QCMD）技術的壓電免疫傳感器，實驗使用100 MHz 石英作為傳感器，利用特異性單克隆抗體作為生物識別元件檢測蜂蜜中磺胺噻唑的殘留。通過Strata-X SPE 聚合物固相萃取柱對蜂蜜樣品進行前處理，再利用構建的免疫傳感器進行檢測，研究結果顯示，該傳感器的檢測限為0.10 μg/kg，定量限為2 μg/kg。在蜂蜜中加入10、50、100 μg/kg 3 個水平的磺胺噻唑樣品做加標回收試驗，其樣品回收率可達100%～113%，該方法的檢測限比其他報道的蜂蜜磺胺噻唑檢測方法低40～50 倍，蜂蜜預處理高效、快速、簡單。Nadia 等研發了一種基于金微電極修飾的生物微電子機械系統（Bio-MEMS）的免疫傳感器檢測蜂蜜中四環素，由于利用納米粒子的表面修飾使其靈敏度得到了提高，且在樣品預處理時不需要任何復雜的步驟。結果顯示其檢測限為1.2 pg/mL。根據以上研究表明，免疫傳感器是一種新穎、小型化且成本較低的檢測設備，其能夠檢測到蜂蜜中低水平的抗生素殘留，并且對于蜂蜜樣品的前處理沒有過多復雜的要求，非常有利于大量蜂蜜樣品的快速、便捷檢測。

對比常規檢測手段，免疫傳感器具備簡便、快速高效、靈敏度高等優點。但目前免疫傳感器還沒有成為食品檢測的主要應用技術，未來提高傳感器的重現性和穩定性是一個重要的研究方向。

2.3 免疫分析法

免疫分析法是利用放射性同位素、酶、熒光或其它物質作為標記劑，基于特異性抗原與抗體相互作用催化底物發生顯色反應的分析方法。常用于檢測蜂蜜中抗生素殘留的方法為酶聯免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）和側流免疫層析法（lateral flow immunoassay，LFIA）。

ELISA 是選擇用酶對抗體進行標記，根據顯色程度來定量檢測抗生素，其可在復雜的樣品基質中選擇性檢測微量物質。Kumar 等采用競爭酶聯免疫吸附法檢測蜂蜜樣品中的CAP 殘留，將蜂蜜樣品溶于NaEDTA-MclIvaine 緩沖液，利用HLB 固相萃取小柱提取抗生素。使用微孔板分光光度計在450 nm 波長測量其吸光度，結果顯示該方法檢測限為0.05 ng/g，分別添加1、2、4 ng/g 3 個水平的CAP標準品，其加標回收率為77.3%～83.1%，RSD＜1.3%。Wu 等通過制備CAP 特異性抗體建立了靈敏的直接競爭酶聯免疫吸附法（dcELISA）和金納米顆粒免疫層析條（immunostrip）兩種方法檢測蜂蜜中的CAP。將不同濃度的CAP 溶液添加到蜂蜜樣品中，加入磷酸緩沖溶液后離心、提取上清液，再用含有吐溫-20 和牛血清白蛋白的磷酸緩沖液進行稀釋，用于后續蜂蜜樣品的檢測。在dcELISA 中，其對CAP 的檢出限為0.15 ng/mL，在蜂蜜樣品中添加0.25～100 ng/g的CAP 樣品，其回收率為71.9%～94.7%。免疫條檢測CAP 的機理如圖4 所示，將免疫條插入樣品孔中，當CAP 含量超過0.5 ng/mL 時，免疫條上會消失一條紅色檢測線，即定義為免疫條的視覺檢測限為0.5 ng/mL。研究結果表明，ELISA 法和免疫層析條檢測方法均可以應用到蜂蜜中CAP 的檢測。但免疫層析條方法主要依靠于檢測限的顯色且采用人眼觀察判定，但人眼視覺判別具有一定的誤差性，該方法更適用于蜂蜜的定性檢測。ELISA 法較依賴于溫度控制裝置且只能提供定量檢測，為了避免此種方法的使用弊端，有研究對LFIA 進行了應用分析。LFIA 利用磁性納米顆粒、發光納米顆粒等標記抗原或抗體，根據檢測限區域的信號顏色變化及信號強度查看檢測結果。Li 等通過簡單的樣品制備策略、基于LFIA 條帶和手持傳感器讀取器建立了一種蜂蜜抗生素殘留檢測系統。利用與抗生素單克隆抗體偶聯的量子點微球探針，LFIA 條帶可同時檢測磺胺類藥物和四環素類藥物，手持式傳感器讀取器可以自動進行圖像記錄、熒光信號提取和抗生素定量，該方法的檢出限為0.4 μg/kg，其靈敏度高，且特異性較好。

圖4 用于氯霉素檢測的免疫層析條示意圖[80]Fig.4 Schematic diagram of immunochromatographic strip for chloramphenicol detection[80]

免疫分析法具備檢測成本低、效率高、靈敏度好且操作簡便等優點。但由于其基于一類化合物的共同基團發生免疫反應的原理，使得此方法不能對每種化合物分別檢測并定量，并且若蜂蜜中的抗生素沒有相對應的抗原，則不能進行檢測，其應用具有一定的局限性。

3 結論與展望

本文對蜂蜜中抗生素的殘留現狀及檢測方法進行了綜述，就檢測方法而言，色譜法目前應用較為廣泛，并且有許多研究者通過對液質聯用技術的檢測條件進行改善，使其可以實現對蜂蜜中多種類抗生素的同時檢測，但該方法設備昂貴，目前無法實現對蜂蜜檢測的普遍應用。免疫分析法成本較低且操作簡便，但該方法依賴于特定的抗原，若沒有對應抗原則無法進行檢測，因此在一定程度上限制了其使用。傳感器法檢測的靈敏度高、檢測成本較低，并且其設備型號小，增加了使用的便攜性，可用于實現蜂蜜的現場快速檢測。傳感器法是目前檢測和定量蜂蜜中抗生素殘留的有前途的方法之一，其中電化學傳感器可以達到快速響應和高靈敏度的檢測效果，具有良好的發展前景。因此，在保持其檢測靈敏度和準確度的基礎上，開發電導率和催化活性更好的電極材料、優化樣品的前處理方法、提高檢測效率是今后的研究重點之一。未來還要通過不斷改進檢測技術、開發新型檢測方法來提高蜂蜜中抗生素殘留的定性定量分析水平，建立更加完善、簡單、靈敏的檢測方法。